導語：如何才能寫好一篇打印合同，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公文云整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

乙方（承租方）

雙方于____年__月__日，就出租打印機設備一事，經雙方協商簽訂合同如下：

一、甲方將_____打印機___臺出租給乙方使用，租期為____年（從___年 ___月___日至___年___月___日止）甲方收取乙方打印機押金____元，合同期滿后將其押金無息退還給乙方。

二、在租賃期間甲方免費負責打印機的維修和保養(yǎng)，所需零配件及耗材都由甲方負責，打印紙張由乙方自行負責。

三、收費標準：每月最低基本租金為人民幣____元，即可免費打印___張，超出部份每張按____元計算。

四、每月__日為抄表結算日，抄表結算后__日內付款，若乙方不按時付款，甲方有權收機器，并從押金中扣除應收租金及第九條所述違約金后，退回余款。

五、在租賃期間打印機出現故障，甲方應在接到乙方通知后工作時間3小時內到達現場進行維修，乙方不可以召喚甲方之外的其它單位維修。未經文秘站:甲方同意乙方不準私自移機及拆動，乙方在使用過程中因使用或保管不當致使打印機的損壞由乙方承擔責任。

六、在租賃期間如果乙方遺失打印機，乙方必須賠償人民幣___元整（￥___）給甲方。

七、在租賃期間如甲、乙雙方任何一方要求終止合同，要求方必須提前一個月以書面方式通知另一方，并且要求方無條件賠償500元給對方。

八、在合同期滿后，乙方應將打印機及附件退還給甲方。合同到期后壹個月內，甲、乙雙方未提出解約，則視為雙方自動延長此合同相同租期，雙方不用再簽任何合同，本合同具有同等租期和同等法律效力。

九、本合同一式兩份，甲、乙雙方各執(zhí)一份，經甲、乙雙方代表簽字、蓋章且打印機到位后立即生效。本合同生效后，若雙方任何一方有違約行為，應由違約方賠償人民幣伍佰元（￥500.00）給對方。

十、本臺打印機起始計數器讀為：_______.

十一、本合同未盡事宜，經雙方協商一致，可簽訂補充條款，補充部分作為合同的附件，與本合同具有同等法律效力。

甲方：

乙方：

代表：

代表：

日期：

日期：

地址：

地址：

電話：

篇2

租房協議合同范本一甲方(出租方)

乙方(承租方)

甲、乙雙方就租用甲方房屋一事：經甲、乙雙方友好協商，達成以下協議：

一、甲方將其歸屬所有權的，面積平方米，租給乙方使用。

二、乙方的租期從起至日止。為期年。

三、租金現金支付，每月租金，乙方一次性支付一年租金元。

四、甲方須向乙方出示房屋的正本房產證和有關證明。

五、乙方需承擔租用期間住房的一切管理費用，其中包括小區(qū)管理費，電視收視費，水、電、煤氣費和電話費等。

六、乙方在租房期間必須愛護好房屋設施，如有損壞，乙方負責賠償或修理完善，若乙方需裝修或改變房屋結構，需經甲方同意。合約期滿按米修去丟原則辦理

七、乙方在租房期內，不得將租房作違法經營場所。一經發(fā)現，除按法律制裁外，甲方有權收回房屋，所剩租金不退。

八、乙方在租房期間未經甲方同意不得將房屋轉租他人，如未經甲方同意轉租，此協議無效，安全責任由乙方自負。

九、如租期滿，乙方需繼續(xù)租用，須提前一個月與甲方交涉說明，并提前交清下年租金，如乙方不再續(xù)租交清租房期間的所有費用，退還甲方鑰匙并結清相關手續(xù)給甲方或中介方;如不按此辦理責任由乙方承擔，甲方和中介方有權在租房期滿五天后打開房屋另行出租或使用。

本協議一式兩份，經雙方代表簽字后生效，具有法律效力，雙方必須共同遵守。

甲方(租賃人) 身份證號： 聯系電話：

乙方(承租人) 身份證號： 聯系電話：

簽約時間：年 月 日

租房協議合同范本二出租方： (以下簡稱甲方)________________________

承租方： (以下簡稱乙方)________________________

甲乙雙方經友好協商，乙方為在開發(fā)區(qū)設立 公司而租用甲方房屋，并就此租宜達成如下協議：

一、甲方同意供給乙方經營用房 平方米，用于該公司經營之用，該房屋坐落于

二、該房屋租金經雙方商定為每月 元。該房屋總租金為 元。

三、租金于 交付，每延遲一天按總租金的 計罰。若 天內仍未交納，甲方有權收回該房屋，并按實際遲付天數依上述計罰比例向乙方收取罰金。

四、乙方同意預交 元作為金，時，當作房租沖抵。

五、租賃期限為 ，從 年 月 日至 年 月 日。在此期間，任何一方要求終止合同，須提前三個月通知對方，并償付對方總租金 的;如果甲方轉讓該房屋，乙方有優(yōu)先購買權。

六、因租用該房屋所發(fā)生的除土地費、大修費以外的其它費用，由乙方承擔。

七、在承租期間，未經甲方同意，乙方無權轉租或轉借該房屋;不得改變房屋結構及其用途，由于乙方人為原因造成該房屋及其配套設施損壞的，由乙方承擔賠償責任。

八、甲方保證該房屋無糾紛;乙方因經營需要，要求甲方提供證明或其它有關證明材料的，甲方應予以協助。

九、就本合同發(fā)生糾紛，雙方協商解決，協商不成，任何一方均有權向開發(fā)區(qū)人民法院提起訴訟，請求司法解決。

十、本合同未盡事宜，可由雙方協商簽訂補充協議，經公證后與本合同具有同等法律效力。

十一、本合同以雙方共同認可并經公證后生效。

甲方(簽章)：________________________ 乙方(簽章)：_______________________

篇3

關鍵詞：自動化 打印 合同管理

中圖分類號：TP311 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2017）02（a）-0108-02

目前物資合同統(tǒng)簽統(tǒng)付在全國已經鋪展，物資合同簽訂總量逐年遞增[1]。隨著2015年5月物資子系統(tǒng)的上線，優(yōu)化著力方向在于電子合同的制定效率，而占據簽約工作較大部分的書面簽約部分仍然依靠大量的手工操作，經多重界面跳轉打開打印，效率低下，無法與逐步優(yōu)化的系統(tǒng)同步配套，仍然影響整體工作效率。為了進一步提升整體的工作效率，在物資合同統(tǒng)簽統(tǒng)付典型模式的大背景下，借助系統(tǒng)智能化、流程規(guī)范化調整的契機，提升電子合同簽訂的規(guī)范性與智能化。

1 項目管理系統(tǒng)簡介

項目管理系統(tǒng)是一款基于Html、CSS、Java等語言開發(fā)的C/S模式的合同在線管理系統(tǒng)。它包括了合同管理、功能設置、字典管理3大功能模塊。其中合同審核包括初始化、合同上傳、查詢、導出合同、合同審核、合同分類、批量打印、合同刪除等功能；功能設置主要包括打印機設置、修改密碼、用戶注冊等功能；字典管理模塊包括全局數據設置、客戶管理、客戶數據導入、用戶管理等功能。

2 合同導入模板設計

合同管理模塊中的合同導入是以SQL標準模板為基準的。該SQL模板具有的標題列有唯一ID、付款方編號、付款方名稱、收款方名稱、合同日期、更改日期、合同內容、備注、行業(yè)代碼、合同代碼、合同號碼等。具體設計代碼如下。

