導(dǎo)語：如何才能寫好一篇單細(xì)胞研究，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公文云整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

關(guān)鍵詞：固態(tài)發(fā)酵；單細(xì)胞蛋白；影響因素；單菌；混合菌

中圖分類號 S816.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號 1007-7731（2015）19-105-04

Study on the Process of Producing Single Cell Protein Feed by the Skin of Grapefruit

Zhang Haitao1，2 et al.

（1 Hunan Agricultural University，Changsha 41000，China；2 Hunan University of Science and Engineering，Yongzhou 425000，China）

Abstract：Taking grapefruit bran as raw material，koningii，white mold，yeast，geotrichum as fermentation bacteria.through the standard curve with ovalbumin and Biuret reagent. the paper probed the single cell protein content after solid-state fermentation of single strain and mixed strain. It was found that the combination of Geotrichum with koningii has the best fermentation effect，and after 7d fermentation the medium content 8.060g protein，accounting for about 19% of the dry weight of the medium.Fermentation affected by the temperature，pH，inoculum size，medium’s water content. The orthogonal experiment showed that the combination of Geotrichum with koningii ’s best fermentation condition ，the optimum pH value is 5.5，the optimum fermentation temperature is 25℃，the optimum inoculation amount is 15%，the optimum medium moisture content is 65%. The impact of various factors on fermentation is fermentation temperature>medium’s water content> inoculation amount>pH.

Key words： Solid state fermentation；Single cell protein；Influencing factors；Single strain；Mixed strain

傳統(tǒng)柚子果實(shí)加工后剩下的大量柚子皮往往被隨意丟棄或集中作一般處理，對環(huán)境造成污染的同時(shí)也造成了資源浪費(fèi)。研究表明，柚子皮中含有5%的果膠，還含有豐富的油皮苷、胡蘿卜素、VB、VC、VP以及有機(jī)酸和高級醇，并且可以提取精油、柚苷[1]，因此柚子皮可以作為一種發(fā)酵基質(zhì)，為微生物的生長提供豐富的營養(yǎng)成分。單細(xì)胞蛋白所含的物質(zhì)成分豐富，被廣泛用于飼料加工中，通過柚子皮渣固態(tài)發(fā)酵來生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，從而提高柚子皮中粗蛋白含量，使柚子皮作為一種飼料供動(dòng)物食用，同時(shí)解決了廢棄柚子皮渣對環(huán)境的污染，具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本研究以柚子皮渣為原料，以白地霉、酵母菌、產(chǎn)朊假絲酵母、康寧木霉單菌種以及它們的混合菌種為發(fā)酵菌種[2]，篩選出最佳混菌組合以及最佳發(fā)酵條件，對提高柚子皮渣固態(tài)發(fā)酵效率和粗蛋白產(chǎn)量，以及保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 （1）牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基：在燒杯內(nèi)加蒸餾水100mL，放入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化鈉0.5g，瓊脂1.5g。燒杯外標(biāo)記，加熱溶解后加入瓊脂，不斷攪拌以免粘底。等瓊脂完全溶解后補(bǔ)足失水，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調(diào)整pH值為5.0～6.5，分裝在各個(gè)試管內(nèi)，高壓蒸汽鍋內(nèi)121℃滅菌30min，室溫后倒入試管制成斜面（8個(gè)），冷卻后保存?zhèn)溆?。?）液體牛肉膏培養(yǎng)基制備：在燒杯內(nèi)加蒸餾水100mL，放入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化鈉0.5g。燒杯外標(biāo)記，加熱溶解，補(bǔ)足失水，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調(diào)整pH值為5.0～6.5，分裝于8個(gè)三角瓶中，高壓蒸汽鍋內(nèi)121℃滅菌30min，冷卻至室溫后備用。（3）柚子皮渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備：柚皮渣80g，麩皮20g，尿素1.5g，硫酸銨1.5g，磷酸氫二鉀0.6g，硫酸鎂0.05g，水65～70g，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調(diào)pH值為5.0～6.5，高壓蒸汽鍋內(nèi)121℃滅菌20min。

1.1.2 主要試劑與儀器 硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂為分析純，購于上海永葉生物科技有限公司；其它化學(xué)試劑均為分析純。TG16C/TG16臺(tái)式高速離心機(jī)，PHS-802中文臺(tái)式酸度計(jì)，722型分光光度計(jì)等。

1.1.3 菌種 4株菌株都為真菌，分別為白地霉（Geotrichum candidum）；產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）；康寧木霉（Corning Trichoderma）；酵母菌（Yeast）。從武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）購買，放冰箱冷凍保藏備用。

1.1.4 柚皮渣與麩皮來源 柚子為江永的香柚，將柚子洗干凈剝開，取其柚子皮（果實(shí)以外的部分）用刀切成小塊狀，然后放入干燥箱里烘干至恒量，用研缽研碎，過100目篩，放干燥處室溫保存?zhèn)溆?。所用的麩皮從永州市零陵區(qū)的農(nóng)產(chǎn)品市場購買，然后經(jīng)過20目篩篩選后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 雙縮脲試劑的配制 將1g氫氧化鈉溶于10mL水中，制成雙縮脲試劑A；將0.1g硫酸銅溶于10mL水中，制成雙縮脲試劑B。

1.2.2 菌種的活化與保藏 將冷凍保存的4菌株接種于4個(gè)斜面培養(yǎng)基上活化，在22～35℃條件下培養(yǎng)48h，再將斜面菌種挑取一環(huán)接于液體試管培養(yǎng)基中，22～35℃培養(yǎng)48h，作為一級種子培養(yǎng)基；以10%接種量接入裝液量20mL/50mL于三角瓶液體培養(yǎng)基中，于22～35℃ 240r?min-1振蕩培養(yǎng)24h，作為二級種子培養(yǎng)基，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用卵清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取卵清蛋白，以蒸餾水為溶液配制成2.0mg?mL-1的蛋白質(zhì)溶液，取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL分別注入7支比試管中，先加入雙縮脲試劑A再加入雙縮脲試劑B，在15～25℃下放置30min，以介質(zhì)溶液調(diào)零，測定標(biāo)準(zhǔn)液在560nm處的吸光度。

1.2.4 單菌種的發(fā)酵 用移液槍分別取4種二級種子培養(yǎng)液各4mL接種于4個(gè)不同的已滅菌的柚皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上（每取不同菌種時(shí)更換一次槍頭），置于22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，以粗蛋白質(zhì)含量為檢測指標(biāo)，分析各個(gè)菌種發(fā)酵前后產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量的變化情況。

1.2.5 組合菌株的發(fā)酵 （1）雙菌種的發(fā)酵。將4菌株分別“兩兩組合”，同時(shí)按1∶1的比例各取2mL二級種子培養(yǎng)液接種于已滅菌的柚皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上（每取不同菌種時(shí)更換一次槍頭）置于22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，記錄數(shù)據(jù)。（2）3菌種的發(fā)酵。將4菌株分別“三三組合”，同時(shí)按1∶1∶1的比例各取1.3mL二級種子培養(yǎng)液接種于已滅菌的柚皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上（每取不同菌種時(shí)更換一次槍頭）置于22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，記錄數(shù)據(jù)。（3）4菌種的發(fā)酵。將4菌株分別按1∶1∶1∶1的比例各取1mL二級種子培養(yǎng)液接種于已滅菌的柚皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上（每取不同種菌種時(shí)更換一次槍頭）置于22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒量。

1.2.6 粗蛋白質(zhì)含量的測定 （1）單菌種發(fā)酵培養(yǎng)皿中粗蛋白質(zhì)含量的測定：從單菌種發(fā)酵的4個(gè)培養(yǎng)皿中取烘干之后的培養(yǎng)物各5g，分別用研缽研碎后倒入試管中，然后滴加95%乙醇，搖晃試管5min，取上清液于離心管中，反復(fù)3次，離心完成之后倒掉液體，先加入雙縮脲試劑A再加入雙縮脲試劑B（共2mL，A∶B=3∶1），搖晃離心管，然后將雙縮脲倒入分光光度計(jì)玻璃柱中進(jìn)行檢測。（2）組合菌種發(fā)酵培養(yǎng)皿中粗蛋白質(zhì)含量的測定：從組合菌種發(fā)酵的4個(gè)培養(yǎng)皿中取烘干之后的培養(yǎng)物各5g，分別用研缽研碎后倒入試管當(dāng)中，然后滴加95%乙醇，搖晃試管5min，取上清液于離心管中，反復(fù)3次，離心完成后倒掉液體，先加入雙縮脲試劑A再加入雙縮脲試劑B（共2mL，A∶B=3∶1），搖晃離心管，然后將雙縮脲倒入分光光度計(jì)玻璃柱中進(jìn)行檢測。

1.2.7 發(fā)酵因子對最佳菌種組合產(chǎn)粗蛋白質(zhì)量的影響[3-4]

1.2.7.1 發(fā)酵溫度 按1∶1取相同體積的康寧木霉與白底霉菌溶液各2mL混合，平均加入到7個(gè)已滅菌的固態(tài)柚子皮渣培養(yǎng)基中，分別放入溫度為10、15、20、25、30、35、40℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，檢測不同溫度產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量。

1.2.7.2 發(fā)酵pH值 按1∶1取相同體積的康寧木霉與白底霉溶液各2mL混合，平均加入到7個(gè)已滅菌的固態(tài)柚子皮渣培養(yǎng)基中，分別調(diào)節(jié)pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5后放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，檢測不同pH值條件下產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量。

1.2.7.3 接種量 按照1∶1取相同體積的康寧木霉與白底霉溶液分別以接種量10%、15%、20%、25%、30%對固態(tài)柚子皮渣培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，調(diào)pH值為5.5，放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，檢測產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量。

1.2.7.4 培養(yǎng)基的含水量 按1∶1取相同體積的康寧木霉與白底霉溶液各2mL，平均加入到7個(gè)已滅菌的固態(tài)柚子皮渣培養(yǎng)基中（pH值為5.5），分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)中的含水量為50%、55%、60%、65%、70%，放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，檢測產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量。

1.2.8 正交實(shí)驗(yàn) 發(fā)酵溫度、pH值、接種量、培養(yǎng)基的含水量都對菌種的生長代謝產(chǎn)生影響，通過取4因素（溫度、pH、目篩目數(shù)、含水量）3水平的正交實(shí)驗(yàn)來確定最佳發(fā)酵條件組合[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用卵清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)樣品來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計(jì)算稱量后，準(zhǔn)確稱取卵清蛋白，以蒸餾水為溶液配制成2mg?mL-1的蛋白質(zhì)溶液，分別取出0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL注入7支比試管中，先加入雙縮脲試劑A再加入雙縮脲試劑B（共2mL，A∶B=3∶1），在15～25℃下放置30min，調(diào)零，測定560nm處的吸光度依次為0、0.182、0.311、0.453、0.581、0.705、0.837，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

[y=0.4556x+0.0284

R2=0.9969][標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液體積（mL）][吸光度（A）][1

0.8

0.6

0.4

0.2

0][0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1]

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 粗蛋白質(zhì)的檢測結(jié)果 根據(jù)測得的吸光度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測液濃度值，經(jīng)換算可得粗蛋白產(chǎn)量。

2.2.1 單菌種發(fā)酵后粗蛋白的檢測結(jié)果 康寧木霉、產(chǎn)阮假絲酵母、酵母菌、白地霉4菌種分別發(fā)酵后的粗蛋白含量為5.377g、4.723g、4.197g、6.316g，白地霉發(fā)酵獲得的粗蛋白含量最高，達(dá)到6.316g。

2.2.2 混合菌種發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量的檢測結(jié)果 不同菌種混合在相同條件下發(fā)酵后的粗蛋白含量如表1所示，從表1可知，11組混合菌中，白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵產(chǎn)生的粗蛋白含量最高，達(dá)到8.060g。

表1 不同混菌組合發(fā)酵后產(chǎn)生的粗蛋白質(zhì)含量

[菌種組合＼&粗蛋白質(zhì)含量（g）＼&產(chǎn)阮假絲酵母+酵母菌＼&5.589＼&白地霉+康寧木霉＼&8.060＼&康寧木霉+酵母菌＼&5.786＼&白地霉+產(chǎn)阮假絲酵母＼&7.155＼&白地霉+酵母菌＼&4.098＼&康寧木霉+產(chǎn)阮假絲酵母＼&4.240＼&康寧木霉+產(chǎn)阮假絲酵母+酵母菌＼&4.125＼&康寧木霉+白地霉+酵母菌＼&5.554＼&產(chǎn)阮假絲酵母+酵母菌+白地霉＼&5.506＼&康寧木霉+產(chǎn)阮假絲酵母+白地霉＼&5.272＼&康寧木霉+產(chǎn)阮假絲酵母+白地霉+酵母菌＼&6.650＼&]

