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篇1

【關(guān)鍵詞】 異體移植

摘 要：［目的］研究神經(jīng)長度是否影響化學(xué)去細胞神經(jīng)的質(zhì)量及化學(xué)去細胞異體神經(jīng)修復(fù)犬神經(jīng)缺損的適當(dāng)長度范圍。［方法］切取犬的坐骨神經(jīng)全長，截取直徑近似段長度12 cm，去除神經(jīng)外膜的脂肪組織及血管，在50％Triton X100和50％脫氧膽酸鈉中重復(fù)消化得到化學(xué)去細胞神經(jīng)；部分神經(jīng)用于組織學(xué)評價，將12 cm神經(jīng)按順序切割為6段，石蠟包埋制備切片，厚度5 μm。HE染色和Fastblue染色，觀察去細胞程度、神經(jīng)細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性、髓鞘染色強度，觀察每段神經(jīng)的差異。在體內(nèi)實驗中，用化學(xué)去細胞異體神經(jīng)橋接犬的坐骨神經(jīng)缺損，缺損長度分別為8、10 cm組，每組各有6條成年犬，隨訪時間12個月。觀察動物肢體功能恢復(fù)、肌電圖變化及再生神經(jīng)組織學(xué)表現(xiàn)，包括HE染色、S100免疫組織化學(xué)染色、乙酰膽堿酯酶染色。［結(jié)果］去細胞神經(jīng)全長各段在去細胞程度、結(jié)構(gòu)完整性及殘余髓鞘染色綜合評價中無差異。體內(nèi)移植實驗結(jié)果顯示8 cm去細胞異體神經(jīng)移植組的犬在術(shù)后12個月踝關(guān)節(jié)可直立行走，而10 cm去細胞異體神經(jīng)移植組犬12個月時踝關(guān)節(jié)不能直立行走。肌電圖檢查結(jié)果顯示，兩組動物的手術(shù)肢體均可記錄到誘發(fā)的運動和感覺電位。肌電圖波幅、時限及運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度結(jié)果顯示，8 cm移植組明顯高于10 cm移植組(P

關(guān)鍵詞：去細胞神經(jīng)； 異體移植； 再生

Abstract：［Objective］The purpose of this paper is to demonstrate whether the nerve length could affect the quality of acellular nerve and investigate the properly repairable distance of nerve defects with acellular nerve allografts. ［Method］Fresh sciatic nerves were obtained from adult dogs and pided into 12 cm long segments. The nerve segments were decellularized via an improved chemical decelluarization treatment as following: Nerve segments were rinsed with cold sterile Ringer's solution and submergedin 5% Triton100 solution 12h ，and then soaked the nerve segments into 5% sodium deoxycholate for 12h. The treated nerve segments were washed in distilled water for 3h. This procedures were repeated once again. In vitro， the degrees of decellularization ， demyelination and integrity of nerve fiber tubal of chemically extracted acellular nerves were observed with microscope and assessed by a score system. In vivo，the sciatic nerve of dogs on the right was exposed.In 8 cm grafted group (n=6)，a 7 cm segment of sciatic nerve was removed from the midthigh level. In 10 cm grafted group (n=6) ， a 9 cm segment of sciatic nerve was removed at the same level. The gaps were bridged with acellular nerve allografts by 8 cm and 10　cm long segments respectively. The followup period was 12 month postoperatively. Motor functional recovery of the right hind following allografting was examined by neurobehavioral， electrophysiological， histological and immunohistochemical assessment. ［Result］There was no difference on the degrees of decellularization， demyelination and integrity of nerve fiber tubal among every fraction of the acellular nerve from the two ends to the central portion. In 8 cm grafted group ， all survival dogs(n=5) were held upright with the affected hindlimb extended so that the body's weight was supported by the distal metatarsus and toes. In 10 cm grafted group， animals were failed to held upright with the affected hindlimb. Electrophysiological studies showed that elctromyographic activity was observed in both groups.After 12 month the conduction velocity was 321+51 m/s in 8 cm grafted animals and 183+6.0m/s in 10 cm grafted group. In normal animals， the conduction velocity was 1066+164 m/s. The conduction velocity in 10 cm grafted group was lower than 8 cm grafted(P