DROP TABLE IF EXISTS `tpt_contact_tabel`；

CREATE TABLE `tpt_contact_tabel` （

`tpt_id` int（32） NOT NULL，

`tpt_payer_code` varchar（255） NOT NULL，

`tpt_payee_name` varchar（32） NOT NULL，

`tpt_contact_cretime` datetime NOT NULL，

`tpt_contact_upttime` datetime NOT NULL，

`tpt_contact_content` varchar（255） NOT NULL，

`tpt_remark` varchar（255） DEFAULT NULL，

`tpt_industry_code` varchar（255） NOT NULL，

`tpt_contact_code` varchar（255） NOT NULL，

…………

PRIMARY KEY （`tpt_id`，`tpt_contact_code`）

）；

按照這個模板設置的SQL數據表，通過合同管理的合同導入功能，在合同上傳后，可將合同信息導入到系統(tǒng)數據庫中。

3 總體設計策略

3.1 合同管理數據庫具體設計

對于合同管理系統(tǒng)中的合同管理對應一張合同數據表（contact_table），合同管理數據表主要由以下字段組成：唯一ID、合同名稱（name）、合同代碼（code）、存儲路徑（path）、是否打?。╤asprt）等。具體主要設計代碼如下。

DROP TABLE IF EXISTS ` contact _table`；

CREATE TABLE ` contact _table` （

`id` int（32） NOT NULL，

`name` varchar（255） NOT NULL，

`code` varchar（255） NOT NULL，

`store_path` varchar（255） NOT NULL，

`hasprt` int（1） NOT NULL DEFAULT '0'，

PRIMARY KEY （`id`）

……

）；

這里的hasprt表示合同是否打印，如果一條記錄被選中后打印，該屬性值將被設置為1，有效避免了重復打印。通過合同導入模板外鍵（合同編號）使得合同管理表與模板表相關聯。

3.2 自踴打印關鍵技術說明

要保證文件能夠自動化打印，首先要通過初始化設置，對打印設備進行智能化設置。打印機自動化打印設置步驟如下。

（1）建立打印服務器，并在打印服務器上設置2個共享驅動，驅動1配置為縱向輸出，驅動2配置為橫向輸出。

（2）在項目合同系統(tǒng)上開發(fā)打印功能，使得系統(tǒng)可以直接調用打印設備。

（3）用戶在選擇合同打印時，由打印服務器對打印任務進行負載均衡，產生2個打印隊列，分別用驅動1和2進行調用打印設備。

篇4

出租方：(以下簡稱甲方)

承租方：(以下簡稱乙方)

甲、乙雙方就房屋租賃事宜，達成如下協議：

一、甲方將位于______市______街道______小區(qū)______號樓______號的房屋出租給乙方居住使用，租賃期限自______年______月______日至______年______月______日，計______個月。

二、本房屋月租金為人民幣______元，按月/季度/年結算。每月月初/每季季初/每年年初______日內，乙方向甲方支付全月/季/年租金。

三、乙方租賃期間，水費、電費、取暖費、燃氣費、電話費、物業(yè)費以及其它由乙方居住而產生的費用由乙方負擔。租賃結束時，乙方須交清欠費。

四、乙方同意預交______元作為保證金，合同終止時，當作房租沖抵。

五、房屋租賃期從______年______月______日至______年______月______日。在此期間，任何一方要求終止合同，須提前三個月通知對方，并償付對方總租金______%的違約金;如果甲方轉讓該房屋，乙方有優(yōu)先購買權。

六、因租用該房屋所發(fā)生的除土地費、大修費以外的其它費用，由乙方承擔。

七、在承租期間，未經甲方同意，乙方無權轉租或轉借該房屋;不得改變房屋結構及其用途，由于乙方人為原因造成該房屋及其配套設施損壞的，由乙方承擔賠償責任。

八、甲方保證該房屋無產權糾紛;乙方因經營需要，要求甲方提供房屋產權證明或其它有關證明材料的，甲方應予以協助。

九、就本合同發(fā)生糾紛，雙方協商解決，協商不成，任何一方均有權向天津開發(fā)區(qū)人民法院提起訴訟，請求司法解決。

十、本合同連一式___份，甲、乙雙方各執(zhí)___份，自雙方簽字之日起生效。

甲方：

乙方：

______年______月______日

正規(guī)的個人租房合同范本(二)

甲方：_________

乙方：_________

乙方承租甲方管理的上列房屋作為_________使用，雙方議定遵守事項如下：

房屋座落：_________區(qū)_________樓_________單元_________號 房屋使用面積：_________平方米

一、本租約為乙方取得承租房屋使用權的憑證。甲、乙雙方均有遵守國家有關住宅法律和本市房屋政策、法令的義務。

二、房屋租金數額因房屋條件或租金標準變動時，其租額得予調整，每月租金，乙方應于_________日前交清。

三、乙方有下列情況之一時，甲方可以終止租約，收回房屋：

(1)把承租的房屋轉讓，轉借或私自交換使用的;

(2)未經甲方同意私自改變承租用途的;

(3)無故拖欠租金三個月以上的。

四、甲方根據修繕標準檢查，維修房屋和設備，保障安全、正常使用。甲方維修房屋時，乙方應積極協助，不得阻礙施工。在正常情況下，如因檢查不周，維修不及時，以致房屋倒塌，使乙方遭受經濟損失時，由甲方負責賠償。

五、甲方鑒定房屋危險，不能繼續(xù)使用，必須騰出時，乙方應按期遷出，其居住房由甲方解決。如乙方籍故拖延不遷造成的一切損失，由乙方負責。

六、甲方對乙方承租的房屋進行翻建大修后，乙方有優(yōu)先承租權，但事先應簽訂協議。

七、乙方對承租的房屋及室內裝修設備，應負責保管，愛護使用，注意防火、防凍。如有損壞，乙方應負責修復或賠償。樓梯間、門道、走廊等公用房屋和設施，乙方應愛護使用，注意照管，防止損壞。

八、乙方不得私自拆改、增添房屋或設備。如屬必需時，應事先取得甲方同意或另行簽訂協議后方可動工。否則，乙方應負責恢復原狀。

九、乙方退租房屋時，應于七日前通知甲方，并辦清以下手續(xù)：

(1)交清租金和應交納的賠償費。

(2)按照租約負責保管的房屋及裝修設備。

(3)撤銷租約。

十、乙方承租甲方代管、托管的房屋在發(fā)還原主時，甲方得終止租約。

十一、乙方承租的房屋因國家建設，特殊需要必須騰讓時，甲方得終止租約。乙方所需房屋按有關規(guī)定辦理。

十二、本租約自立約日起至_________年_________月_________日止有效。一或_________份，甲乙雙方各執(zhí)_________份，如有未盡事宜，雙方協議解決。

十三、其他_________.

甲方(蓋章)_________ 乙方(蓋章)_________

代表人(簽字)_________ 代表人(簽字)________

__________年____月____日 _________年____月____日

正規(guī)的個人租房合同范本(三)

出租方：______________，以下簡稱甲方。

承租方：______________，以下簡稱乙方。

根據《中華人民共和國合同法》及有關規(guī)定，為明確甲、乙雙方的權利義務關系，經雙方協商一致，簽訂本合同。

第一條 甲方將自有的坐落在____市____街____巷___號______(小區(qū))___棟___單元___樓___號的房屋___間(套)，建筑面積___平方米、使用面積___平方米，類型___出租給乙方作___使用。裝修及設備情況：______________________________.