2.2.3 白地霉與康寧木霉混合固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)粗蛋白的影響因子分析 白地霉與康寧木霉組合在同等條件下固態(tài)發(fā)酵后所產(chǎn)粗蛋白含量最高，取該菌種組合進(jìn)行影響因子分析，探尋該菌種組合最佳固態(tài)發(fā)酵條件。

2.2.3.1 不同溫度對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響 分別以10、15、20、25、30、35、40℃進(jìn)行分組發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵后培養(yǎng)基中粗蛋白的含量如圖2所示，從圖2可知，當(dāng)溫度為10～25℃時(shí)，發(fā)酵后產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量不斷增加，且溫度為25℃時(shí)，產(chǎn)物中粗蛋白含量為最高，達(dá)到8.46g；當(dāng)溫度為25～40℃時(shí)，發(fā)酵后產(chǎn)物中的粗蛋白含量呈下降趨勢，且溫度在35～40℃范圍內(nèi)下降得最為明顯。因此，可認(rèn)定25℃為康寧木霉與白地霉菌種組合的最佳反應(yīng)溫度。

[粗蛋白含量（g）][10

8

6

4

2

0][0 10 20 30 40 50][溫度（℃）][1.331][5.321][7.941][8.460][7.772][7.125][3.125]

圖2 溫度對白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響

2.2.3.2 不同pH值對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響 pH值對白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響如圖3所示。從圖3可知，該菌種組合發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量在pH值4～4.5以及5.5～7之間出現(xiàn)先增長后減少的趨勢，而在pH值為5.5時(shí)發(fā)酵后的粗蛋白產(chǎn)量最高，達(dá)到8.161g。因此，可得出pH5.5為康寧木霉與白地霉組合菌種的最佳反應(yīng)酸堿度。

[9

8

7

6

5][粗蛋白含量（g）][4.5 5 5.5 6 6.5 7][pH值][5.321][6.941][8.161][7.027][6.125]

圖3 pH值對白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響

2.2.3.3 不同接種量對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響 通過接種量的改變，來檢測不同接種量對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響。從圖4可知，該組合菌種固態(tài)發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白產(chǎn)量隨著接種量的改變而改變，當(dāng)接種量為15%時(shí)，最有利于發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白的產(chǎn)生。

[8.4

8.2

8

7.8

7.6

7.4][粗蛋白含量（g）][10 15 20 25 30 35][接種量（%）][7.43][8.25][8.11][7.92][7.82]

圖4 接種量對白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響

2.2.3.4 不同培養(yǎng)基含水量對發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響 不同培養(yǎng)基含水量對發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響如圖5所示，從圖5可知，培養(yǎng)基含水量在50%～70%，該組合菌種發(fā)酵后產(chǎn)物中產(chǎn)粗蛋白的量都比較高，當(dāng)培養(yǎng)基含水量為65%時(shí)，發(fā)酵后產(chǎn)物中的粗蛋白產(chǎn)量最高，達(dá)到8.075g。這是因?yàn)橛绊懝虘B(tài)發(fā)酵速率的因素與是否有游離水的存在相關(guān)，因此基質(zhì)含水量的變化對微生物的代謝與生長產(chǎn)生重要的影響。戴超[4]在影響固態(tài)發(fā)酵速率的因素及其控制策略中通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)，可知培養(yǎng)基含水量在65%為康寧木霉與白地霉組合菌種的最佳反應(yīng)環(huán)境。

[9

8.58

7.5

7

6.5][粗蛋白含量（g）][50 55 60 65 70 75][培養(yǎng)基含水量（%）][6.845][7.883][8.102][8.705][8.012]

圖5 培養(yǎng)基含水量對地霉與康寧木霉組合發(fā)酵后產(chǎn)物中

粗蛋白含量的影響

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 取4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)確定最佳發(fā)酵組合如表2所示，從表2可知，最適水平最佳配比組合為A2B2C3D2。從正交表數(shù)據(jù)可知，溫度25℃、pH值5.5、最佳接種量為15%、培養(yǎng)基含水量65%為最佳條件組合，由R值可知，各因素對發(fā)酵的影響大小為發(fā)酵溫度>培養(yǎng)基含水量>接種量>pH。

表2 4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

[試驗(yàn)號＼&溫度

（℃）＼&pH＼&接種量

（%）＼&培養(yǎng)基含

水量（%）＼&粗蛋白質(zhì)量（g）＼&1＼&1（15）＼&1（4.5）＼&1（10）＼&1（60）＼&6.026＼&2＼&1（15）＼&2（5.5）＼&2（15）＼&2（65）＼&7.161＼&3＼&1（15）＼&3（6.5）＼&3（20）＼&3（70）＼&8.072＼&4＼&2（25）＼&1（4.5）＼&2（15）＼&3（65）＼&8.883＼&5＼&2（25）＼&2（5.5）＼&3（20）＼&1（60）＼&8.436＼&6＼&2（25）＼&3（6.5）＼&1（15）＼&2（65）＼&6.535＼&7＼&3（35）＼&1（4.5）＼&3（20）＼&2（65）＼&4.323＼&8＼&3（35）＼&2（6.5）＼&1（10）＼&3（70）＼&4.251＼&9＼&3（35）＼&3（6.5）＼&2（15）＼&1（60）＼&3.377＼&Ⅰ＼&14.564＼&13.936＼&16.812＼&17.839＼&T=57.064＼&Ⅱ＼&25.391＼&19.232＼&19.421＼&18.019＼&Ⅲ＼&11.911＼&17.984＼&20.831＼&21.206＼&K1＼&4.854＼&4.312＼&5.604＼&4.170＼&K2＼&8.463＼&6.410＼&6.474＼&6.999＼&K3＼&3.970＼&5.995＼&6.944＼&7.069＼&R＼&4.493＼&2.098＼&1.340＼&2.899＼&]

3 結(jié)論

（1）白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母、康寧木霉與酵母菌分別發(fā)酵培養(yǎng)后產(chǎn)生的粗蛋白含量為5.377g、4.723g、4.197g、6.316g，白地霉發(fā)酵后產(chǎn)生的粗蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到6.316g。

（2）白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母、康寧木霉與酵母菌分別進(jìn)行2菌種、3菌種以及4菌種混合固態(tài)發(fā)酵，檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)康寧木霉與白地霉混合柚子皮渣生產(chǎn)蛋白質(zhì)量高，達(dá)到8.060g，占培養(yǎng)基干重的19%左右。

（3）正交實(shí)驗(yàn)采用3水平（溫度：A1=15℃，A2=25℃，A3=35℃；pH值：B1=4.5，B2=5.5，B3=6.5；接種量：C1=10%，C2=15%，C3=20%；培養(yǎng)基含水量：D1=60%，D2=65%，D3=70%）4因素（發(fā)酵溫度，pH，接種量，培養(yǎng)基含水量）進(jìn)行設(shè)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)康寧木霉與白地霉菌種混合組最佳條件組合為A2B2C3D2，即在溫度25℃、pH5.5、接種量15%、培養(yǎng)基含水量65%的條件下最有利于柚子皮渣培養(yǎng)基的發(fā)酵。

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篇2

摘要：目的：探討人臍血單個(gè)核細(xì)胞的分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)后神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物mRNA的表達(dá)，并觀察其致瘤性。方法：使用密度梯度離心法得到臍血單個(gè)核細(xì)胞，用體外貼壁生長的方法獲得臍血間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。觀察培養(yǎng)過程中臍血MSCs形態(tài)的變化，通過流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。使用NGF和RA聯(lián)合誘導(dǎo)后，用RT―PCR方法鑒定誘導(dǎo)前后神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)標(biāo)志物巢蛋白(Nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表達(dá)；收集培養(yǎng)后7d的MSCs，接種于裸鼠皮下，觀察是否有增生物的出現(xiàn)，并觀察細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：臍血單個(gè)核細(xì)胞貼壁生長后大部分細(xì)胞呈梭形，誘導(dǎo)后可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測該細(xì)胞不表達(dá)CD34，CDlla和CD11b，強(qiáng)表達(dá)CD29，符合MSCs特征。誘導(dǎo)后，NSCs表面標(biāo)志Nestin及Musshi-1表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，48h達(dá)高峰，然后逐漸減弱：細(xì)胞接種后12周，在裸鼠皮下不能形成腫瘤，與對照組相比，細(xì)胞形態(tài)學(xué)未出現(xiàn)惡性變化。結(jié)論：臍血中存在MSCs。分離后可以體外擴(kuò)增，誘導(dǎo)后分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并表達(dá)NSCs表面標(biāo)志。在裸鼠體內(nèi)不具有成瘤性。臍血能夠成為NSCs的新來源。

關(guān)鍵詞：臍血單個(gè)核細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞；誘導(dǎo)分化；巢蛋白：致瘤性

中圖分類號：R741

干細(xì)胞是指具有自我更新與多向分化潛能的細(xì)胞，它們在細(xì)胞療法、基因治療、發(fā)育學(xué)研究、藥理及毒理學(xué)等研究中己顯示出無可比擬的作用和優(yōu)越性。近年來，神經(jīng)干細(xì)胞fneural stem eells,NSCs)移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起人們的普遍關(guān)注，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得了較好的療效，NSCs被認(rèn)為是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的良好載體。但是，由于來源的局限，NSCs的應(yīng)用受到限制。成體干細(xì)胞是存在于發(fā)育成熟個(gè)體組織中的可自我更新和分化為原組織所有細(xì)胞類型的未分化細(xì)胞。根據(jù)其發(fā)育潛能可分為全能干細(xì)胞、多胚層多能干細(xì)胞、單胚層多能干細(xì)胞和定向?qū)Ｄ芨杉?xì)胞。存在于骨髓基質(zhì)中的間質(zhì)干細(xì)胞(mesenehymal stem cdls,MSCs)是研究最早和最為深入的一類多能干細(xì)胞，其來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有廣泛的分化潛能，已經(jīng)有多項(xiàng)研究顯示，外源骨髓MSCs移植入腦內(nèi)，可以分化為神經(jīng)細(xì)胞。表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志蛋白。因?yàn)槟殠а獊碓吹腗SCs和骨髓MScs有極其一致的生物學(xué)特性，且易于采集、制備及保存。免疫反應(yīng)性低，因此可能更易于在臨床上使用。本研究結(jié)合密度梯度離心和體外貼壁生長的方法得到臍血MSCs，誘導(dǎo)后檢測其NSCs標(biāo)志物Nesfin及Musashi-I的表達(dá)情況，并將培養(yǎng)后的臍血MSCs接種于裸鼠皮下，觀察臍血MSCs對裸鼠的致瘤性，為應(yīng)用于組織及其功能修復(fù)中提高該細(xì)胞的生物安全性提供新的依據(jù)。

1．材料和方法

1．1主垂試劑

高糖IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；淋巴細(xì)胞分層液(Cibco公司)；RNA提取試劑Tfizol(invit-rogen公司)；氯仿、異丙醇為國產(chǎn)分析純試劑；DEPC水(sigma公司)；RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)；瓊脂糖(sigma公司)。

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1臍血間質(zhì)干細(xì)胞的體外分離和擴(kuò)增培養(yǎng)無菌條件下采集健康產(chǎn)婦足月妊娠順產(chǎn)或剖腹產(chǎn)的嬰兒臍帶血50～100md肝素抗凝，與0.01moL/pH7.4的PBS按1:1混勻，再與3％的明膠1:1混勻，靜置60min沉降紅細(xì)胞。吸上清離心，棄上清，用PBS制成單細(xì)胞懸液，疊加到相對密度1.077的淋巴細(xì)胞分離液上，2000dr/min離心20min，取界面層，加PBS制成單細(xì)胞懸液，離心洗滌3次，棄上清。所得細(xì)胞以1.0x102／cm2(T-25培養(yǎng)瓶)的密度接種于含有15％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液(Hyclone公司，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的cm2、飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，3d后換液，棄去懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變并照相。待細(xì)胞長到80％融合時(shí)，用2.5g/L的胰蛋白酶消化后傳代。