Key words: Acellular nerve; Allograft; Regeneration

創(chuàng)傷、理化因素及腫瘤等原因可導(dǎo)致周圍神經(jīng)的損傷，造成長距離的神經(jīng)缺損。為恢復(fù)肢體的神經(jīng)支配通常需要應(yīng)用移植物橋接神經(jīng)缺損。該類移植物的功能是引導(dǎo)神經(jīng)纖維通過缺損區(qū)并長入支配的器官和組織。由于新鮮異體神經(jīng)移植的免疫學(xué)反應(yīng)，在臨床實踐中自體神經(jīng)移植一直被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)”。但是由于切取自體神經(jīng)帶來的諸多并發(fā)癥及供區(qū)所限，自體神經(jīng)替代物修復(fù)神經(jīng)缺損成為研究的重點。人工合成的替代物主要是由具有良好生物相容性和生物可降解材料制備，如PLA(polylacticacid)［1，2］，PLGA［poly(lacticcoglycolic)］［3］等。合成材料雖然可避免切取自體神經(jīng)的并發(fā)癥及異體神經(jīng)的免疫反應(yīng)，但在內(nèi)部結(jié)構(gòu)上不具備天然神經(jīng)細胞外基質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)，而這種結(jié)構(gòu)對引導(dǎo)神經(jīng)軸突的生長至關(guān)重要。異體神經(jīng)的MHC(major histocompatibility complex)主要存在于神經(jīng)的雪旺細胞和髓鞘成份中，近期研究顯示經(jīng)化學(xué)處理的去細胞異體神經(jīng)可有效降低移植后的免疫反應(yīng)并促進神經(jīng)軸突向遠端生長［4，5］，從而修復(fù)周圍神經(jīng)的節(jié)段性缺損。因此，化學(xué)去細胞異體神經(jīng)已成為一種具有應(yīng)用前景的自體神經(jīng)替代物，并對其神經(jīng)移植物的保存方法進行了研究［6］。然而，在實驗研究中，對下述兩個問題尚未進行深入研究：(1)較長節(jié)段神經(jīng)的化學(xué)去細胞處理是否會造成神經(jīng)斷端與神經(jīng)中段質(zhì)量的差異；(2)在大型動物神經(jīng)缺損修復(fù)中有效的長度范圍為多少。上述問題的研究對制備較長的去細胞神經(jīng)移植物和選擇修復(fù)神經(jīng)缺損的長度具有重要意義。

1 材料與方法

11 儀器及試劑

Medtronic Keypoint肌電圖儀(丹麥)，恒溫振蕩器(回旋式，上海)，Triton X100(Sigma，美國)，脫氧膽酸鈉(Sigma，美國) 。

12 犬化學(xué)去細胞神經(jīng)的制備

已行鈷―鉻―鉬人工假體體內(nèi)植入實驗并準(zhǔn)備取材的實驗犬6條，體重在24～26 kg，用速眠新100 mg肌注后全麻安樂死，取雙側(cè)全長的坐骨神經(jīng)干，每條坐骨神經(jīng)長約12 cm。將切取的全長犬坐骨神經(jīng)標(biāo)記遠近端后，按下述順序進行化學(xué)處理：(1)蒸餾水浸浴12 h；(2)50％Triton X100消化12 h;(3)蒸餾水浸浴3h；(4)50％脫氧膽酸鈉消化12 h；(5)重復(fù)前述步驟；(6)蒸餾水浸浴3 h；(7)萃取神經(jīng)在4℃、 pH 72無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)暫時保存；(8)將處理好的去細胞神經(jīng)組織和Hank’s液一起用雙層無毒塑料袋進行分裝，在250 KGy的γ射線下進行輻照滅菌，放置在4℃冰箱中備用。

13 去細胞神經(jīng)的組織學(xué)評價

去細胞處理后的神經(jīng)組織，將每一神經(jīng)段按等比例分為6小段，每小段長為20 mm，石蠟包埋，做5 μm厚橫向和縱向組織學(xué)切片，進行HE染色觀察去細胞程度及纖維管道結(jié)構(gòu)完整性、Fast blue染色觀察髓鞘成分。按照表1的標(biāo)準(zhǔn)進行去細胞神經(jīng)的質(zhì)量評價。每段隨機取3張切片進行觀察，取其均值單項計分。

14 去細胞異體神經(jīng)移植試驗

健康雜種犬12只，雌雄不分，體重243～266 kg，隨機分成2組，8 cm移植組和10 cm移植組，每組 6只。用25％戊巴比妥鈉(10 mg／kg體重)靜脈注射進行麻醉。在無菌條件下右股后切口顯露坐骨神經(jīng)干。在坐骨神經(jīng)干中段分別銳性切除7、9 cm長的神經(jīng)節(jié)段，自然回縮造成8、10 cm長的神經(jīng)缺損。分別用8、10 cm長的化學(xué)去細胞同種異體神經(jīng)進行移植橋接神經(jīng)缺損，用8-0無創(chuàng)尼龍線行神經(jīng)外膜縫合，環(huán)形縫合6針。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，觀察期12個月。