第二條 租賃期限

租賃期共___個月，甲方從___年___月___日起將出租房屋交付乙方使用，至___年___月___日收回。

乙方有下列情形之一的，甲方可以終止合同，收回房屋：

1.擅自將房屋轉租、分租、轉讓、轉借、聯營、入股或與他人調劑交換的;

2.利用承租房屋進行非法活動，損害公共利益的;

3.拖欠租金__個月或空置__月的。

合同期滿后，如甲方仍繼續(xù)出租房屋的，乙方擁有優(yōu)先承租權。

租賃合同因期滿而終止時，如乙方確實無法找到房屋，可與甲方協商酌情延長租賃期限。

第三條 租金、交納期限和交納方式

甲乙雙方議定月租金___元，交納方式為____支付，計人們幣(大寫)____________元(元)由乙方在___年___月___日交納給甲方。先付后用。以后每個___月付款一次，應在付款期末前___天支付。

第四條 租賃期間的房屋修繕

甲方對出租房屋及其設備應定期檢查，及時修繕，做到不漏、不淹、三通(戶內上水、下水、照明電)和門窗好，以保障乙方安全正常使用。乙方應當積極配合。

第五條 租賃雙方的變更

1.如甲方按法定手續(xù)程序將房產所有權轉移給第三方時，在無約定的情況下，本合同對新的房產所有者繼續(xù)有效;

2.乙方需要與第三人互換用房時，應事先征得甲方同意，甲方應當支持乙方的合理要求。

第六條 乙方必須遵守當地暫住區(qū)域內的各項規(guī)章制度。按時交納水、電氣、收視、電話、衛(wèi)生及物管等費用。乙方的民事糾紛均自行負責。水、電、氣底數各是：水____噸，電____度，氣____方。

第七條 甲方收乙方押金____元，乙方退房時，結清水、電、氣費，交還鑰匙后，由甲方退還乙方押金____元。

第八條 違約責任

1.甲方未按本合同第一、二條的約定向乙方交付符合要求的房屋，負責賠償___元。

2.租賃雙方如有一方未履行第四條約定的有關條款的，違約方負責賠償對方___元。

3.乙方逾期交付租金，除仍應補交欠租外，并按租金的___%，以天數計算向甲方交付違約金。

4.乙方擅自將承租房屋轉給他人使用，甲方有權責令停止轉讓行為，終止租賃合同。同時按約定租金的___%，以天數計算由乙方向甲方支付違約金。

5.本合同期滿時，乙方未經甲方同意，繼續(xù)使用承租房屋，按約定租金的___%，以天數計算向甲方支付違約金后，甲方仍有終止合同的申訴權。

第九條 免責條款

1.房屋如因不可抗拒的原因導致損毀或造成乙方損失的，甲乙雙方互不承擔責任。

2.因市政建設需要拆除或改造已租賃的房屋，使甲乙雙方造成損失，互不承擔責任。

因上述原因而終止合同的，租金按實際使用時間計算，多退少補。

第十條 爭議解決的方式

本合同在履行中如發(fā)生爭議，雙方應協商解決;協商不成時，任何一方均可向房屋租賃管理機關申請調解，調解無效時，可向經濟合同仲裁委員會申請仲裁，也可向人民法院起訴。

第十一條 其他約定事宜

1.___________________________________________________________________________.

2.___________________________________________________________________________.

第十二條 本合同未盡事宜，甲乙雙方可共同協商。

本合同一式2份，甲乙方各執(zhí)1份。從簽字之日起生效，到期自動作廢。

甲方(簽字蓋章) 乙方(簽字蓋章)

身份證號碼： ___________________ 身份證號碼：___________________

聯系電話：___________________ 聯系電話：___________________

篇5

關鍵詞：方言；語音；異同

中圖分類號：G633.41文獻標識碼：A文章編號：1006-026X（2013）11-0000-02

漢語方言俗稱地方話，只通行于一定的地域，他不是獨立于民族語之外的另一種語言，而只是局部地區(qū)使用的語言。不同的地域有著自己獨特的語音特點，但在相互區(qū)別的同時還可能存在一定的關聯性。大孤山和莊河方言語音就存在著這樣的特點。我們將對它們之間在聲母、韻母、聲韻配合三個方面的異同進行歸納和區(qū)別。

一、聲母方面的變化特點

（一）t、th、的發(fā)音的變化特點

在大孤山和莊河方言中，沒有t、th、這三個舌尖后音，普通話這三個聲母在大孤山和莊河方言中一部分讀為舌面前音、h、，例如：吃[th55]讀作[thi213]、[thi213]；另一部分讀為舌尖前音[]、[h]、[s]，例如：插[thA55]讀[tshA213]、[tshA213]。

但是其中有一部分字在這兩個地域的讀音的改變是有區(qū)別的。例如：這[t51]讀[e42]、[i42]。

（二）r的發(fā)音的變化特點

大孤山和莊河方言中沒有普通話r聲母，普通話的r聲母在大孤山和莊河方言中對應三種發(fā)音，在聲母r的發(fā)音上變化上大孤山和莊河方言沒有差別。第一種讀成齊齒呼i。例如：日[51]讀[i42]。第二種讀成撮口呼y。如：入團[u51]讀[y312]。第三種讀l，如：扔[55]在大孤山方言中讀[l312]或讀[x312]，而在莊河方言中只讀[x312]。

（三）普通話中送氣與不送氣的聲母，在部分大孤山發(fā)音中正好與之相反，在莊河方言也存在這種現象，但是發(fā)生變化的讀音沒有大孤山方言的比例大。

1.p與ph，例如：扒拉[phA35]讀作[pA312]、[phA312]。大孤山方言送氣，莊河方言不送氣。

2.t與th，例如：糊涂[thu]讀作[tu]、[thu]，大孤山方言送氣，莊河方言不送氣。但堤壩[ti55]讀[thi42]、[thi42]，這個字大孤山和莊河方言都變?yōu)樗蜌庖簟?/p>

3.t與th，例如：券兒[thyer51]讀[tyer42]、[thyer42]，這個字大孤山方言不送氣，莊河方言和普通話送氣。但畸[ti55]讀[thi42]、[thi42]，鬮[tiou55]讀[thiu312]、[tchiu312]，此二字大孤山和莊河方言都變?yōu)樗蜌庖簟?/p>

4.k與kh，在大孤山和莊河方言中，不送氣的聲母g在一部分字中讀成送氣的聲母k，這一變化兩個地域相同。例如：給[kei214]讀[khe213]、[khe213]。

5.ts、t與tsh、th，在部分字的讀音中互換，在大孤山和莊河方言變化中有異有同。例如，糙[tshu55]讀[312]、[h312]，兩地讀音不同。撞[tu51]讀[tshu42]、[tshu42]，兩地讀音相同。