收集分離后1h、培養(yǎng)后36、48、72h和5d的細(xì)胞，離心洗滌，在顯微鏡下，臺(tái)盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度備用。

1．2．2流式細(xì)胞儀檢測取擴(kuò)增一代的臍血間質(zhì)干細(xì)胞，PBS洗滌后用2．5 WE的胰蛋白酶消化后制成1:0x106的單細(xì)胞懸液，共7管，1號管和2號管為陰性對照，分別加入抗鼠的IgG-FITC和IgG-PE單克隆抗體各5ml，其余5管分別加入抗人的CD34-PE，CD31-FITC，CDl3-PE，CD29-PE，CD44單抗各5m1．室溫下孵育20min，流式細(xì)胞儀檢測。

1．2．3臍血間質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化取原代細(xì)胞，加入20ng/m1 NGF和RA聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后36、48、72 h、5d的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度備用。

1．2．4 RNA提取取誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后36、48、72h、5d的細(xì)胞各3x106個(gè)，融于1 mlTRIZOL試劑中，用吸管反復(fù)吹打后室溫下孵育5min。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩后室溫下10min。4℃，12000r/min離心15min后將上層無色液體移入新的EP管中。加入異丙醇，室溫下放置10min，4℃，12000r/min離心10min棄去上清。加入75％乙醇，4℃，7500r/min離心5min，棄去上清液，風(fēng)干，加入DEPC處理的純凈水40μl溶解后，55℃孵育15min。

1．2．5 RT-PCR采用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)引物，并由賽百盛生物工程公司合成。Nestin上游引物：5TCCTTTGACTTrCCTTGTC―TACCTCC 3，下游引物：5AAATCTGAAACTCAAGCACCA3：Musashi-l上游引物5TAATTCCTGTCCAGCAGTCTC3：下游引物5GAACCATCCCGTCCTGTATCAT3。對所提RNA進(jìn)行定量，取1μgRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，在EP管中先后加入MgCL2×PCR buffer 1μl，RNase free H2O 3.75μl，dNTP lμ，RNase inhibor0.25μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，oli-．go-dT接頭引物0.5μl，RNA樣品1μg，按照如下條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30℃10min，48℃50min，99℃5min，50℃5min。合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在EP管中依次加入下列物質(zhì)：Taq酶0.25μl，10xPCR buffer10μl，純凈水27.75μl，

特異性上下游引物各0.5μl。內(nèi)對照GAPDH上下游引物各0.5μl(30 μmol/L)，cDNA產(chǎn)物10μl，按照以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。94℃預(yù)變性5min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7min。取5μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣至含溴化乙錠(EB)20g/l的瓊脂糖凝膠中，在5V/cm下電泳60min，紫外透視儀下觀察結(jié)果，并用凝膠掃描成像系統(tǒng)照相，PCR定量分析軟件進(jìn)行分析。

1．2．6致瘤性取18只BALB/C裸鼠，隨機(jī)分為3組，背部皮下組、頸部皮下組、對照組各6只。收集培養(yǎng)7d的MSCs，用PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為1x107/ml，非麻醉狀態(tài)下，于裸鼠背部及頸部皮下分別無菌注射細(xì)胞懸液0.5ml，每只各4點(diǎn)．注入生理鹽水作為對照組。定期觀察，于3d、2周和8周取材，制作冰凍切片，HE染色，鏡下觀察。之后繼續(xù)觀察裸鼠生長情況至12周。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以x＋s表示。采用SPSSl2.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量數(shù)據(jù)的分析，顯著性水準(zhǔn)取α=0.05。

2．結(jié)果

2．1臍血單個(gè)核細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)后形態(tài)改變

培養(yǎng)前，臍血單個(gè)核細(xì)胞胞體較小，呈大小均一的圓形，直徑約17μm，顏色較深，住高倍鏡下可見其不停振動(dòng)；培養(yǎng)后，細(xì)胞胞體增大，有破骨樣細(xì)胞和梭形細(xì)胞兩種形態(tài)。破骨樣細(xì)胞胞體較大，呈圓形，多個(gè)核。梭形細(xì)胞大小不等。形態(tài)類似于骨髓MSCs，但較骨髓MSCs稍小。隨著時(shí)間的推移，破骨樣細(xì)胞減少而梭形細(xì)胞增多，即所需要的間質(zhì)干細(xì)胞

2．2臍血干細(xì)胞的鑒定

流式細(xì)胞儀檢測顯示，擴(kuò)增后的臍血MSCs既不表達(dá)造血干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志CD34，也不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志CD31，而CD29，CDl3，CD44等間質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志均為陽性。這表明臍血MSCs是臍血中一群區(qū)別于造血細(xì)胞的處于未分化狀態(tài)的非定向干細(xì)胞。

2．3誘導(dǎo)后NSCs標(biāo)志物的表達(dá)

Nestin和Musashi-1作為NSCs的標(biāo)志物已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。通過RT-PCR檢測誘導(dǎo)后這兩個(gè)基因的表達(dá)，使用PCR定量分析軟件，分析各樣本的PCR光密度。將各樣本的PCR光密度值除以內(nèi)參GAPDH的PCR平均光密度值，重復(fù)測量5次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nestin RNA在誘導(dǎo)前細(xì)胞中低表達(dá)，誘導(dǎo)后36h逐漸升高(p＜0.05)，72h后開始降低(p＜0.05)：Musashi-1RNA在誘導(dǎo)前細(xì)胞中低表達(dá)，誘導(dǎo)后48h呈高表達(dá)(P＜0.05)。

2．4致瘤性

于注射后3d、2周和8周取材，肉眼觀察裸鼠背部無明顯增生物形成。組織學(xué)觀察接種3d局部有細(xì)胞團(tuán)塊存在，團(tuán)塊中心細(xì)胞部分壞死。2周時(shí)，細(xì)胞團(tuán)塊不明顯，大部分細(xì)胞被吸收。8周時(shí)，接種區(qū)組織結(jié)構(gòu)與未接種區(qū)無明顯區(qū)別。裸鼠存活12周以上，未見有腫瘤形成。與對照組比較，生長情況與皮膚狀況無明顯差別。

3．討論

NSCs具有自我更新和多分化潛能，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病、阿爾海默病、卒中的功能重建帶來了希望。無論是作為腦組織移植的供體，還是作為體內(nèi)誘導(dǎo)分化的靶細(xì)胞，NSCs都為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和神經(jīng)再生提供了一條新的途徑。但NSCs來源有限，不適于展開大規(guī)模臨床應(yīng)用。如何獲取大量的NSC供臨床使用已成為當(dāng)今干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs和造血干細(xì)胞(hematopoldie stem cells，HSCs)可分化成神經(jīng)細(xì)胞。由于臍血MSCs和骨髓MSCs有極其一致的生物學(xué)特性，臍血中的干細(xì)胞可能更原始，增殖分化能力更強(qiáng)；而且臍血來源廣泛、取材方便，所含有的干細(xì)胞數(shù)量更多。因此使用臍血干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為NSCs用于臨床研究有廣闊的應(yīng)前景。

目前國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)使用多種方法從臍血中分離干細(xì)胞，最常用的方法是利用臍血干細(xì)胞體外貼壁生長的特性，將其從造血系統(tǒng)細(xì)胞中分離。此外，還可利用密度梯度離心、流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠等方法。最近，有學(xué)者采用負(fù)極免疫篩選及限制性稀釋的方法，分離得到臍血干細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀和免疫磁珠分離干細(xì)胞，操作方法復(fù)雜，花費(fèi)高昂而且實(shí)驗(yàn)條件要求高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合使用密度梯度離心和體外貼壁生長的方法獲得臍血MSCs，簡單有效，成本低廉，對細(xì)胞損傷小，既適合各級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行基礎(chǔ)研究，也適合大規(guī)模將臍血細(xì)胞分離純化，用于臍血干細(xì)胞建庫㈣，應(yīng)用于臨床。

成功分離臍血干細(xì)胞后，使用NGF和RA聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)，用RT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)志物巢蛋白(Nestin)和Musashi的表達(dá)。NeSin最早由Lendahl等發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)始于神經(jīng)胚形成時(shí)，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞遷移基本完成后，巢蛋白的表達(dá)量逐漸減少，并隨神經(jīng)細(xì)胞分化的完成而停止表達(dá)。此外，Sakakibara等亦鑒定出一種RNA結(jié)合蛋白Musashi，作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物，Nestin和Musashi作為早期原始神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志物已被廣泛地應(yīng)用于NSCs的鑒定。本研究發(fā)現(xiàn)新鮮分離的臍血干細(xì)胞弱表達(dá)Nestin.不表達(dá)Musashi-I；誘導(dǎo)后，臍血干細(xì)胞的Nestin和Musashi-1表達(dá)域逐漸增強(qiáng)，48 h達(dá)到最強(qiáng)，進(jìn)而逐漸減少。這表明臍血細(xì)胞具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能。

篇3

[關(guān)鍵詞]甘草酸；甘草總黃酮；細(xì)胞因子；抗炎

甘草作為常用中藥，活性高、作用廣，具有顯著的抗炎活性[1-3]，臨床用于急慢性肝炎、支氣管炎、銀屑病和艾滋病的治療[4-8]。其中甘草酸和甘草總黃酮類化合物是其抗炎、抗變應(yīng)性炎癥的主要活性成分，其抗炎作用與減少巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)生成與釋放關(guān)系密切 [9]。 常規(guī)研究技術(shù)如ELISA、免疫組化和Western blotting等多針對于個(gè)別蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，對甘草及其有效成分的抗炎作用機(jī)制研究雖然很多，但呈現(xiàn)指標(biāo)分散和局限的特點(diǎn)，缺少對其抗炎作用的系統(tǒng)認(rèn)識(shí)。

液相蛋白芯片技術(shù)是在流式細(xì)胞技術(shù)、ELISA技術(shù)和傳統(tǒng)芯片技術(shù)基礎(chǔ)上研發(fā)的新型蛋白質(zhì)研究平臺(tái)，具有同步性好、特異性強(qiáng)、通量大和準(zhǔn)確性高等特性，可高通量檢測多種細(xì)胞信號分子的表達(dá)水平，非常適合于細(xì)胞因子表達(dá)的系統(tǒng)研究。因此，本研究利用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥細(xì)胞模型[10]，應(yīng)用液相蛋白芯片技術(shù)[11]，通過測定甘草酸和甘草總黃酮對該模型細(xì)胞因子表達(dá)譜的影響，對甘草酸和甘草總黃酮的抗炎作用機(jī)制進(jìn)行了較為系統(tǒng)全面的研究。

1 材料

甘草酸（純度為98%，批號ZL201203010A）和甘草總黃酮（純度為95%，批號ZL201204010A）購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司、地塞米松磷酸鈉注射液購自天津金耀集團(tuán)湖北天藥藥業(yè)股份有限公司（國藥準(zhǔn)字H12020514）、脂多糖（Escherichia coli O111：B4，L2630）購自美國Sigma公司、小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心、Hyclone南美胎牛血清購自美國Thermo公司、DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司、Bio-Plex ProTM Mouse Cytokine 23-plex Assay購自美國Bio-Rad公司、Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司、小鼠IL-6 ELISA試劑盒購自北京曠博生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 藥品配置 甘草酸、甘草總黃酮和脂多糖分別溶于高糖DMEM培養(yǎng)液中，配置成質(zhì)量濃度均為1 g?L-1的溶液，溶液用0.2 μm注射器式過濾器過濾，分裝保存于15 mL錐型離心管，以上操作均在超凈臺(tái)中進(jìn)行。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7用含10%胎牛血清、100 U?mL-1青霉素和100 mg?L-1鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃， 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d換液，取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞分組及處理 將細(xì)胞分為正常對照組、模型組（1 mg?L-1 LPS）、甘草酸高中低劑量組（400，80，16 mg?L-1）、甘草總黃酮高中低劑量組（200，40，8 mg?L-1）和地塞米松組（5 mg?L-1）。取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，棄去原有培養(yǎng)液，加入適量高糖DMEM培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打制成每mL含1×105個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。24孔細(xì)胞板每孔接種1 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h。依照實(shí)驗(yàn)分組分別向細(xì)胞板孔加入不同濃度的甘草酸、甘草總黃酮和地塞米松，孵育4 h后再加入LPS（1 mg?L-1）。20 h后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，凍存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