15 體內(nèi)移植實驗觀察

151 一般觀察 觀察移植后切口愈合及肢體功能恢復(fù)。

152 神經(jīng)電生理觀察 用丹麥產(chǎn)Medtronic Keypoint便攜式肌電圖儀進行運動和感覺誘發(fā)電位的檢測。隨機選取左側(cè)非手術(shù)側(cè)肢體5例作為正常值對照。在全麻下手術(shù)切開顯露待測神經(jīng)。

在進行運動誘發(fā)電位檢查時，將刺激電極放置在移植段神經(jīng)近側(cè)2 cm的正常神經(jīng)上，記錄電極放置在小腿三頭肌上，通過給予相同劑量的方波刺激比較兩組實驗動物在運動誘發(fā)電位波幅和時限上的區(qū)別。左側(cè)肢體電極放置在相應(yīng)位置，刺激參數(shù)為：10～20 mA，01 ms，10 Hz。

在進行感覺誘發(fā)電位觀察時，刺激電極放置在踝關(guān)節(jié)部的脛神經(jīng)上，記錄電極放置在移植段近側(cè)的正常神經(jīng)上。刺激參數(shù)為50～100 mA，02 ms，19 Hz。

運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢查時，在移植側(cè)，近端刺激電極位于移植段近端吻合口近側(cè)2 cm處，遠端記錄電極位于移植段遠端吻合口遠側(cè)2 cm處，兩實驗組距離分別為12、14 cm。在對照側(cè)，兩點位于與右側(cè)相應(yīng)部位的坐骨神經(jīng)干上，間距10 cm。刺激參數(shù)為10～20 mA，02 ms，10 Hz，肌電圖儀自動記錄并計算運動傳導(dǎo)速度。

153 再生神經(jīng)的組織學(xué)觀察 在過量麻醉藥物的作用下處死實驗犬并即刻觀察取材。對實驗組全部動物的移植段神經(jīng)的近側(cè)吻接口、移植段中央、遠側(cè)吻接口、移植段遠側(cè)神經(jīng)和神經(jīng)支配區(qū)域的靶肌肉進行神經(jīng)再生的組織學(xué)觀察。

1531 HE染色 將切取的移植神經(jīng)及兩端各1 cm正常神經(jīng)取出后浸于4％多聚甲醛水溶液中固定24 h，經(jīng)脫水處理后分段用石蠟進行包埋，連續(xù)組織學(xué)切片，切片厚度為5 μm，蘇木素-伊紅染色后觀察組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，再生神經(jīng)纖維和細胞浸潤情況。

1532 S-100免疫組化染色 標(biāo)本為石蠟包埋，切片厚度5 μm。Ⅰ抗為兔抗S-100蛋白抗體，Ⅱ抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體。用于觀察再生神經(jīng)中的許旺細胞的分布情況，特別是移植段神經(jīng)中許旺細胞的分布。

1533 美藍復(fù)紅染色 在移植段中央和移植段遠側(cè)的神經(jīng)中各取2 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊用05％戊二醛固定24 h，樹脂包埋后用于半薄切片美藍復(fù)紅染色，切片厚度2 μm，染色后觀察有髓神經(jīng)纖維。

1534 透射電鏡觀察 將經(jīng)05％戊二醛固定后樹脂包埋的神經(jīng)組織行超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色。在SEM透射電鏡下觀察再生神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)。

1535 靶肌肉運動終板染色 在脛神經(jīng)進入小腿三頭肌肌腹部位切取3 mm厚的肌肉塊，在含1％氯化鈣的 10％福爾馬林水溶液中固定24 h，取出后放置在蔗糖-凝膠溶液中，行冰凍切片，切片厚度為30 μm。用膽堿酯酶法進行運動終板染色，觀察靶肌肉中再生的運動終板的形態(tài)。每張切片隨意選3個視野計數(shù)運動終板數(shù)量，取其平均數(shù)。

16 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 115統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，組間對比用成對資料的t檢驗，P

2 結(jié) 果

21 去細胞神經(jīng)各段間組織學(xué)觀察結(jié)果

神經(jīng)全長從近端到遠端去細胞完全，評分均為0分；在結(jié)構(gòu)觀察中，除第2段為0分外，其余5段均為1分，存在輕度的結(jié)構(gòu)破壞：觀察髓鞘染色強度，神經(jīng)全長均為1分，仍殘留少部分髓鞘成分。綜合評分第1段為2分，第2段1分，第3段到第6段均為2分，神經(jīng)全長各段經(jīng)去細胞處理后綜合評分相似（見表1）。 表1 化學(xué)去細胞神經(jīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