4.普通話中聲母n的讀音，在大孤山和莊河方言中有一部分n的發(fā)音會出現發(fā)音部位的改變。并且二者在發(fā)音的改變上相同

（1）n變l。例如：能[n35]讀[l42]、[l42]。

（2）n變m。例如：泥[ni35]讀[mi312]、[mi312]。

（3）n變零聲母。例如：虐[ny51]讀[y42]、[y42]。

（4）后接i的n都變?yōu)樯嗝媲耙簟＠纾耗鉡ni214]讀[i213]，[i213]。

二、韻母方面的變化特點

1.與普通話相比，大孤山和莊河方言在韻母數量上都少4個韻母。缺少的韻母是、o、ai、u。

（1）大孤山和莊河方言都沒有翹舌音聲母t、th、、，所以能與這些聲母拼合的也就自然缺失，變成與、h、s拼合的。但與普通話的的發(fā)音有區(qū)別，舌尖不是抵在上齒背而是抵在下齒背，致使的音值接近濁擦音z，只是摩擦程度小一些。例如：志[t51]讀[42]、[42]。

（2）在大孤山和莊河方言中沒有o音，與普通話中只跟p、ph、m、f4個聲母相拼的o，在大孤山和莊河方言中都發(fā)一樣的（音。這一變化在聲韻配合部分會具體分析。

（3）普通話中復元音韻母ai，在大孤山和莊河方言中大部分變成一種讀音，個別變成（。并且兩地域有同有異。相同的讀音變化，例如：呆[tai55]讀[t312]、[t312]。不同的讀音變化，例如：麥[mai51]讀[m42]、[m213]。

（4）在大孤山方言和方言中沒有u韻母，都變?yōu)閡。例如：嗡[u55]讀[u312]、[u312]。

2.普通話u韻母，在大孤山和莊河方言大部分變?yōu)椤＠纾阂\[u214]讀[213]、[213]。但其中有兩個p與u拼合的字，u變?yōu)锳。剝皮[pu55]讀[pA213]、[pA213]，。還有三個不成規(guī)律的讀音變化，家雀兒[thiu214]讀[thy213]、[thy213]、，藥[iu51]讀[y213]、[y42]，鑰[iu51]讀[y213]、[y42]。

3.普通話ei韻母，在大孤山和莊河方言中大部分變?yōu)閑。例如：杯[pei55]讀[pe312]、[pe312]。但大孤山方言與莊河方言不同的是，當u與ei拼合時，在大孤山和莊河方言中ei 也變?yōu)閑。例如：退[thuei214]讀[the213]、[the213]。

4.以鼻音n結尾的韻母，在大孤山和莊河方言中都變?yōu)橄鄳谋腔繇嵞?。an變?yōu)椋琻變?yōu)?，in變?yōu)閕，un變?yōu)閥。例如：按[an51]讀[42]、[42]。但與r相拼時不遵循此規(guī)律。這在聲母部分已具體分析，此處不作贅述。

5.普通話的uo音，在大孤山和莊河方言中大部分都變?yōu)閡。例如：多[tuo55]讀[tu312]、[tu312]。但個別字也有特殊變化，例如：脫衣服[thuo55]讀[th213]、[thu213]，這個字在大孤山方言中丟u，與莊河方言不同。

三、聲韻配合方面的變化特點

1、p、ph、m、f四個雙唇音與o相拼。在大孤山和莊河方言中不讀o音，讀（音。例如：脖[po35]讀[p312]、[p42]。

2、、h、s、t、th、n、l在與韻母uei、uan、uen相拼。在大孤山和莊河方言中丟介音u，剩下的韻母變?yōu)閇e]、[]、[]。例如：亂[luan51]讀[l42]、[l42]。

3、在大孤山和莊河方言中聲母l不與i相拼，全變讀[le]音。例如：麗[li51]讀[le42]、[le42]。

4、n與u相拼的音，大孤山方言變?yōu)閚與相拼，莊河方言變?yōu)閚與u相拼。例如：農[nu35]讀[n42]、[nu42]。但是“弄[nu51]”比較特殊，在大孤山方言中有兩個發(fā)音[n42]、[nu42]，在莊河方言只有一個發(fā)音[nu42]。

5、k、kh與（相拼的音，在大孤山和莊河方言有一小部分變?yōu)閗與A相拼。例如：疙瘩[k55]讀[kA312]、[kA312]。

6、m與u相拼的音，在大孤山和莊河方言中丟u。例如：木[mu51]讀[m42]、[m213]。

7、t、th、與u相拼，在大孤山和莊河方言中有一部分u音變?yōu)閥音。例如：住[tu51]讀[y42]、[y42]；在大孤山方言中ts與u相拼，有一部分u音變?yōu)閥音，并且ts變?yōu)?，但莊河方言中則沒有這樣的變化。例如：租[tsu55]讀[y312]、[tsu312]。

在聲韻拼合方面的變化除了上述的規(guī)律和特點外，還有不成規(guī)律性的個別聲韻拼合發(fā)生音變，并且部分讀音，在大孤山和莊河方言的各自發(fā)生不同音變（用粗體標明）。如下表：

漢字普通話大孤山方言莊河方言

北Pei214p213p213

車th55h312hi312

斥th51h42hi42

齒th214i213h213

兒r35r312r312

喝x55x213xA213

黑xei55x213x213

津貼in55yn312yn312

腳iu214y213i213

嚼碎iu214y42i213

酵母iu51i42i42

顆、棵kh55kh312khu312

烙lu51lu213lu213

沒mei35me42m42

麥mai51m42m213

滅mi51mi42i42

努nu214nu213nu213

弄nu51n42、nu42nu42

怯hi51hy42hy42

扔55x312、l312l312

弱uo51y42y42

誰uei35se312y42

說話uo55y213y213

色s51s213s213

宿舍su51y213y213

塑su51su42su42

脫thuo55th213thu213

我uo214A213u213

尾uei214i213ue213

液體y51i42i42

賊tsei35tse42213

囑咐tu214y213u213

著急tu35ts312tsu42

拙tuo55ty312ty213

以上就是從描述大孤山和莊河方言的異同來分析丹東到大連過渡地域方言語音的變化特點。主要采用了舉例子，并與普通話對比的方法以便于理解。所舉的例子都是筆者在家鄉(xiāng)東港市大孤山鎮(zhèn)生活時使用的常用語與莊河方言進行對比。此中變化特點和區(qū)別頗多，可能有疏漏之處，有待進一步的考證和補充。

注釋：

①全文音標示例順序為：普通話、大孤山語音、莊河語音。

參考文獻：

篇6

琢磨了很久，許明想出一個辦法――找別人代開。客戶相中的是自己的產品質量和價格，發(fā)票不過是一張紙，只要是真的，誰開的都一樣。許明找到同行張有財，請他幫忙。張有財的企業(yè)是一般納稅人，能開增值稅發(fā)票。

雖然這種事兒見不得光，但張有財還是答應了。這種忙不白幫，因為開發(fā)票就等于銷售，營業(yè)稅、增值稅、所得稅都會隨之產生，這筆費用自然算到許明頭上，此外還有一筆好處費。張有財不怕許明不給錢，因為開發(fā)票，客戶就得把錢先打入張有財公司的賬戶，什么時候給許明、給多少，完全是張有財說了算。

發(fā)票有了著落，許明順利拿下訂單。2個月后順利交貨，客戶把錢打入張有財公司賬戶。許明覺得自己這事辦的漂亮，錢這么輕松就賺到手了。沒想到，新麻煩來了。許明問張有財要錢，可對方一拖再拖。當初，許明覺得自己開口求人幫忙，因此也沒好意思讓對方立什么字據。眼看著張有財賴賬，許明可慌了神。