2.4 Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系統(tǒng)檢測細(xì)胞因子 待檢測細(xì)胞上清液樣品在室溫下完全溶解，1萬r?min-1高速冷凍離心10 min，取上清液用緩沖液1∶10稀釋。依據(jù)試劑盒說明，每孔加入50 μL抗細(xì)胞因子抗體檢測磁珠，洗滌2次，向相應(yīng)孔板加入緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液、待檢測細(xì)胞上清液樣品。室溫下避光500 r?min-1搖床上孵育30 min，洗滌3次。依次分別加入檢測抗體50 μL和Streptavidin-PE熒光色素50 μL，操作同上。每孔用125 μL緩沖液重懸微珠，放入Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系統(tǒng)讀取各孔熒光強(qiáng)度， 并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度計(jì)算出樣品中白介素類因子IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，IL-17，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子（Eotaxin）、干擾素-γ（IFN-γ）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1） 、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1β（MIP-1β）、受調(diào)節(jié)激活的正常T細(xì)胞排泌的因子（RANTES）、小鼠角化細(xì)胞源性細(xì)胞因子（KC）共23種細(xì)胞因子的濃度。

2.5 ELISA法測定IL-6濃度 待檢測細(xì)胞上清液樣品在室溫下完全溶解，1萬r?min-1高速冷凍離心10 min，取上清液用緩沖液1∶10稀釋。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組培養(yǎng)上清液中IL-6的濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素方差檢測法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P

3 結(jié)果

3.1 LPS對RAW264.7細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響 在正常RAW264.7細(xì)胞中，各種細(xì)胞因子均有低表達(dá)，經(jīng)LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞表達(dá)大量的細(xì)胞因子（P

3.2 甘草酸對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響 甘草酸可以明顯下調(diào)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞因子，其高劑量組的作用效果優(yōu)于5 mg?L-1地塞米松組。高劑量組對IL-1β，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，Eotaxin和TNF-α的表達(dá)水平有明顯的下調(diào)作用（P

3.3 甘草總黃酮對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響 結(jié)果見表1。甘草總黃酮的作用效果接近于5 mg ?L-1地塞米松，對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)的2種細(xì)胞因子水平有明顯的下調(diào)作用：高劑量組能極明顯下調(diào)IL-6的表達(dá)水平 （P

3.4 ELISA法檢測藥物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)IL-6的影響 ELISA法測定IL-6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Bio-plex液相蛋白芯片的相一致，表明液相蛋白芯片方法的敏感性與商品化ELISA試劑盒相當(dāng)。甘草酸中、高劑量組和甘草總黃酮高劑量組能極明顯下調(diào)IL-6的表達(dá)水平 （P

4 討論

液相蛋白芯片技術(shù)同步性好、通量大、準(zhǔn)確性高等特性能很好的突破傳統(tǒng)中藥研究中單個(gè)散在指標(biāo) 的局限性，節(jié)約珍貴樣本，提高中藥研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，全面把握中藥藥效作用的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，系統(tǒng)地闡明中藥多通道、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制。毛予龍等[12]報(bào)道了甘草酸苷能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞表達(dá)IL-6；王大南等[13]報(bào)道了甘草酸苷抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α；楊曉露等[2]報(bào)道了甘草黃酮類單體異甘草素能抑制RAW264.7細(xì)胞表達(dá)IL-1β和IL-6。與以往研究相比，本研究首次應(yīng)用液相蛋白芯片技術(shù)檢測了甘草酸和甘草總黃酮對LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞表達(dá)的IL-6，IL-10和TNF-α等23種細(xì)胞因子的影響，首次發(fā)現(xiàn)了甘草酸能夠抑制LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞表達(dá)IL-1β，IL-3，IL-5，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13和Eotaxin，甘草總黃酮夠抑制Eotaxin的表達(dá)。

甘草酸能降低LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β，IL-3，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，Eotaxin和TNF-α共10種細(xì)胞因子的表達(dá)水平，從而抑制了T細(xì)胞的活化、B細(xì)胞的成熟、嗜酸性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的增殖；降低了抗體、前細(xì)胞因子、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子、集落刺激因子和急性期反應(yīng)蛋白的表達(dá)水平；增強(qiáng)了單核巨噬細(xì)胞表面MHCⅡ類分子的表達(dá)；減輕了機(jī)體局部或整體的炎癥反應(yīng)。甘草總黃酮能降低IL-6和Eotaxin的表達(dá)水平，從而減少了抗體的表達(dá)水平，抑制了嗜酸性粒細(xì)胞的增殖和趨化，起到了抗炎作用。甘草酸和甘草總黃酮的抗炎作用可能是通過抑制LPS與巨噬細(xì)胞表面TLR4受體結(jié)合，降低TLR4受體的活性，阻遏磷酸化的TLR4與MyD88蛋白的結(jié)合，抑制NIK蛋白激酶的自身磷酸化激活，阻遏IκB-α，IκB-β激酶的泛素化降解，穩(wěn)定NF-κB的非活性結(jié)構(gòu)，抑制與炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)的。

本研究顯示盡管甘草總黃酮抑制細(xì)胞因子的范圍不及甘草酸，但兩者都能通過有效抑制多種細(xì)胞因子的釋放，發(fā)揮多靶點(diǎn)抗炎效果，減輕系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，起到顯著的抗炎作用；蛋白芯片研究技術(shù)可對甘草不同有效成分抑制細(xì)胞因子的釋放水平、抑制范圍和作用特點(diǎn)進(jìn)行同步比較研究，能系統(tǒng)準(zhǔn)確地把握中藥的抗炎機(jī)制作用特點(diǎn)，是適用于中藥及其成分藥效及分子機(jī)制研究的有效蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。

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Effects of glycyrrhizin acid and licorice flavonoids on LPS-induced

cytokines expression in macrophage

LIU Zhao， ZHONG Ju-ying， GAO Er-ning， YANG Hong*

（Experimental Research Center， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Glycyrrhizin acid and licorice flavonoids are the component of Glycyrrhiza uralensis Fisch root that has been used for various medicinal purposes in traditional oriental medicine for thousands of years. Macrophages as a principal component of immune system play an important role in the initiation， modulation and final activation of immune response against pathogens.In the present study， glycyrrhizin acid and licorice flavonoids was investigated the anti-inflammatory effect on lipopolysaccharide （LPS）-induced macrophage cell line of RAW264.7. Well-grown RAW264.7 cells were collected and randomly divided into the blank control group， the LPS（1 mg?L-1）group， the dexamethasone（5 mg?L-1）with LPS group，the glycyrrhizin acid（400，80，16 mg?L-1）with LPS group and the licorice flavonoids（200，40，8 mg?L-1）with LPS group. RAW264.7 cells were cultured in 24-well plates， pre-incubated for 4 h with different concentrations of dexamethasone， glycyrrhizin acid ，or licorice flavonoids .Then cells were stimulated for 20 h with LPS. The supernatant of culture medium was collected from each well and determinated the concentrations of cytokines by means of Bio-Plex mouse cytokines assay. Compared with the control group， the LPS group could significantly induced relatively high levels of granulocyte colony stimulating factor （G-CSF），granulocyte-macrophage colony stimulating factor（GM-CSF），macrophage inflammatory protein-1 alpha （MIP-1α），macrophage inflammatory protein-1 beta（ MIP-1β），regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor（RANTES），tumor necrosis factor alpha（TNF-α），monocyte chemotactic protein 1（MCP-1），chemokine （C-X-C motif） ligand 1（KC），eotaxin，interleukin（IL）-1α，IL-1β，IL-3，IL-4， IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13， and IL-17 secretion（P

篇4

隨著時(shí)代的進(jìn)步以及經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國信用擔(dān)保體系也取得了一定突破。但在飛速發(fā)展的同時(shí)，信用擔(dān)保體系依舊面臨著一系列問題。本文從實(shí)際情況出發(fā)，對現(xiàn)存于中小企業(yè)信用擔(dān)保體系中的問題進(jìn)行了深入分析，并進(jìn)一步提出了可使我國中小企業(yè)信用擔(dān)保體系得到革新和完善的相關(guān)措施。

【關(guān)鍵詞】

中小企業(yè)；信用擔(dān)保體系；問題；解決措施

0 引言

為對中小企業(yè)的發(fā)展進(jìn)行扶持和幫助，世界各國政府都制定了相關(guān)的中小企業(yè)信用擔(dān)保體系。當(dāng)前，全世界共有50多個(gè)國家以及地區(qū)對中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)進(jìn)行了建立。科學(xué)合理的中小企業(yè)信用擔(dān)保體系為中小企業(yè)解決了融資困難的問題，并有效地促進(jìn)了當(dāng)?shù)刂行∑髽I(yè)的穩(wěn)步長效發(fā)展。另外，中小企業(yè)信用擔(dān)保體系對一國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展、社會(huì)穩(wěn)定也是有極大促進(jìn)作用的。

1 現(xiàn)存于我國中小企業(yè)信用擔(dān)保制度中的問題

1.1信用擔(dān)保體系不具備完善的組織結(jié)構(gòu)

當(dāng)前，中小企業(yè)信用擔(dān)保結(jié)構(gòu)主要由兩大類構(gòu)成，一類是以美國為主的一級擔(dān)保結(jié)構(gòu)，其分布在各地的分支機(jī)構(gòu)由中央擔(dān)保機(jī)構(gòu)設(shè)置；第二類是以日本為主的二級擔(dān)保結(jié)構(gòu)，此類擔(dān)保結(jié)構(gòu)由地方擔(dān)保機(jī)構(gòu)和中央擔(dān)保機(jī)構(gòu)組成。對這兩種中小企業(yè)信用擔(dān)保結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比分析可知，其主要出資人都是政府部門，國家信用以及中央政府為其提供了保障。

當(dāng)前，針對中小企業(yè)信用擔(dān)保體系，我國對“三層”的制度框架進(jìn)行了確立?！叭龑印敝贫瓤蚣苤饕譃橹醒爰?、省級、地方市級，地方級主要對管轄范圍內(nèi)受保企業(yè)的承保內(nèi)容進(jìn)行負(fù)責(zé)，省級則對地方市級擔(dān)保機(jī)構(gòu)提供相應(yīng)的擔(dān)保，而中央級則為地方級以及省級的小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)提供擔(dān)保。不過到目前為止，國家級的再擔(dān)保機(jī)制卻并未得到建立。因此，擔(dān)保機(jī)制在施行的過程中，就會(huì)面臨國家財(cái)政支撐不足的問題，而中小企業(yè)也無法從中得到幫助。

1.2信用擔(dān)保資金缺乏穩(wěn)定的供給機(jī)制

對于中小企業(yè)信用擔(dān)保體系的穩(wěn)步運(yùn)行而言，擔(dān)保資金補(bǔ)充機(jī)制是關(guān)鍵因素。在實(shí)際的運(yùn)行過程中，隨著業(yè)務(wù)量的增大，代償資金也會(huì)隨之有所增長，單靠利息收入以及相關(guān)的擔(dān)保費(fèi)，擔(dān)保機(jī)構(gòu)是很難進(jìn)行正常運(yùn)營的。在我國，政策性擔(dān)保機(jī)構(gòu)為非營利性組織，在收取擔(dān)保費(fèi)時(shí)受到了國家的嚴(yán)格制約。商業(yè)性擔(dān)保機(jī)構(gòu)雖然會(huì)通過提高擔(dān)保費(fèi)來對資金進(jìn)行補(bǔ)充，但在扣除各種經(jīng)費(fèi)以后，所剩的擔(dān)保資金也是非常少的。因此，受財(cái)力以及政策規(guī)章等因素的影響，我國中小企業(yè)擔(dān)保機(jī)構(gòu)往往無法獲得充足的資金支持。這樣一來，擔(dān)保機(jī)構(gòu)的承保能力就會(huì)逐步降低，中小企業(yè)的融資需求也得不到相應(yīng)滿足。