22 移植動物一般情況和功能觀察

8 cm組有1犬在移植后3個月并發(fā)肺部感染死亡。10 cm組有1犬在4個半月腹瀉死亡。其余動物均存活至觀察期滿。 在8 cm組實驗犬在移植術(shù)后3個月時均有不同程度運動功能的恢復(fù)，至6個月時恢復(fù)了較好的行走功能，但是外觀上仍有輕微的跛行，12個月時在行走過程中踝關(guān)節(jié)可以完全直立和有較好的背屈。10 cm組在6個月時也有不同程度的下肢功能恢復(fù)，但是進展較慢，移植后12個月踝關(guān)節(jié)仍不能直立或爪背著地。

23 神經(jīng)電生理觀察

在移植段近側(cè)的正常神經(jīng)上給予電刺激時，8 cm組和10 cm組均在小腿三頭肌上記錄到誘發(fā)的運動神經(jīng)傳導(dǎo)電位。如表2所示移植術(shù)后12個月記錄到的運動誘發(fā)電位時限和波幅的區(qū)別，8 cm組的波幅高于10 cm組(t=3286，P

24 再生神經(jīng)組織學(xué)觀察

大體上觀察，8 cm組在局部切開檢查時，移植段神經(jīng)與周圍組織有輕微的短縮，可見移植段神經(jīng)有良好的連續(xù)性，無明顯變細變硬。神經(jīng)與周圍組織有少量的粘連，再血管化良好。近側(cè)和遠側(cè)吻接口無神經(jīng)瘤形成。神經(jīng)支配區(qū)的肌肉組織有輕度萎縮。10 cm組在切開檢查時，可見移植段神經(jīng)的遠側(cè)段明顯變細變硬，但是仍然保持連續(xù)性，神經(jīng)與周圍組織有粘連，神經(jīng)支配區(qū)肌肉萎縮明顯。 表2 去細胞異體神經(jīng)移植術(shù)后12個月肌電圖結(jié)果光鏡下，在兩組移植段神經(jīng)內(nèi)均有S-100表達陽性的雪旺細胞，沿神經(jīng)纖維方向呈帶狀排列(圖1)，8 cm組的數(shù)量多于10 cm組。移植段以遠的神經(jīng)內(nèi)亦可見到雪旺細胞增殖成帶，神經(jīng)橫切面顯示有再生的神經(jīng)纖維，8 cm組優(yōu)于10 cm組，在10 cm組可見較多神經(jīng)束呈脫髓鞘改變。

運動終板染色顯示在神經(jīng)支配區(qū)的小腿三頭肌中可以見到重新形成的運動終板結(jié)構(gòu)，兩組實驗犬在運動終板數(shù)量上有較明顯的差別，8 cm組再生的運動終板數(shù)量多于10 cm組，終板的形態(tài)也優(yōu)于10 cm組(圖2)。每個高倍視野下的運動終板的數(shù)量在8 cm組明顯多于10 cm組，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P10 cm組。但是兩組終板和正常的終板結(jié)構(gòu)相比不管是在終板的數(shù)量還是在終板的縱橫徑上均有差別(P

電鏡下8 cm組移植段神經(jīng)內(nèi)可見由雪旺細胞形成的髓鞘和有髓神經(jīng)纖維，同時可見大量的無髓神經(jīng)纖維呈束狀分布(圖3)；10 cm組移植段神經(jīng)內(nèi)也有少量有髓神經(jīng)纖維形成。表3 去細胞異體神經(jīng)移植術(shù)后小腿三頭肌運動終板測量