打官司，沒證據！來硬的，張有財勢力比自己大多了。難道自己辛苦一場，不但沒賺錢，反倒賠了一大筆？許明氣得唉聲嘆氣，正巧在大學法律系念書的兒子小強放假回家，聽說原委后，認為父親辦事太糊涂：“爸，不是我說您，這么大的事，怎么能口頭一說就完事呢?！痹S明急得干瞪眼：“那咋辦，難道就只能吃啞巴虧？”小強想了想說：“也不是沒辦法，只能一搏了?！?/p>

第二天，許明來到張有財公司要錢，張有財早就吩咐好了秘書擋駕。激動的許明和秘書吵了起來，后來竟然暈了過去。畢竟是在自己公司出的事，張有財馬上打120急救……

幾天后，小強帶著禮品來找張有財。這讓張有財有些發(fā)毛：“你這是……”小強忙遞上禮物，說：“感謝大伯及時把我爸送到醫(yī)院，醫(yī)生說再晚一會，命就保不住了。我爸現在一陣清醒一陣糊涂，以前是錯怪了大伯你。我這倉促接班，以后還得大伯你多指點呢?！?/p>

聽小強這么說，張有財心里高興，看來許明不但不追究，而且只要醫(yī)生證明他腦子不清醒，自己就白撿了一筆巨款。張有財高興，言語間也放松了很多。小強一個勁兒給張有財戴高帽，張有財被捧得云里霧里，把自己吹得神乎其神，說自己如何開發(fā)票撈好處，誰都拿他沒辦法，聊到最后，張有財竟說：“別學你爸，這種找人開發(fā)票的事兒，怎么能不立字據呢？我這算給他上一課！”

回到醫(yī)院，小強趁身邊沒人，悄悄地把經過和許明說了。原來，許明根本就沒事，那天暈倒，完全是演戲。小強對許明說：“爸，張有財就是個無賴，跟他沒道理可講，咱們還是打官司吧，我拿到證據了?！痹S明上下打量小強，“你說的證據在哪兒呢？”小強從襯衫口袋里拿出錄音筆說：“我和張有財的談話都讓我錄了下來?！?/p>

在法庭上，面對許明的指控，張有財矢口否認，而且還倒吐苦水，說自己明明是見義勇為，出于好心把許明送到醫(yī)院，結果反倒被賴上了。而且醫(yī)生說許明腦子壞了，他的話不能當真，自己比竇娥還冤。

見張有財不認賬還反咬一口，許明也豁出去了。他向法官講述了以往的經歷，關鍵的是當庭播放了小強和張有才的談話錄音。張有財非常震驚，他提出異議，認為小強偷錄他們的談話，不能作為證據。

法官仔細聽了這份錄音，二人的談話聽得非常清楚，張有財在吹噓時不知不覺漏了底，法庭因此認定，張有財欠賬事實成立。法院最終判決：許明提交的錄音取證手續(xù)合法，能夠作為證據。對于代開發(fā)票的行為，法院移交稅務機關進行核查后處理。

錄音是否可以作為證據在庭審中使用，依據法律規(guī)定：對于一方當事人提出的有其他證據佐證并以合法手段取得的、無疑點的視聽資料或者與視聽資料核對無誤的復制件，對方當事人提出異議但沒有足以反駁的相反證據的，人民法院應當確認其證明力。小強就是利用關鍵證據“錄音”才打贏了官司。

篇7

近期，浦發(fā)銀行在業(yè)內率先打通了企業(yè)手機銀行和銀企直連服務渠道，為一大批已經使用財務或資金管理系統(tǒng)與銀行對接的銀企直連客戶帶來了移動金融的“福音”。

今后，企業(yè)客戶可以通過浦發(fā)企業(yè)手機銀行進行企業(yè)賬戶管理、查詢，并對已通過銀企直連系統(tǒng)提交的業(yè)務進行授權和審核，這不僅可以解決管理機制嚴密的大型企業(yè)、集團性企業(yè)高管經常外出、難以及時通過公司財務或資金管理系統(tǒng)進行緊急付款或業(yè)務授權等問題，還可以幫助一些財務管理系統(tǒng)中授權機制不太完善的中小企業(yè)增強企業(yè)管理。例如公司財務系統(tǒng)中授權層次不夠的企業(yè)，通過銀企直連發(fā)送交易指令后，可通過增加手機銀行審核的方式來增加授權管理層次，從而既能享受到銀企直連系統(tǒng)所帶來的付款記賬一步處理、來賬自動核銷、電子自動對賬等業(yè)務的好處，還能通過手機銀行增加財務管理層次并享受移動辦公的優(yōu)勢。

在電子銀行服務領域，浦發(fā)銀行一直走在同業(yè)的前列。該行以客戶為中心，緊跟各種最新IT技術，不斷探索用更好的科技手段和服務方式來充實電子銀行的服務內涵。浦發(fā)銀行的銀企直連服務不僅包括傳統(tǒng)的存貸款信息查詢、理財賬戶信息查詢、轉賬支付、工資等基本金融服務功能，還包括集團賬戶管理、人民幣資金池、外幣資金池、銀行理財賬戶管理（活期/定期存款互轉、活期/通知存款互轉等）、電子商業(yè)匯票（出票、收票、提示付款、背書轉讓、貼現、質押等）、備付金存管等新型的金融服務功能，全面滿足各類客戶在金融電子化方面的需求。如今，浦發(fā)銀行通過打通企業(yè)手機銀行和公司網銀、銀企直連等電子渠道的服務功能，為企業(yè)客戶帶來更加多樣化、便捷、高效的多渠道金融整合服務體驗，不僅可以幫助企業(yè)加強財務管理、降低成本，而且更能增加便利、提高效率，讓企業(yè)客戶有更多的時間捕捉市場商機，助力企業(yè)客戶的快速發(fā)展。

繼去年推出面向企事業(yè)單位客戶的企業(yè)手機銀行WAP服務和iPhone、Android客戶端服務以來，今年，浦發(fā)銀行先后推出了iPad、Symbian（觸摸屏）、Symbian（鍵盤）、WindowsPhone客戶端等服務，成為銀行同業(yè)中首家、也是目前惟一能為企事業(yè)單位客戶提供全版本企業(yè)手機銀行的銀行，讓企事業(yè)單位客戶能夠充分體驗移動辦公的便捷和高效。與此同時，浦發(fā)銀行注重渠道整合，努力通過網上銀行、直聯銀行、手機銀行、電話銀行、自助銀行五大電子渠道為企業(yè)客戶提供最佳的移動金融、多渠道整合的公司電子金融服務。

浦發(fā)銀行現金管理部總經理曲麗萍表示，該行將繼續(xù)堅持以客戶為中心，秉持“新思維、心服務”的理念，努力為企業(yè)客戶打造更加便捷、高效、專業(yè)的產品和服務體驗。

篇8

關鍵詞：銀杏達莫；血塞通；腦梗死

腦梗死是臨床常見病之一，疾病的致殘率、致死率高，在治療腦梗死的治療中，如何減少患者的腦梗死后遺癥，降低傷殘率是臨床醫(yī)師在不斷探索的問題。2011年1月～2013年6月，我院采用銀杏達莫聯合血塞通治療腦梗死，取得較為滿意的臨床效果，現報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料 選取我院2011年1月～2013年6月收治的腦梗死患者92例，按照1995年中華神經科學會提出的《各類腦血管疾病診斷要點》[1]中相關診斷標準，經影像學檢查后，所有患者均確診，其中男58例，女34例，年齡41～81歲，平均年齡（61.3±5.8）歲，10例患者合并糖尿病，34例患者合并高血壓，12例患者合并高血脂，22例患者合并冠心?。?2例患者分為對照組和觀察組，每組46例，兩組患者一般資料無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2方法 對照組給予血塞通注射液400mg，加入0.9%氯化鈉注射液250ml靜脈滴注，1次/d，2w為1個療程；觀察組在此基礎上給予銀杏達莫注射液20ml，加入0.9%氯化鈉注射液250ml靜脈滴注，1次/d，2w為1個療程。兩組的其他治療措施如神經營養(yǎng)藥的應用、功能康復訓練、危險因素的干預等同樣。