1.3風(fēng)險(xiǎn)分散機(jī)制以及控制機(jī)制的缺乏

在為中小企業(yè)提供擔(dān)保的同時(shí)，擔(dān)保機(jī)構(gòu)也需面臨一定的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)前，針對擔(dān)保機(jī)構(gòu)，我國并未制定出科學(xué)合理的規(guī)章制度進(jìn)行規(guī)范，國家級的信用再擔(dān)保機(jī)構(gòu)也未得到建立，因此在面對擔(dān)保風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，擔(dān)保機(jī)構(gòu)就無法依靠再擔(dān)保方式對風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分散和控制。為了降低風(fēng)險(xiǎn)，擔(dān)保機(jī)構(gòu)就不得不依靠反擔(dān)保措施，但第三擔(dān)保人的缺失、自身信用低等問題恰好是造成中小企業(yè)融資困難的主要因素。從理論層面來說，運(yùn)用反擔(dān)保措施，擔(dān)保機(jī)構(gòu)的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)有所降低，但中小企業(yè)融資難的問題依舊無法得到合理解決。

1.4相關(guān)法制規(guī)章不具科學(xué)合理性

對于信用擔(dān)保企業(yè)的穩(wěn)步發(fā)展而言，法制規(guī)章的完善是一大重要保障條件。在我國，與中小企業(yè)信用擔(dān)保行業(yè)有關(guān)的法律主要有：《擔(dān)保法》、《公司法》以及《中小企業(yè)促進(jìn)法》等。但針對擔(dān)保機(jī)構(gòu)，《公司法》并未進(jìn)行明確規(guī)定；《擔(dān)保法》也沒有涉及到信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)；而《中小企業(yè)促進(jìn)法》主要是起理論指導(dǎo)作用，并未對中小企業(yè)信用擔(dān)保體系的完善提供可行的操作方法。由于缺乏完整有效的信用擔(dān)保法律規(guī)章，因此在法律地位、運(yùn)作規(guī)章、服務(wù)對象等方面，中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)都不具備明確的定位，而這也嚴(yán)重阻礙到了中小企業(yè)信用擔(dān)保體系的穩(wěn)步發(fā)展。

2 使我國中小企業(yè)信用擔(dān)保制度得到完善的相關(guān)措施

2.1對中小信用擔(dān)保體系的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行完善

2.1.1對扶持中小企業(yè)發(fā)展的中央政府機(jī)構(gòu)進(jìn)行建設(shè)

在西方，針對中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)，中央政府都設(shè)立了相關(guān)的管理扶持部門，而這也為中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)制的完善和提升提供了保障。因此，在借鑒國外先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，我們就需對相關(guān)的中央政府機(jī)構(gòu)進(jìn)行建設(shè)，對中小企業(yè)的扶持制度進(jìn)行完善和落實(shí)，并對中小企業(yè)信用擔(dān)保結(jié)構(gòu)的各項(xiàng)工作進(jìn)行管理和幫助。在給予中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)幫助的同時(shí)，中央政府部門還需對中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的業(yè)務(wù)標(biāo)準(zhǔn)、績效補(bǔ)償工作、行業(yè)監(jiān)督管理以及運(yùn)行原則等進(jìn)行管理。

2.1.2對多層次的再擔(dān)保機(jī)構(gòu)進(jìn)行建設(shè)

在擔(dān)保體系里面，對風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)移和分散的一大主要方式就是再擔(dān)保。因此，我國信用擔(dān)保體系就需結(jié)合實(shí)際情況對再擔(dān)保制度進(jìn)行建立，依靠再擔(dān)保的方式為中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)移部分風(fēng)險(xiǎn)。在我國，再擔(dān)保機(jī)構(gòu)的建立主要可分為兩個(gè)層次，分別是省級再擔(dān)保機(jī)構(gòu)以及全國性再擔(dān)保機(jī)構(gòu)。對省內(nèi)各地?fù)?dān)保機(jī)構(gòu)的相關(guān)問題進(jìn)行解決為省級再擔(dān)保機(jī)構(gòu)的主要責(zé)任，而對省級再擔(dān)保機(jī)構(gòu)的再擔(dān)保問題進(jìn)行合理解決就是全國性再擔(dān)保機(jī)構(gòu)的責(zé)任了。運(yùn)用此種擔(dān)保機(jī)制，一方面可使擔(dān)保機(jī)構(gòu)的擔(dān)保規(guī)模得到擴(kuò)大，另一方面還能使擔(dān)保機(jī)構(gòu)的部分風(fēng)險(xiǎn)得到有效減少。

2.2對科學(xué)合理的擔(dān)保資金供給機(jī)制進(jìn)行建立

為了對有效的中小企業(yè)信用擔(dān)保體系進(jìn)行建立，就需首先解決資金問題，使擔(dān)保體系擁有充足的資金來源。當(dāng)前，我國各級政府部門都不具備雄厚的財(cái)力，而在收入分配中，居民部門以及實(shí)體部門都占據(jù)了較大的份額。因此，在對資金來源進(jìn)行組織時(shí)，中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)需從實(shí)際情況出發(fā)，依靠多種渠道對擔(dān)保資金進(jìn)行籌集。中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)還可以擴(kuò)大對郵政儲(chǔ)蓄、社會(huì)保障基金以及保險(xiǎn)基金等的融資力度，進(jìn)而對資金進(jìn)行獲取。倘若條件允許，一些商業(yè)性擔(dān)保機(jī)構(gòu)還可以運(yùn)用直接上市融資的方法籌集擔(dān)保資金。另外，政府可以依據(jù)一定比例從財(cái)政收入中拿出一部分錢對擔(dān)保資金進(jìn)行補(bǔ)充，或者從征得的中小企業(yè)稅收總額中拿出一部分錢作為擔(dān)保機(jī)構(gòu)的補(bǔ)償資金。最后，擔(dān)保機(jī)構(gòu)可以依據(jù)一定比例從年利息收入和擔(dān)保費(fèi)中提取一部分錢，用作風(fēng)險(xiǎn)補(bǔ)償資金。在條件允許的情況下，為了對擔(dān)保資金的外部補(bǔ)償進(jìn)行實(shí)現(xiàn)，擔(dān)保機(jī)構(gòu)還可運(yùn)用到上市募集以及私募資金的方法。

2.3對風(fēng)險(xiǎn)分散機(jī)制以及控制機(jī)制進(jìn)行完善

2.3.1擔(dān)保機(jī)構(gòu)需和銀行之間建立起良好的合作關(guān)系

在為中小企業(yè)提供擔(dān)保業(yè)務(wù)以后，擔(dān)保機(jī)構(gòu)幫助銀行減少了經(jīng)營成本，使其信貸資金的安全性得到了提升?？梢?，擔(dān)保機(jī)構(gòu)的擔(dān)保工作會(huì)為貸款銀行帶來直接利益。因此，協(xié)作銀行就需依據(jù)一定比例對擔(dān)保機(jī)構(gòu)的貸款風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行承擔(dān)，幫助擔(dān)保機(jī)構(gòu)分散和避免風(fēng)險(xiǎn)。

2.3.2運(yùn)用金融衍生品對風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分散

在我國，具有發(fā)展?jié)摿σ约昂诵母偁幜Φ闹行∑髽I(yè)是中小企業(yè)擔(dān)保機(jī)構(gòu)的主要服務(wù)對象。因此，將合理的衍生工具，例如“擔(dān)保換期權(quán)模式”運(yùn)用到中小企業(yè)信用擔(dān)保體系中，就可將中小企業(yè)的無形資產(chǎn)價(jià)值，即高增長潛力開發(fā)出來，使擔(dān)保機(jī)構(gòu)由之前的承擔(dān)貸款風(fēng)險(xiǎn)變?yōu)橘Y本增值承擔(dān)風(fēng)險(xiǎn)，最終促使中小企業(yè)和擔(dān)保機(jī)構(gòu)完成風(fēng)險(xiǎn)共擔(dān)。

2.3.3對動(dòng)態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控機(jī)制進(jìn)行建立

在進(jìn)行擔(dān)保之前，擔(dān)保機(jī)構(gòu)需對相關(guān)的擔(dān)保標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行嚴(yán)格遵循，并在此基礎(chǔ)之上對中小企業(yè)的資信情況做出全面審查，審查內(nèi)容為融資企業(yè)的資信狀況、償債能力、貸款申請、經(jīng)營狀況以及反擔(dān)保措施等。在完成這一系列審查以后，才可決定是否為其提供擔(dān)保。在擔(dān)保的過程中，針對受保企業(yè)的資金使用情況、項(xiàng)目運(yùn)行情況等，擔(dān)保機(jī)構(gòu)需進(jìn)行跟蹤監(jiān)測，旨在及時(shí)了解擔(dān)保風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)警信息，并采取科學(xué)合理的方法完成風(fēng)險(xiǎn)防范。一旦出現(xiàn)了擔(dān)保風(fēng)險(xiǎn)，擔(dān)保機(jī)構(gòu)就可依靠法律途徑對受保企業(yè)進(jìn)行追償。

2.3.4對法制環(huán)境進(jìn)行完善

為了推進(jìn)中小企業(yè)擔(dān)保體系的完善和順利施行，我國就需加強(qiáng)法制建設(shè)，對相關(guān)的法律規(guī)章進(jìn)行完善。另外，我國還需對信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的相關(guān)法律進(jìn)行調(diào)整，例如依據(jù)《中小企業(yè)促進(jìn)法》，可對現(xiàn)有的《公司法》以及《擔(dān)保法》進(jìn)行整理，進(jìn)而制定出《中小企業(yè)信貸擔(dān)保法》，旨在對擔(dān)保機(jī)構(gòu)的補(bǔ)償機(jī)制、性質(zhì)、稅收機(jī)制、資本金來源以及風(fēng)險(xiǎn)分擔(dān)等方面進(jìn)行明確，使中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的順利施行得到法律上的保障。與此同時(shí)，還需對相關(guān)的配套法律進(jìn)行完善，例如制定出中小企業(yè)促進(jìn)法以及中小企業(yè)信貸法等，使各級政府所需承擔(dān)的責(zé)任得到明確，幫助信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)在債權(quán)保護(hù)、企業(yè)信息披露等方面獲得完整、有效的法律保障。另外，還需對涉及到社會(huì)信用體系的法律法規(guī)，即資信評估以及信用等級評定進(jìn)行制定，最終促進(jìn)中小企業(yè)信用擔(dān)保體系的穩(wěn)步發(fā)展。

3 結(jié)語

綜上所述，中小企業(yè)信用擔(dān)保制度的建設(shè)具有一定的復(fù)雜性以及系統(tǒng)性。因此，我們就需從我國的實(shí)際情況出發(fā)，對國外先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行借鑒，將理論和實(shí)踐結(jié)合起來，使信用擔(dān)保體系得到革新和完善，進(jìn)而為我國中小企業(yè)的穩(wěn)步飛速發(fā)展提供幫助。這樣一來，我國中小企業(yè)的發(fā)展必定會(huì)走上一個(gè)新的臺(tái)階，并在社會(huì)主義現(xiàn)代化建設(shè)中發(fā)揮巨大作用。

【參考文獻(xiàn)】

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篇5

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑；腫瘤；細(xì)胞周期

[中圖分類號] R979.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）13-44-04

[Abstract] As normally accepted， the cell proliferation is regulated through cell cycle and the occurrence of tumor may lie in deregulation of cell cycle， directly resulted from the abnormal of the complex of cyclin dependent kinase（CDK）.It has become one of the most effective strategies to inhibit the activity of the complex for dealing with tumors.Thus，the study on CDK/Cylclin complex inhibitors is one of hot focuses in antitumor drug discovery.This thesis mainly discusses the types of CDK/Cyclin inhibitors and their clinical issues.