3 討 論

在異體神經(jīng)移植的研究中，雖然經(jīng)凍融處理、放射處理和化學(xué)處理后的異體神經(jīng)均具有促進神經(jīng)再生的功能，但由于凍融處理及放射處理的神經(jīng)細胞碎片仍殘存在神經(jīng)的基底板層管內(nèi)，妨礙神經(jīng)軸突向遠端的延伸，因此修復(fù)神經(jīng)缺損的距離一般較短。而化學(xué)處理后的異體神經(jīng)在降低免疫原性的同時，保留了神經(jīng)纖維管道的結(jié)構(gòu)完整性，其內(nèi)部細胞碎片已被清除，去除了軸突生長的障礙，因此可用于修復(fù)較長距離的神經(jīng)缺損。但在化學(xué)去細胞處理過程中，當(dāng)為修復(fù)較長距離的神經(jīng)缺損而處理較長神經(jīng)段時，神經(jīng)的兩端與中央部位是否存在質(zhì)量差異，對修復(fù)神經(jīng)缺損有較大的影響?；瘜W(xué)浸提液是從神經(jīng)的兩端還是透過神經(jīng)外膜對神經(jīng)進行去細胞處理存在爭議。實驗中從去細胞程度、髓鞘提取的程度及神經(jīng)纖維管道的完整程度進行評價。結(jié)果顯示在長12 cm的神經(jīng)段中，經(jīng)化學(xué)去細胞處理后，神經(jīng)的中央部分與兩端的各段間在上述三個方面的綜合評價中無差異，說明對同等粗細的神經(jīng)其長度并不影響其神經(jīng)移植物的質(zhì)量，由此可以推斷化學(xué)浸提液并非從神經(jīng)的兩端而是從神經(jīng)的外膜開始進行去細胞處理。故在用相同的浸提液及處理程序進行去細胞處理時，神經(jīng)的長度對神經(jīng)移植物質(zhì)量無影響。

雖然在理論上可以應(yīng)用化學(xué)去細胞的方法處理任意長度的神經(jīng)，但在實驗及臨床應(yīng)用中移植長度仍然影響肢體功能康復(fù)的結(jié)果。在早期的研究中應(yīng)用化學(xué)去細胞異體神經(jīng)較滿意修復(fù)了犬5 cm長的坐骨神經(jīng)缺損［7］。在應(yīng)用相同方法處理的犬的化學(xué)去細胞異體神經(jīng)移植實驗中，對犬的8、10 cm 長的坐骨神經(jīng)缺損用化學(xué)去細胞同種異體神經(jīng)進行移植修復(fù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在8 cm長的坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)組，無論是肢體功能的大體觀察還是電生理的觀察，均恢復(fù)較好。運動神經(jīng)的波幅已達正常神經(jīng)的50％，神經(jīng)傳導(dǎo)速度達到正常神經(jīng)的30％；而在10 cm長的神經(jīng)移植組，功能恢復(fù)較差，肌電圖波幅及運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度均未達到正常神經(jīng)的20％。再生神經(jīng)的組織學(xué)觀察顯示8 cm長的去細胞神經(jīng)移植組在雪旺細胞、有髓神經(jīng)纖維的分布及運動終板的數(shù)量和形態(tài)方面均明顯優(yōu)于10 cm移植組。

在8、10 cm神經(jīng)移植組，其移植物本身的質(zhì)量無差異，但最終結(jié)果具有明顯的差異。產(chǎn)生這種差異的原因不在移植物本身，而與神經(jīng)缺損的距離有關(guān)。Haase等［8］用去細胞異體神經(jīng)橋接大鼠腓神經(jīng)缺損，研究顯示去細胞異體神經(jīng)可以修復(fù)2 cm的周圍神經(jīng)缺損，當(dāng)缺損>4 cm時未出現(xiàn)功能恢復(fù)，并認(rèn)為生長因子可能有助于修復(fù)較長的神經(jīng)缺損。但在隨后的實驗中應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子與去細胞異體神經(jīng)復(fù)合后移植修復(fù)神經(jīng)缺損，僅表現(xiàn)出促進近端吻合口軸突的生長，并未顯出促使神經(jīng)軸突延長的作用［9］。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是生長因子雖有促神經(jīng)再生的作用，但在修復(fù)區(qū)內(nèi)未能呈現(xiàn)生理環(huán)境下的濃度梯度變化，故軸突的生長方向受到干擾。在周圍神經(jīng)損傷后，靶器官通過神經(jīng)遠端釋放不同的生物因子，發(fā)揮化學(xué)趨化作用，促使神經(jīng)軸突向遠端生長。生物因子的濃度呈現(xiàn)明顯的梯度改變趨勢，隨距離的增加，生物因子的濃度發(fā)生明顯的變化，從而影響神經(jīng)的再生速度及肢體功能康復(fù)。因此，在使用生長因子促使神經(jīng)向遠端生長時應(yīng)考慮其作用環(huán)節(jié)及濃度梯度變化。

本研究證實神經(jīng)的長度并不影響化學(xué)去細胞神經(jīng)制備的質(zhì)量，在應(yīng)用去細胞異體神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損中，8 cm或許是目前單獨使用化學(xué)去細胞異體神經(jīng)移植取得較好結(jié)果的最大范圍。為修復(fù)更大范圍的神經(jīng)缺損，應(yīng)探討神經(jīng)遠端的生物因子表達分布規(guī)律，利用化學(xué)趨化原理促進神經(jīng)的快速生長。

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