1.3療效判定標準 根據全國第四屆腦血管病學術會議制定的療效評定標準[2]，分基本痊愈、顯效、有效、無效四級對臨床效果進行評定，以基本痊愈、顯著進步、進步計算有效率。基本痊愈：功能缺損評分減少91%～100%，病殘程度為0級；顯著進步：功能缺損評分減少46%～90%，病殘程度為1～3級；進步：功能缺損評分減少18%～45%；無效：功能缺損評分減少17%左右，治療前、后癥狀沒有任何改善或者出現病情加重。

1.4統(tǒng)計學處理 采用統(tǒng)計學軟件SPSS18.0對所得數據進行處理，計數資料用χ2檢驗，計量資料用t檢驗。P

2結果

2.1兩組患者臨床療效比較 觀察組總有效率89.13%，對照組總有效率76.0%，觀察組總有效率明顯高于對照組（χ2=4.357，P=0.0384），二者差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2兩組治療前后神經功能缺損評分比較 觀察組治療前神經功能缺損平均評分（61.1±19.4），治療后下降為（46.6±7.3），治療前后比較，差異明顯（t=3.687，P=0.0463）；對照組治療前神經功能缺損平均評分（60.3±18.7），治療后下降為（56.3±6.9），治療后下降程度不明顯（t=1.084，P=0.782）。兩組患者治療后神經功能缺損評分比較，觀察組明顯優(yōu)于對照組（t=6.874，P=0.0178），二者差異有統(tǒng)計學意義。

3討論

銀杏達莫注射劑是銀杏黃酮和雙嘧達莫的復方劑，銀杏黃酮具有改善患者腦缺血導致的記憶功能障礙、擴張腦血管以及冠脈血管等；而雙嘧達莫可以控制患者血小板聚集，有效清除自由基，可以縮小急性腦梗死的面積。其可抑制血栓烷素TXA2的形成，有效抑制患者血小板、上皮細胞以及紅細胞攝取腺苷，部分腺苷的濃度變高，直接作用于血小板的A2受體，對腺苷酸環(huán)化酶產生一定的刺激，促使血小板內的環(huán)磷腺苷增多，起到抑制血小板聚集的作用，同時可加強患者內源性PGI2的功能，促進患者恢復腦及心肌功能，明顯改善心腦缺血癥狀[3]。血塞通是一種三七皂苷的中成藥制劑，三七屬于五加科植物，藥性溫和，味道微苦，具有消腫止痛的效果，用乙醇溶解該藥，起到活絡的良好作用，使患者的血液流動性變強，有效抑制血栓的形成，有利于促使神經功能以及神經細胞的恢復，能夠很好地促進患者肢體功能癱瘓的恢復，臨床良好的效果也已得到實踐證實[4]。本研究中，治療組患者采用銀杏達莫聯合血塞通治療，其治療總有效率達到89.13%，明顯高于對照組，充分說明了銀杏達莫聯合血塞通在治療腦梗死患者中的良好效果，說明此二藥聯用有協同作用。

總之，銀杏達莫聯合血塞通治療腦梗死，可有效改善腦梗死患者神經功能缺損癥狀，促進患者肢體功能癱瘓恢復，治療效果顯著，值得臨床推廣應用。

參考文獻：

[1]中華神經科學會.各類心血管疾病診斷要點[J].中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥，1996，1（2）：10-11.

[2]陳清棠.腦卒中患者臨床神經功能缺損程度評分標準（1995）[J].中華神經科雜志，1996，29（6）：381.

篇9

關鍵詞：合同結算糾紛 關鍵問題 防范對策

隨著我國社會經濟體制的不斷完善和人們法律意識的逐漸加強，工程合同成為了工程項目開展過程中維護雙方利益的重要法律依據。合同結算糾紛是工程糾紛中比較常見的一種糾紛形式，對各方的利益都造成了嚴重的影響，因此，避免合同糾紛問題顯得尤為重要。

一、引發(fā)合同結算糾紛的原因分析

（一）合同內容問題

合同內容糾紛問題在合同結算糾紛中出現的較多，爭端也比較大。由于發(fā)包方在合同簽訂中占據先天優(yōu)勢，在擬定合同時可以加入有利于發(fā)包方的相關條款，而由于承包方在相關技術人員方面比較缺乏，對工程合同的內容理解又不夠全面和謹慎，沒有發(fā)覺合同中的相關問題，使得合同結算時出現矛盾。

（二）合同變更問題

合同變更是指工程施工過程中，發(fā)包方出于某些原因進行的工程量和合同的更改。合同變更問題同樣容易造成合同結算糾紛，究其原因是因為雙方在達成工程承包意向后未經第三方公證，并且合同變更前承包方沒有及時了解工程總量及隱秘工程量，使得工程延期，從而造成了合同計算糾紛的問題。

（三）合同違約問題

合同違約分為承包方合同違約和分包方的合同違約，這種現象也是造成合同結算糾紛的主要原因。承包方合同違約主要表現在工程時間違約和工程質量的違約，沒有按照書面合同上所規(guī)定的時間內交工，或是工程質量沒有符合標準；分包方合同違約則是不能及時支付工程材料費用、工程設備費用等相關費用，導致了工程的延期和停工現象的發(fā)生。

（四）工程尾款問題

當工程交工后，為保證工程的使用質量，發(fā)包方往往會按照合同條款扣押部分工程尾款，作為一年內工程質量保修金，確保承包方在一年內對工程履行相關的保修義務，保修期過后再將剩余尾款結交給承包方。而工程尾款問題常常因為承包方在進行工程維修時服務質量使發(fā)包方不滿意，而最終導致了合同結算糾紛事件。

（五）工程材料問題

工程材料問題同樣也會影響合同結算進度。由于材料市場價格的變動影響，承包方為牟取個人利益或減輕工程資金負擔，使用部分合同之外的建筑材料進行工程施工，從而導致了發(fā)包方的不滿，造成了合同結算糾紛。

二、合同結算糾紛的相關預防措施

（一）合同內容的推敲

在進行工程合同簽訂之前，作為承包方，應該仔細閱讀工程合同，認真推敲工程合同中的所有條款，加大對合同審核工作力度。要明確合同內容是否合法、有無缺項漏項、是否存在不公平性、合同中有無涉及自然因素對工程進度影響的說明、工程結算價格是否合理等問題，同時征求工商管理部門對合同的鑒定及合同簽名進行公證。我國已經出臺相應的法律政策，明確了工程合同內容及有關說明，承包方可以按照國家標準進行合同的審核，確定合同的有效性。而發(fā)包方，也應該依照相應的合同范本進行合同的擬定，確保合同的有效性及合法性，避免合同糾紛問題的出現。