[Key words] Inhibitor；Cancer；Cell cycle

細(xì)胞周期的調(diào)控過程是在檢查點(diǎn)的監(jiān)視下，各種調(diào)控因子依次激活或滅活，從而啟動(dòng)細(xì)胞完成DNA復(fù)制，分裂為2個(gè)子代細(xì)胞的過程。在諸多細(xì)胞周期調(diào)控因子中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）是處于核心位置，其與細(xì)胞周期蛋白Cyclins、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKIs）等組成細(xì)胞周期調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[1]。CDKs是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，目前有13種包括CDK1～13，分別在細(xì)胞周期調(diào)控CDKs（1～6）和轉(zhuǎn)錄調(diào)控CDKs（7～13）起作用。細(xì)胞周期的調(diào)控事實(shí)上就是檢查點(diǎn)的調(diào)控，其中以G1/S調(diào)控點(diǎn)最為重要。細(xì)胞周期受到外界信號如生長因子等刺激時(shí)，催化亞基CDK4/CDK6與調(diào)節(jié)亞基CyclinD結(jié)合后，CDKs殘基被磷酸化/去磷酸化修飾而被激活，CDKs激活后催化Rb蛋白使之磷酸化，Rb基因（retinob lastoma gene）又稱為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因，是第一個(gè)被克隆的抑癌基因，其蛋白磷酸化后與轉(zhuǎn)錄因子（如E2F）形成復(fù)合物的能力喪失，E2F在細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用，能誘導(dǎo)CyclinE和CDK2的表達(dá)并形成CyclinE/CDK2復(fù)合體，后者進(jìn)一步使Rb蛋白磷酸化，充分釋放E2F，隨后E2F進(jìn)入核內(nèi)激活一系列細(xì)胞周期進(jìn)入S期的必須基因的表達(dá)。在S期內(nèi)DNA復(fù)制晚期，CDK2被cyclinA激活，使轉(zhuǎn)錄因子E2F及時(shí)失活，阻止了由持續(xù)激活的E2F導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[2-3]。

1 CDK/Cyclin抑制劑的種類

研究統(tǒng)計(jì)顯示，有超過90%的人類癌癥中CDK、Cyclin、CKI和Rb途徑中相關(guān)基因發(fā)生了變異，其中CDK和其相應(yīng)的調(diào)節(jié)亞基Cyclin的失常最為頻繁[2-3]。此外，細(xì)胞周期的波動(dòng)促進(jìn)了化療的抗性，降低了化療的效果。因此恢復(fù)細(xì)胞周期正常的CDK/Cyclin活性調(diào)控是治療腫瘤的策略之一。藥物研究人員已經(jīng)把尋找不同類型CDK和Cyclin抑制劑作為前沿的抗腫瘤藥物的重點(diǎn)研究方向。目前CDK抑制劑主要有內(nèi)源性的和外源性的兩種。

1.1 內(nèi)源性小分子抑制劑

1.1.1 小分子量蛋白 內(nèi)源性小分子抑制劑中最大的一類是低分子量蛋白質(zhì)，根據(jù)結(jié)構(gòu)功能的差異分為兩大類：一類稱雙重特異家族INK4，包括p15，p16，p18，p19，該蛋白家族可抑制cyclin D相關(guān)激酶的活性，其抑制作用依賴蛋白與相應(yīng)的游離CDK4結(jié)合，從而阻斷CDK4與相應(yīng)cyclin D結(jié)合形成具有催化功能的二聚體復(fù)合物。另一類叫Kip家族，包括p21，p27，p57，該蛋白家族可以和cyclin E/CDK2與cyclinA/CDK1組成的二聚體復(fù)合物再組成三聚體，通過封閉二聚體的催化活性中心從而發(fā)揮其抑制作用這些內(nèi)源性抑制因子與激酶復(fù)合物結(jié)合后，可特異性地調(diào)節(jié)其活性，從而精確調(diào)節(jié)細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化過程，內(nèi)源性CDK調(diào)節(jié)劑的存在不僅提示細(xì)胞本身的分裂、增殖具有精密的調(diào)控機(jī)制，而且也反應(yīng)了該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在細(xì)胞周期調(diào)控中的重要作用與地位[1-5]。研究表明，多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程與CDKs/cyclins的過度表達(dá)或其內(nèi)源性抑制因子表達(dá)下降有關(guān)，如p16的缺失與小細(xì)胞和黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生密切聯(lián)系[4-7]；p27蛋白的缺失常見于乳癌，前列腺癌，結(jié)腸癌以及消化道腫瘤[8-12]。因此，內(nèi)源性CDKs抑制因子的缺失或基因突變是腫瘤診斷的重要參考指標(biāo)。

1.1.2 非編碼小RNA 內(nèi)源性小分子抑制劑還有一類是近年來發(fā)現(xiàn)的一類重要的非編碼RNA――microRNA，MicroRNA是一種長度在21～23nt的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA 3’UTR區(qū)的靶位點(diǎn)區(qū)域相互結(jié)合而快速有效地降解mRNA或抑制蛋白的翻譯，將蛋白控制在生命活動(dòng)所需的較低或最佳的水平上。已發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞周期調(diào)控的microRNA已有10余種，其中miR-1-2與miR-34分別靶向CDK4，細(xì)胞周期被停滯于G1期，近而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[13-15]；miR-22靶向CDK6細(xì)胞周期停滯于G1期，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞衰老。在不同的生物學(xué)過程中，這些miRNA通過靶向E2F、CDK、cyclin、p21、p27、DNA多聚酶α等促進(jìn)或阻滯細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。

1.2 外源性小分子抑制劑

外源性的抑制劑包括反義核酸、抗體、小分子RNA干擾（siRNA）和小分子化合物四種。小分子化合物是最主要的一類外源性CDK抑制劑。

1.2.1 小分子化合物 近幾年來，由于對晶體結(jié)構(gòu)的了解允許人們進(jìn)行分子模擬研究，在設(shè)計(jì)開發(fā)高效、有選擇性的CDKs化學(xué)抑制劑的研究方面取得了突破性進(jìn)展，可以說這類化合物每天都有新的成員在增加[15-17]。目前小分子CDK抑制劑可分為以下13類：（1）嘌呤類（Roscovitine and Olomoucin）、（2）嘧啶類（PD-033299）、（3）黃酮類（Flavopiridols）、（4）噻唑類（SNS-03）、（5）吲哚類及其衍生物（SU951）、（6）哌酮類（Paullones）、（7）咪唑并吡啶、吡唑并吡啶類（AZ703），（8）吡嗪類（AT751）、（9）丁酸內(nèi)酯類（butyrolactone-1），（10）十字苞堿類（UCN-01）等13種，其中發(fā)展較快的為嘌呤類、嘧啶類、氨基噻唑類、黃酮類、吲哚咔唑類似物、Paullones、靛玉紅及其衍生物和吡嗪類。已有13個(gè)小分子抑制劑進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。它們都是平面雜環(huán)的小分子化學(xué)物，與ATP競爭性地結(jié)合在CDK激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)上。如Seliciclib[CYC202，（R）-roscovitine]是一個(gè)2，6，9-三元取代的嘌呤類似物，選擇性抑制CDKs/Cyclins，尤其是對CDK2/cyclinE的抑制作用最強(qiáng)。在體外對激酶活性的影響IC50值分別為CDK1/cyclinB（2.69μM）、CDK2/cyclinA（0.71μM）、CDK2/cyclinE（0.10μM）、CDK4/cyclinD1（14.21μM）、CDK7/cyclinH（0.49μM）、ERK-2（1.17μM）、PKA>50μM、PKC>100μM和SAPK>20μM。在體外，CYC202對多種人腫瘤細(xì)胞株的增殖有抑制作用，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等。IC50值范圍是7.9～30.2μM，在24h，達(dá)到80%凋亡率時(shí)，CYC202濃度是20μM。對正常細(xì)胞的毒性明顯低于對癌細(xì)胞的毒性，IC50在22.2～100μM這個(gè)范圍。CYC202能抑制凋亡抑制基因的表達(dá)，通過抑制MDM2的表達(dá)，阻滯p53的降解，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯G1/S與G2/M期，降低pRb的磷酸化水平，誘導(dǎo)細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，CYC202耐藥性好，口服生理活性良好，對由人結(jié)腸癌、子宮癌細(xì)胞接種裸鼠體內(nèi)的實(shí)體瘤有明顯的抑制作用。CYC202正在進(jìn)行2個(gè)Ib期劑量增加的臨床實(shí)驗(yàn)，在Ib期研究中發(fā)現(xiàn)，10例患有卵巢癌的患者服用CYC2024個(gè)月以上，腫瘤沒有增加和嚴(yán)重的治療相關(guān)的副作用，其中1個(gè)患者的腫瘤縮小了30%以上，治療1年以上的患者病情穩(wěn)定。Ⅱ期臨床研究發(fā)現(xiàn)，CYC202單獨(dú)應(yīng)用效果稍差，與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療效果顯著。CYC202聯(lián)合卡培他濱治療乳腺癌，聯(lián)合2，2-二氟脫氧胞嘧啶核苷或順鉑治療肺癌、鼻咽癌的IIb期臨床實(shí)驗(yàn)也在進(jìn)行[18-24]。

1.2.2 小分子RNA干擾 小分子RNA干擾技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，使特異性的干預(yù)靶分子的基因表達(dá)的研究成為可能，有不少科學(xué)家開始從基因水平干預(yù)CDK/Cyclin的合成。Lima等[25-26]將靶向CyclinE的siRNA轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞Hep3B、HepG2、SNU449（CyclinE過表達(dá)），HuH7（CyclinE沒有過表達(dá)）后發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)CyclinE的細(xì)胞中，CyclinE的表達(dá)下降了90%，DNA合成明顯下降，細(xì)胞發(fā)生凋亡。Galimberti等[27]將分別靶向CyclinE、CDK2、CDK1的siRNA轉(zhuǎn)染鼠肺癌細(xì)胞HOP-62、H-522、H-23后，發(fā)現(xiàn)CyclinE/CDK2能引起細(xì)胞凋亡，抑制肺癌細(xì)胞的增殖，而CDK1siRNA對細(xì)胞凋亡無影響。CDK1 siRNA干擾導(dǎo)致的CDK1表達(dá)降低只引起細(xì)胞期阻滯，細(xì)胞增殖減慢；而CDK1和CDK2 siRNA的共同干擾作用導(dǎo)致的CDK1、CDK2表達(dá)同時(shí)降低，引起細(xì)胞周期S期和G2/M期的阻滯，同時(shí)誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。曹銀芳等[28]成功將靶向CDK2/CyclinE的siRNA重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)CDK2和CyclinE mRNA表達(dá)顯著下降，細(xì)胞周期停滯于S期發(fā)生阻滯，G1期細(xì)胞明顯增多，Caspase-3活性增強(qiáng)，HepG2細(xì)胞發(fā)生了凋亡，并且細(xì)胞周期的改變與轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞體外增殖力下降是一致的。

2 問題與展望

CDK1，CDK2，CDK4，CDK6是熱門的抗癌靶標(biāo)，但由于激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)高度的保守性，選擇性小分子抑制劑的設(shè)計(jì)與開發(fā)是一個(gè)公認(rèn)的難題。因激酶結(jié)構(gòu)的保守性而產(chǎn)生的耐藥性和毒副作用，嚴(yán)重阻斷了化療藥物的抗腫瘤效應(yīng)，限制和影響了治療的效果。研究發(fā)現(xiàn)CDKs/Cylcins抑制劑的臨床應(yīng)用出現(xiàn)的最大問題是腫瘤的耐藥性導(dǎo)致了腫瘤的復(fù)發(fā)，療效明顯降低。其抗性的產(chǎn)生與該致癌激酶基因的擴(kuò)增、補(bǔ)充途徑及信號通路的反饋調(diào)節(jié)相關(guān)。此外，其抗性還與藥物靶點(diǎn)的單一或群體突變有關(guān)，導(dǎo)致了藥物與靶點(diǎn)的親和性差。

siRNA藥物誘導(dǎo)的RNAi具有特異性和高效性，是對成癮性致癌基因?qū)嵤┌邢蛑委煹睦硐脒x擇。研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物與siRNA聯(lián)合作用于腫瘤細(xì)胞，具有協(xié)同作用，基因治療可作為化學(xué)治療藥物外的補(bǔ)充途徑。Wang等[29]發(fā)現(xiàn)，用livin-siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致livin基因沉默后，可激活caspase-3并增加腫瘤細(xì)胞對紫外線等其他促凋亡刺激信號的敏感性。用RNAi技術(shù)下調(diào)bcl-2或XIAP基因表達(dá)，可增加人乳腺癌細(xì)胞MCF-7依托泊苷及阿霉素的敏感性，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的數(shù)量與活性下降、凋亡率增加，較單一化療藥物處理組活性細(xì)胞數(shù)目明顯減少。Chistiane等[30]將針對多藥耐藥基因MDR1編碼的P-gp-siRNA轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞EPP85-181RDB和人胃癌細(xì)胞EPG85-257RDB，發(fā)現(xiàn)上述細(xì)胞對柔紅霉素的耐藥性分別下降了89%和58%。具有MDR特性的K562細(xì)胞經(jīng)上述siRNA處理后，也觀察到類似效果。因此，siRNA干擾技術(shù)可能是解決臨床上藥物抗性的主要手段之一。

CDK及其相關(guān)蛋白表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。不少外源性或者是內(nèi)源性的CDK抑制劑在抑制CDK后，都能很好的抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而單獨(dú)CDK抑制劑治療，會(huì)有腫瘤逃逸的現(xiàn)象，而無法根治腫瘤。因此與其他治療手段聯(lián)合的治療方式，將是CDK抑制劑研究的方向之一。

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篇6

關(guān)鍵詞：細(xì)胞凋亡；白介素1轉(zhuǎn)換酶；蛋白酶

1 概 述

細(xì)胞凋亡是區(qū)別于細(xì)胞壞死的一種細(xì)胞死亡形式，它是在一定的生理和病理?xiàng)l件下，一種并不引起機(jī)體炎癥反應(yīng)的細(xì)胞程序性死亡（programmed cell Death， PCD）的過程。細(xì)胞凋亡這一概念最早由Kerr等提出的[1]，認(rèn)為該種細(xì)胞死亡像秋天的樹葉凋謝一樣，故稱謂“Apoptosis”，希臘文即凋亡之意。細(xì)胞凋亡在形態(tài)學(xué)和生化改變方面具有特征性。形態(tài)學(xué)改變包括細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)濃縮，核裂解成碎片，最終細(xì)胞膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜將完整細(xì)胞器及碎片包裹成多個(gè)分散的凋亡小體。生化改變以往認(rèn)為內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活性增加染色質(zhì)核小體間DNA斷裂是引起凋亡的一個(gè)啟動(dòng)因子，但有些具有細(xì)胞凋亡特征性改變的卻沒有染色質(zhì)核小體間DNA斷裂，有的甚至缺乏細(xì)胞核[1]，看來僅僅以此酶活性增加作為凋亡的啟動(dòng)因子，不能得到滿意的解釋。目前許多學(xué)者都著重于對細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的研究，認(rèn)為這些蛋白酶可能在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)方面起著關(guān)鍵性作用。研究依據(jù)為：（1）在細(xì)胞凋亡早期已發(fā)現(xiàn)特異的、可復(fù)制的細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解[2]。（2）某些蛋白酶抑制劑可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[3]。（3）部分病毒蛋白質(zhì)作用類似蛋白酶抑制劑，可以抑制細(xì)胞凋亡[4]。（4）基因刪除實(shí)驗(yàn)證明某些蛋白酶在細(xì)胞凋亡中起著主要作用[5]。

2 白介素1轉(zhuǎn)換酶家族（ICE家族）

在蛋白酶的研究中，研究得最早且最多的為白介素1轉(zhuǎn)換酶（Interleukin 1 converting enzyme， ICE）是巰基蛋白酶的一種。ICE的作用是將無活性的31KD的前白介素1（在天冬氨酸羧基端降解為有活性的17.5KD的細(xì)胞因子。ICE由Black等和Kostura等[6]在1989年發(fā)現(xiàn)，此酶有高度的底物特異性。ICE高度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而ICE抑制劑如痘苗病毒CrmA可抑制由各種不同刺激因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[7]。在線蟲C.elegans的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)1090個(gè)細(xì)胞中131個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)了預(yù)定的細(xì)胞凋亡，調(diào)控該程序性死亡的基因已被確認(rèn)?；騽h除實(shí)驗(yàn)證明有2個(gè)基因ced-3和ced-4是引起細(xì)胞凋亡所必需的。盡管由ced-3編碼的多肽其功能還不十分清楚，但這一分子顯示與人類ICE有廣泛的相同部分，ced-3蛋白與ICE有29%氨基酸殘基同源性。ced-3蛋白最長的保護(hù)順序QACRG含有ICE活性所必需的半胱氨酸。14C碘乙酰胺標(biāo)記和晶體學(xué)研究[8]均發(fā)現(xiàn)ICE活性位于半胱氨酸殘基，此基團(tuán)在催化作用中起著關(guān)鍵作用?；钚孕虸CE是一個(gè)四聚體，由兩個(gè)20KD和兩個(gè)10KD亞基因組成。它是由無活性型的45KD酶原在天冬氨酸-X連接處降解成20KD和10KD亞基。晶體學(xué)研究提示2個(gè)亞基均是酶活性所必需的[8]。由于ced-3蛋白和ICE間29%同源性促使對包括人類的哺乳類細(xì)胞凋亡過程中ICE作用的研究，已發(fā)現(xiàn)鼠成纖維細(xì)胞中ICE過度表達(dá)引起細(xì)胞凋亡。若涉及ICE催化活性半胱氨酸和甘氨酸基團(tuán)突變，則導(dǎo)致催化活性和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡的功能的喪失。由ATP誘導(dǎo)的鼠腹膜巨噬細(xì)胞凋亡及亞胺環(huán)已酮及腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡過程中均發(fā)現(xiàn)有成熟的白介素1釋放[9]，提示ICE在細(xì)胞凋亡中被激活。目前對于與ICE活性有關(guān)的特異性底物還不十分清楚。隨著研究的不斷深入，ICE家族成員不斷擴(kuò)大，統(tǒng)稱為ICE同類物（ICE homologues）。包括：1）Nedd-2，最初從鼠大腦細(xì)胞發(fā)育早期一組基因中發(fā)現(xiàn)的，后在人胎兒大腦細(xì)胞cDNA庫中分離得到相同的基因，命名為Ich-1（即ICE和ced-3同類物-1），其編碼蛋白順序與ICE和ced-3相同[10]，Ich-1有兩種不同的mRNA即長Ich-1和短Ich-1。長Ich-1過度表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而短Ich-1過度表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。Ich和ICE相比不易被CrmA抑制[10]。2）CPP32與ced-3同源性為35%，與ICE同源性為30%，其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CPP32又稱為YAMA和apopain。CPP32的底物特異性不同于ICE。前者在P1-P4位點(diǎn)偏向性為四 肽DEVD＞YVAD，而后者偏向于YVAD。前者易被DEVD-醛所抑制，后者易被YVAD-醛抑制。CPP32能降解多二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP），ICE及長Ich-1并不降解PARP。3）TX（亦稱為ICErelⅡ或Ich-2），與ICE有50%同源性，與ced-3有30%等同性[12]。該酶亦為巰基蛋白酶，能催化降解30KD的ICE前體變?yōu)橛谢钚缘腎CE[12]。TX在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中的過度表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。TX幾乎不降解前白介素1。4）ICErelⅢ與ICE等同性為52%，與ced-3同源性為25%。該酶也不降解前白介素1，但仍使轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡。5）Mch2，是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)ICE家族成員，在氨基酸水平上與ced-3有35%等同性，與ICE有29%的同等性。Mch2不降解含有DEVD或YVAD產(chǎn)熒光的底物。Mch2底物的偏向性可能與CPP32或ICE的偏向性有很大不同。ICE家族偏向性成員的共同特性為：（1）這些蛋白酶參與催化降解作用依賴于P1位點(diǎn)的天冬氨酸，該特性與細(xì)胞毒T細(xì)胞特異的granzymeB有相同之處，后者為獨(dú)特的絲氨酸蛋白酶。（2）這些蛋白結(jié)構(gòu)均為多聚體，一般為四聚體，由大為17-22KD，10-12KD的亞單位組成。大小亞單位由單一的轉(zhuǎn)錄編碼翻譯成酶原，然后在各種天冬氨酸-X鍵處降解為兩個(gè)亞單位。所有的ICE同類物都是具有相似的催化位點(diǎn)和相似的在等電點(diǎn)及天冬氨酸結(jié)合的部位。（3）這些蛋白酶均能自我催化或激活別的ICE同類物。由于在細(xì)胞凋亡過程中，ICE同類物并不是唯一的蛋白酶，許多描繪凋亡中蛋白酶的研究都是來源于蛋白酶抑制劑的研究，如TLCK、TPCK、TAME等，這些蛋白酶抑制劑抑制了與凋亡有關(guān)的各種細(xì)胞系統(tǒng)中DNA的降解[2，3，13]，故它們可能除了直接抑制ICE同類物外，還抑制ICE作用前或ICE作用后的蛋白酶（即非ICE蛋白酶）。

3 蛋白酶的底物特異性

近來研究顯示在COS細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)的ICE、TX和Nedd2可降解PARP[14]，PARP是目前較明確的底物之一。CPP32除了降解PARP外，還降解固醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白SREBP-1和SREBP-2。所有這些發(fā)現(xiàn)都提示盡管在ICE家族中成員間有部分功能的重疊，但底物特異性可以有所不同。如體外實(shí)驗(yàn)純化的ICE濃度在降解PARP比降解前白介素1要高出50-100倍。ICE的天然底物是前白介素1，降解產(chǎn)生有活性的白介素1，奇怪的是granzyme A也激活前白介素1[15]。盡管granzyme A降解前白介素1的位點(diǎn)與ICE降解前白介素1的位點(diǎn)不同，但兩者激活的白介素1都具有生物學(xué)活性[15]，進(jìn)一步證實(shí)了這樣一個(gè)觀點(diǎn)即存在不同種類的蛋白酶，其間有功能上的重疊。目前又發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白（Laminin），能被稱為LamP的假定為ICE同源物蛋白酶降解。層粘連蛋白是較明確的一個(gè)底物，由于它的降解作為細(xì)胞核凋亡的一個(gè)標(biāo)志，LamP的激活可能是凋亡過程終末階段的一個(gè)關(guān)鍵步驟。由于LamP至今還未被克隆化，到底其是否代表了ICE家族中的一個(gè)早已明確的成員？目前還不清楚。

4 iCE同類物間的相互作用

與ICE結(jié)構(gòu)最相似的TX/ICErelⅡ和TX/ICErelⅢ（可能還包括其他成員）都不有效地降解前白介素1，這就意味著ICE主要作用是降解前白介素1，其它ICE同類物在過度表達(dá)時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，由于這些蛋白酶在細(xì)胞凋亡中的作用的證據(jù)主要來源于其抑制劑的研究，而這些抑制劑如CrmA和AC-YVAD-CMK等并不具有高度特異性，其在不同程度上抑制所有ICE同類物，故不能區(qū)分到底是哪個(gè)蛋白酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起主導(dǎo)作用。其次，CPP32可能降解PARP，Mch2也降解PARP及降解ICE，TX和Nedd2在足夠濃度時(shí)也降解PARP，故假定哺乳類動(dòng)物（包括人類）細(xì)胞凋亡途徑涉及單一的某種ICE同類物似乎過于簡單化，所有這些都提示ICE同類物間是互相作用協(xié)同參與細(xì)胞凋亡的。

5 各種蛋白酶間的作用模式

如上所述，在細(xì)胞凋亡過程中涉及各種不同的蛋白酶，那么它們是如何協(xié)調(diào)的呢？由于大部分蛋白酶的底物還不清楚，部分蛋白酶還沒有被確認(rèn)，因此要設(shè)想一個(gè)包容所有發(fā)現(xiàn)的單一模式似乎不可能。但不管怎樣，這些蛋白酶間的相互作用必為以下兩種模式的一種或不同階段以不同模式出現(xiàn)。（1）蛋白酶是同時(shí)被激活的，對凋亡信號的反應(yīng)是彼此 獨(dú)立的，蛋白酶間沒有各種級別。（2）有級別的一系列級聯(lián)和/或連鎖反應(yīng)。到底是何種模式，還有待于進(jìn)一步研究。

6 蛋白酶抑制劑的作用

細(xì)胞外蛋白酶活性受內(nèi)源性蛋白酶抑制劑高度調(diào)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)蛋白酶抑制劑已被發(fā)現(xiàn)。盡管后者被認(rèn)為在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起重要作用，但目前才開始受到重視。病毒serpin crmA的表達(dá)顯示能抑制由神經(jīng)生長因子撤除誘導(dǎo)的脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的凋亡，還能抑制Fas配體和TNF誘導(dǎo)的不同類型的細(xì)胞株的凋亡[9，11]。目前還不清楚CrmA的抑制凋亡是由于ICE、CPP32的抑制或其它關(guān)鍵蛋白酶的抑制。近來又發(fā)現(xiàn)nexin1（另一種serpin）也可抑制自發(fā)的和axotmy誘導(dǎo)的小雞脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡，血漿蛋白溶酶原激活抑制劑2（亦為serpin的一種），也顯示抑制TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。有趣的是，最近發(fā)現(xiàn)用熱誘導(dǎo)的FM3A細(xì)胞，用半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64和天冬氨酸蛋白酶抑制劑pepstatin a測定FM3A細(xì)胞的高熱反應(yīng)，結(jié)果顯示在加熱至44℃時(shí)出現(xiàn)顯著的細(xì)胞毒效應(yīng)，提示蛋白酶抑制劑可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該現(xiàn)象與以往認(rèn)為蛋白酶抑制劑是抑制凋亡的現(xiàn)象不符合。那么就出現(xiàn)這樣一個(gè)問題：蛋白酶抑制劑是否存在雙向調(diào)節(jié)？在什么情況下可能出現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡？