（二）合同變更中工程量的計算

在工程施工過程中合同變更是非常普遍的，但合同變更需要在合理的條件下才能進行簽訂，從而保證工程的順利竣工。因此，在合同變更時，承包方同樣需要仔細閱讀工程變更條款，認真計算合同變更所增加的工程量，找出隱秘工程量，然后按照工程量進行工期的延長，確保沒有任何異議之后，方能簽訂變更合同，并且同樣征求工商管理部門的公證和鑒定。

（三）避免合同違約發(fā)生

合同違約，對于承發(fā)雙方都會造成嚴重的損失，因此，避免合同違約現象的發(fā)生才是消除雙發(fā)經濟損失的最好方法。作為發(fā)包方，應該深入了解承包方的實際施工能力，審視承包方的施工資格，確保工程的如期完成。同時，發(fā)包方應該督促工程監(jiān)理人員對工程施工中的質量進行嚴格把控，以免造成嚴重后果；而作為承包方，同樣需要了解工程發(fā)包方的資歷和經濟狀況，對于風險較大的工程應該征求相關管理部門意見，杜絕合同違約事故出現。

（四）嚴格把控服務質量

在工程保修期，若工程出現一定質量問題，承包方應該認真履行維修義務，做好工程維修工作，保證工程尾款的順利結算。同時，承包方在工程施工期間也應該注意服務質量，嚴格工程管理，確保承發(fā)雙方的良好合作關系。

（五）做好工程內容的統(tǒng)計和匯總

工程日記是承包方施工過程中必須要認真記錄的，這有利于把握工程施工進度，還能夠為承包方提供一定的法律依據。承包方同樣需要做好工程施工材料的統(tǒng)一和審核，若工程材料需要變更，則必須向發(fā)包方認真匯報，待雙發(fā)達成共識并簽訂書面協議后，方能進行工程材料的更改，從而避免因工程材料導致的合同結算糾紛問題。

總結

工程合同是確保承發(fā)雙發(fā)利潤的重要工具，為避免合同計算問題的出現，需要承發(fā)雙方明確合同內容，認真履行合同義務，確保合作過程的順利結束。從以往合同糾紛的原因中需求問題答案，并在工程開展過程中進行注意，不僅能夠將雙方的損失降到最低，還能夠保證我國建筑工程事業(yè)的健康發(fā)展，對我國經濟發(fā)展、社會發(fā)展都有著非常重要的意義。

參考資料：

[1]張鵬，周宏.淺淡建設工程結算糾紛的幾個原因[J].油氣田地面工程，2008.8

篇10

【關鍵詞】 丙型肝炎病毒；核心蛋白；突變；原核表達

Expressions of different deletion mutated HCV core protein genes in E.coli

【Abstract】 AIM: To construct the recombinant plasmids expressing fulllength HCV core protein gene and 3 different deletion mutated hepatitis core protein genes and to express them in E.coli. METHODS: Entire HCV core protein gene and 3 different deletion mutated gene fragments from HCV core protein which respectively coded 1-191aa， 1-59aa plus 81-191aa， 1-169aa， 1-59aa plus 81-169aa were amplified by PCR and cloned into expression vector pRSETA， thus forming different recombinant plasmids （pRSETAC573， pRSETAC510， pRSETAC507， pRSETAC444）， which were transformed into E.coli BL21 （DE3） pLysS and induced by IPTG. SDSPAGE and Western blot were used to test and identify expressed 6×Hisfusion proteins. RESULTS: Restriction analysis and sequencing confirmed that the 4 recombinant plasmids expressing entire HCV core protein gene and 3 different deletion mutated hepatitis core protein genes were successfully constructed. Both SDSPAGE and Western blot analysis showed entire HCV core protein gene and 3 different deletion mutated hepatitis core protein genes were expressed， and the respective molecular weights of the products were about 21×103， 19×103， 19×103 and 16.5×103. The fusion protein production accounted approximately for 20% of total bacterial protein. CONCLUSION: Different deletion mutated HCV core protein genes were expressed efficiently in E.coli.

【Keywords】 hepatitis C virus; core proteins; mutation; prokaryotic expression

【摘要】 目的： 構建丙型肝炎病毒（HCV）全長及3種不同缺失突變的核心蛋白基因的原核表達載體，并在大腸桿菌中表達. 方法：用PCR方法擴增基因型為1b型的HCV核心蛋白的全長及3種不同缺失突變的基因片段，對應氨基酸分別為C573：1-191aa，C510:1-59aa+81-191aa，C507:1-169aa，C444:1-59aa+81-169aa. 將其克隆到高效表達載體pRSETA中構成重組質粒（pRSETAC573，pRSETAC510，pRSETAC507，pRSETAC444），轉化大腸桿菌BL21（DE3）pLysS. IPTG誘導表達6×His融合蛋白，表達產物經SDSPAGE及Western blot檢測和鑒定. 結果： 經酶切鑒定及測序證實全長及3種不同缺失突變的核心蛋白基因的原核表達載體構建正確. 經SDSPAGE及Western blot顯示在Mr約為21×103， 19×103， 19×103， 16.5×103處出現融合表達條帶. 融合蛋白的表達量約占菌體蛋白總量的20％. 結論：全長及3種不同缺失突變的丙型肝炎病毒核心蛋白基因均在大腸桿菌中得到有效表達.

【關鍵詞】 丙型肝炎病毒；核心蛋白；突變；原核表達

【中圖號】 R512.630.27

0引言

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus， HCV）感染已成為全球性的社會公共衛(wèi)生問題，迄今尚無有效的預防性疫苗. HCV核蛋白基因相對保守［1］并且能誘導CTL反應及ADCC，有可能用于開發(fā)HCV預防及治療性疫苗. 我室曾擴增羧基末端的20個氨基酸和（或）第60~80位氨基酸多肽基因缺失的核蛋白基因，并在真核細胞中表達成功，初步證實突變掉上訴兩個肽斷能提高機體免疫反應［2-3］. 為進一步探討不同缺失突變核心蛋白對免疫反應的影響，我們構建了HCV核心基因不同缺失突變基因片段的原核表達載體并在大腸桿菌中進行了表達.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1質粒與菌株源質粒pCI573， pCI510， pCI507， pCI444系本室將不同缺失突變的核心蛋白基因克隆入真核表達載體pCIneo中構建而成，其中分別插入了自西安地區(qū)患者血清中克隆的1b型HCV完整的核心蛋白基因（573 bp）， 60～80位氨基酸缺失的核心蛋白基因片段（510 bp）， 羧基末端20位氨基酸缺失的核心蛋白基因片段（507 bp）， 同時突變掉60～80位氨基酸和羧基末端20位氨基酸的核心蛋白基因片段（444 bp）. 原核表達載體pRSETA為Invitrogin公司產品，中間克隆載體pGEMT easy為Promega公司產品. E. coli JM109由本室保存，BL21為Invitrogin公司產品.

1.1.2工具酶及主要試劑DNA快速提取試劑盒購自上海華瞬生物工程公司、高保真PCR 試劑盒、DNA分子量標準、蛋白分子量標準均為大連寶生物工程公司產品，HindⅢ， BamHⅠ， T4 DNA連接酶、膠回收試劑盒購自Promega公司. 抗His抗體購自Invitrogin公司，二抗及顯色試劑購自Sigma公司.

1.2方法

1.2.1PCR引物設計根據源質粒pCI573， pCI510， pCI507， pCI444中HCV核心蛋白基因起始密碼子下游及終止密碼子上游核苷酸序列設計了3條引物（上海鼎安生物技術有限公司合成）: 上游引物P1: 5′ GTGCGGATCCATGAGCACGAATCCTAAAC 3′， 下游引物： P2: 5′ TCGCAAGCTTTCACAAATTTCCCTGTTGTTGCATA 3′， P3: 5′ TCGCAAGCTTTCAAGCGGAAGCTGGGGTGGTCAG 3′. 在其上游引物引入BamHⅠ酶切位點、下游引物引入HindⅢ酶切位點.

1.2.2目的片段的擴增分別以質粒pCI573， pCI510， pCI507， pCI444為模板進行PCR擴增，擴增過程中模板與引物對應如下：pCI573， pCI510為P1， P2； pCI507， pCI444為P1， P3. 循環(huán)參數為94℃ 5 min， 94℃ 1 min， 55℃ 50 s， 72℃ 1 min共進行30個循環(huán)，最后于72℃延伸10 min. 取5 μL PCR反應液在10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳上進行擴增產物檢測分析.

1.2.3重組質粒的構建及鑒定將4種PCR產物按1：3與中間載體pGEMT easy連接，轉化感受態(tài)細胞JM109，挑陽性克隆接種擴增，小量提取質粒DNA，并以HindⅢ， BamHⅠ雙酶切進行鑒定后交上海鼎安生物技術有限公司測序. 測序正確后將中間連接產物pGEMT easy573， pGEMT easy510， pGEMT easy507， pGEMT easy444用HindⅢ， BamHⅠ雙酶切，膠回收酶切產物與經相應雙酶切的pRESETA質粒連接. 轉化感受態(tài)細菌JM109，挑陽性克隆接種擴增，小量提取質粒DNA，并以HindⅢ， BamHⅠ雙酶切進行鑒定后交上海鼎安生物技術有限公司做序列測定.

1.2.4融合蛋白的誘導表達將重組質粒pRSETAC573， pRSETAC510， pRSETAC507， pRSETAC444轉化BL21感受態(tài)細菌. 30℃振搖擴增轉化細菌，3 h后（A600 nm約為0.6）加IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導表達，分別于1， 3， 5和7 h后收菌. 12 000 g離心5 min，菌體沉淀重懸于100 μL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，于液氮中和42℃反復凍融4次，以最大速度4℃離心10 min，然后分別在上清和沉淀中加入100 μL及200 μL 1×SDSPAGE上樣緩沖液，置于-20℃?zhèn)溆?

1.2.5SDSPAGE融合蛋白定量及Western blot檢測融合蛋白用18％的分離膠SDSPAGE電泳后將蛋白轉移到NC膜上，以50 g/L脫脂奶TBST封閉，以小鼠抗His抗體（1∶100）為一抗，生物素標記的抗鼠抗體（1∶500）為二抗進行抗原抗體反應.然后將NC膜浸入含鏈酶親和素過氧化物酶（1∶500）的TBST中室溫振搖1 h，最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸鎳氨法顯色.

2結果

2.1表達載體的構建及鑒定亞克隆重組質粒pGEMT easy573， pGEMT easy510， pGEMT easy507， pGEMT easy444以及終載體pRSETAC573， pRSETAC510， pRSETAC507， pRSETAC444用HindⅢ， BamHⅠ雙酶切后，用瓊脂糖凝膠進行電泳分別在約573， 510， 507和444 bp處出現條帶，與預期分子量相符（圖1）. DNA雙向測序證實插入片段序列及讀碼框均正確，表明質粒構建成功.

圖1重組質粒的限制性酶切分析（略）

2.2融合蛋白的表達與分析經SDSPAGE電泳檢測，在Mr約21×103， 19×103， 19×103， 16.5×103處出現條帶，均與預期的目的條帶分子量一致. 條帶隨誘導時間延長顏色加深，經IPTG誘導5 h時目的蛋白量最多. 經薄層掃描測定，融合蛋白的表達量約占菌體總蛋白的20%. 表達蛋白大部分以包涵體形式存在于菌體沉淀中，上清中也可見明顯蛋白條帶（圖2）.

2.3融合蛋白的Western blot結果顯色后Mr約21×103， 19×103， 19×103， 16.5×103處出現藍色條帶，與預期的所要表達的6×His融合不同缺失突變核蛋白分子量大小相符，表明目的蛋白在大腸桿菌中得到了有效表達(圖3）.

圖2融合蛋白表達的SDSPAGE分析（略）

圖3融合蛋白的Western blot分析（略）

3討論

近年來，核心蛋白的抗病毒免疫成為丙型肝炎的一個研究熱點，但研究發(fā)現全長的核心蛋白不能誘導有效的CTL效應. 有學者推測核心蛋白的某些區(qū)段對機體免疫反應有抑制作用，為證實這一推斷，國內外學者［4-7］對HCV核心蛋白各個區(qū)段的功能作了大量研究. 有研究［8］用截去HCV基因羧基末端的核心蛋白（1~176位氨基酸）的表達產物免疫小鼠，發(fā)現核蛋白特異性抗體滴度在初次免疫第16周時急劇升高到1∶8000并至少持續(xù)到27 wk，同時誘導出特異性T細胞增殖反應. 另一研究小組［9］研究證明：截去羧基末端的核蛋白基因的質粒免疫小鼠能夠刺激IFNγ的產生，并誘導出強烈的核蛋白特異性遲發(fā)性超敏反應. Langhans等［10］報告來源于HCV核心蛋白第59~83氨基酸合成肽具有抑制HCV感染者外周血T細胞針對核心蛋白的增殖反應. 作者認為該多肽片段干擾了對核蛋白的抗原提純. 為進一步探討不同缺失突變核心蛋白對免疫反應的影響，我們將全長及3種不同缺失突變的核心蛋白基因在大腸桿菌中進行大量表達.

我們采用了原核表達載體pRSETA，該載體有兩個特點：一是含有T7啟動子，可被T7 RNA聚合酶識別，T7 RNA聚合酶的轉錄效率比大腸桿菌RNA聚合酶高5倍，能夠高效轉錄mRNA，大量表達目的蛋白. 二是載體上攜帶有6個His殘基，分子量僅為840，對目的蛋白的結構和生物學活性影響很小，而且便于純化. 本研究用該載體獲得了目的蛋白的高效表達，同時我們還觀察到IPTG最佳誘導時間為5 h. 為減少核心蛋白本身的細胞毒性作用，采取了30℃誘導. 總之，本研究成功構建了不同截短核心蛋白基因的原核表達載體，獲得了正確的表達蛋白，為進一步研究HCV核心蛋白各區(qū)域的免疫學功能打下了基礎.

參考文獻

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［2］ 洪沙，黃長形，楊為松，等. 第60~80位氨基酸多肽片斷缺失的HCV核蛋白在真核細胞中的表達［J］. 第四軍醫(yī)大學學報，2005，26（12）：1101-1104.

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［8］ DuenasCarrera S， AlvarezLajonchere L， AlvarezObregon JC， et al. A truncated variant of the hepatitis C virus core induces a slow but potent immune response in mice following DNA immunization［J］. Vaccine， 2000， 19(78): 992-997.

［9］ AcostaRivero N， DuenasCarrera S， AlvarezLajonchere L， et al. HCV core proteinexpressing DNA vaccine induces a strong class Ibinding peptide DTH response in mice ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2004， 314(3): 781-786.