7 目前存在的問題

近年報(bào)道與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白酶，除了ICE家族外，還包括：（1）fragmentin/granzymes（2）絲氨酸蛋白酶；（3）calpains（4）ubiquitin依賴的蛋白降解作用[17]（5）降解體內(nèi)巰基蛋白酶如組織蛋白酶D（cathepsin d）[18]和組織蛋白酶B（cathepsinB）等。

近來發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶D（天冬氨酸酶類）能促使干擾素、FAS和TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且是調(diào)控細(xì)胞凋亡的一個(gè)限速酶。其抑制劑pestatin a抑制該系統(tǒng)細(xì)胞的死亡[18]。目前我們消化所實(shí)驗(yàn)室也正在試圖研究在兩種不同的組織蛋白酶B表達(dá)的胃癌細(xì)胞株中的組織蛋白酶B抑制劑在細(xì)胞凋亡中的作用（待發(fā)表資料）。但是，我們尚缺乏足夠的證據(jù)表明以上蛋白酶在細(xì)胞凋亡過程中涉及的細(xì)胞內(nèi)底物的性質(zhì)和種類。事實(shí)上，在細(xì)胞凋亡過程中，絕大多數(shù)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)并未降解。另一方面即蛋白酶的良好底物使問題更趨復(fù)雜化。因此，研究和確認(rèn)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白酶的細(xì)胞內(nèi)底物及該底物在細(xì)胞凋亡中的作用對于加深我們對細(xì)胞凋亡機(jī)制的了解具有重要意義。

8 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶研究的臨床意義

眾多研究表明一種或多種蛋白酶可能在細(xì)胞凋亡發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵性作用。研究者們已認(rèn)識(shí)到蛋白酶和蛋白酶抑制劑可能為臨床治療某些疾病，延緩或加速細(xì)胞凋亡過程提供新的途徑，例如可以應(yīng)用一些蛋白酶抑制劑旨在延緩如缺血-缺氧所誘發(fā)的神經(jīng)元、心肌腎臟上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡進(jìn)程。反之，可應(yīng)用某些蛋白酶或某些蛋白酶激活劑（也有可能為某些蛋白酶抑制劑）來加速其細(xì)胞凋亡進(jìn)程（如腫瘤等）。值得指出的是目前有關(guān)蛋白酶途徑在細(xì)胞凋亡中治療應(yīng)用前景的討論還僅僅是一種推測，還需要作大量的實(shí)驗(yàn)研究才能得到較明確的結(jié)論。

其中大致包括以下幾個(gè)方面：

第一，需了解細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)是如何被激活的？激活過程是如何完成的？闡明蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)被激活過程及其調(diào)控因素對于發(fā)現(xiàn)新的臨床治療途徑會(huì)有幫助。

第二，如上所述，細(xì)胞凋亡過程可能會(huì)牽涉到多種蛋白酶的協(xié)同作用和連鎖酶解反應(yīng)。近來研究表明層粘蛋白酶酶解反應(yīng)可能繼PARP蛋白酶反應(yīng)之后[19]。假定細(xì)胞凋亡涉及到多種蛋白酶的連鎖酶反應(yīng)（瀑布效應(yīng)），那么發(fā)現(xiàn)位于連鎖反應(yīng)之首的蛋白酶將會(huì)為臨床治療提供獨(dú)特的靶目標(biāo)。

第三，對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶基因調(diào)控機(jī)制及細(xì)胞內(nèi)代謝過程目前了解甚少。近年研究表明，表達(dá)腫瘤基因bcl-2的細(xì)胞其IRP的激活明顯減少[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明bcl-2可能為IRP的抑制劑。

第四，對腫瘤細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶的表達(dá)及其調(diào)控目前研究甚少。一方面，bcl-2或其它未知基因產(chǎn)物所誘導(dǎo)的蛋白酶激活抑制與腫瘤細(xì)胞不易凋亡有關(guān)。另一方面 ，腫瘤組織內(nèi)某些蛋白酶基因在的過度表達(dá)和調(diào)控失常在腫瘤細(xì)胞凋亡中所起作用也應(yīng)值得進(jìn)一步研究探討。

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篇7

1　材料與方法

1.1　細(xì)胞株及抗體

人結(jié)腸癌細(xì)胞 DLD-1(colorectal adenocarcinoma cell line，KRASmutantG13D)及 Caco-2(colorectal adenocarcinoma cells line，KRASWT)細(xì)胞株均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，由本實(shí)驗(yàn)室傳代后液氮保存。用于細(xì)胞培養(yǎng)的 RPMI-1640培養(yǎng)基購自 Hyclone，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素、鏈 霉 素 及 Trypsin-EDTA(0.05%)均 購 自Gibco公司。西妥昔單抗(CETuximab，鼠/人嵌合抗EGFR抗體，IgG1)購于百時(shí)美施貴寶公司(Bristol-Myers Squibb)公司。

1.2　方法

1.2.1　CIK細(xì)胞的體外擴(kuò)增及鑒定　肝素抗凝管收集健康志愿者外周靜脈血 30mL，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。將分離的 PBMC接種于T25細(xì) 胞 培 養(yǎng) 瓶 內(nèi)，用 GT-T551無 血 清 培 養(yǎng) 基(Takara公司)調(diào)整細(xì)胞密度為 1109個(gè)/L。細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于 37℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)，第 1天加入 1000000IU/LIFN-(PeproTech公司)及1%的自體血漿，24h后加入 300000U/L白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2，北京四環(huán)生物公司)和50g/L抗 CD3單克隆抗體(RD公司)繼續(xù)培養(yǎng)，每隔 3～4d補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1109個(gè)/L，同時(shí)補(bǔ)加 300000U/LIL-2，第 14～16天時(shí)開始收集細(xì)胞。

1.2.2　CIK細(xì)胞表型和 DLD-1、Caco-2細(xì)胞膜表面分子檢測　通過流式細(xì)胞檢測，按照 1106個(gè)/樣本將 CIK、DLD-1及 Caco-2細(xì)胞加入流式管中，洗細(xì)胞 2次，震蕩混勻后加入 Fc封閉抗體 anti-CD16/CD32封閉作用 30min。分別加入流式抗體FITC-鼠抗人 EGFR單抗(ebioscience)、FITC-鼠抗人 CD3單抗(BD)、PE-鼠抗人 CD56單抗(BD)、APC-鼠抗人 CD8單抗、APC-鼠抗人 CD16單抗或同型對照抗體，混勻后 4℃避光結(jié)合 30min，洗細(xì)胞 2次 去 除 未 結(jié) 合 的 抗 體，PBS重 懸 細(xì) 胞。BeckmanFC500型流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowjo10.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，滿足 CD3+CD56+20%，CD3+CD8+60%的 CIK細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3　培養(yǎng)液上清中的細(xì)胞因子水平檢測　通過ELISA法，分別收集培養(yǎng)第 1天及第 14天的 CIK細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分裝后 -80℃保存?zhèn)溆?。?xì)胞因子檢測：IFN-及 TGF-測定均采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒說明書操作;以標(biāo)準(zhǔn)品 450nm處的吸光度(OD)值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品中細(xì)胞因子的含量，每份樣本設(shè) 3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4　CIK細(xì)胞聯(lián)合西妥昔單抗對人結(jié)直腸癌細(xì)胞的殺傷作用　通過實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀(real time cellular analysis，RTCA，美國 ACEA公司)檢測，向 RTCA檢測板的檢測孔分別加入 100L完全培養(yǎng)液，放入 RTCA中讀取背景數(shù)據(jù)。取出 RT-CA檢測板接種預(yù)先制備的細(xì)胞懸液，DLD-1及Caco-2細(xì)胞分別以 2104及 1.5104個(gè)/孔接種，設(shè)腫瘤細(xì)胞單獨(dú)組、CIK-腫瘤細(xì)胞組及 CIK聯(lián)合西妥昔單抗-腫瘤細(xì)胞組，每組細(xì)胞設(shè)置 3個(gè)復(fù)孔，將 RTCA檢測板再次放回 RTCA，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 24h后加入西妥昔單抗(1mg/L)50L，其余孔補(bǔ)加 50L完全培養(yǎng)基?？贵w孵育1h后按照 20∶1效靶比加入 CIK細(xì)胞 50L。將RTCA檢測板再次放回 RTCA儀，設(shè)置每隔 15min監(jiān)測并記錄細(xì)胞指數(shù)(cellindex，CI)值，連續(xù)監(jiān)測45h，選擇實(shí)驗(yàn)第 45h數(shù)據(jù)計(jì)算殺傷率。按照下列公式計(jì)算：細(xì)胞殺傷率% =(對照組 CI值 -實(shí)驗(yàn)組 CI值)/對照組 CI值 100%。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 Graph Pad Prism軟件來進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差(xs)表示，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料比較采用 t檢驗(yàn)，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　Caco-2及 DLD-1細(xì)胞表面的 EGFR表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)中所使用的 Caco-2及 DLD-1細(xì)胞表面EGFR均高表達(dá)，分別為 81.6%及 82.9%。見圖 1。

2.2CIK細(xì)胞亞群

倒置顯微鏡下觀察 CIK細(xì)胞生長情況，誘導(dǎo)前細(xì)胞體積較小，呈圓形散在分布，在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中細(xì)胞體積逐漸增大，培養(yǎng)第 5天細(xì)胞開始形成細(xì)胞集落，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而集落增多，培養(yǎng)至第 14天時(shí)細(xì)胞體積明顯增大，CIK細(xì)胞于培養(yǎng)基中懸浮成團(tuán)分布，數(shù)量顯著增多。見圖 2。與培養(yǎng)前比較，CIK細(xì)胞經(jīng)過 14d的體外活化擴(kuò)增后 CIK細(xì)胞亞群中 CD8+T、CD3+CD56+NKT及 CD16+CD56+NK細(xì)胞比例均顯著增高(P0.01或 P0.05)。見表 1。

2.3　CIK細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的 IFN-及 TGF-水平

ELISA結(jié)果顯示，與培養(yǎng)第 1天比較，CIK細(xì)胞培養(yǎng)第 14天時(shí)，培養(yǎng)基的上清液中 IFN-水平由 34.835.4ng/L增高為 2041.8697.9ng/L(P 0.01)，而 TGF- 的 水 平 由 1 293.8633.9ng/L下降為 116.726.8ng/L(P0.01)。見圖 3。

2.4　CIK細(xì)胞聯(lián)合西妥昔單抗對 DLD-1及 Caco-2細(xì)胞的殺傷作用

將經(jīng)過 14d體外擴(kuò)增培養(yǎng)的 CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，結(jié)合有抗 EGFR單抗西妥昔單抗的腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按照 20∶1的效靶比將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng)，RTCA法檢測 CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。圖 4中顯示 CIK細(xì)胞對 DLD-1及Caco-2細(xì)胞株的殺傷率分別為 16.04% 0.87%及 27.67% 3.10%，而當(dāng)聯(lián)合使用 1mg/L抗 EG-FR西妥昔單抗后殺傷率分別增高到 31.56% 3.55%及 35.96% 1.73%。

3　討論

篇8

〔關(guān)鍵詞〕HSV;CDK;細(xì)胞周期蛋白;CDK抑制劑

〔中圖分類號〕R373〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔文章編號〕1009-6019-(2010)04-81-04

單純皰疹病毒(herpessimplexviruses,HSV)是最早被發(fā)現(xiàn)的皰疹病毒,也是被研究最深入的病毒之一,但對其生物學(xué)特性仍然不很清楚。HSV的最主要的特征是其與宿主細(xì)胞的相互作用復(fù)雜并且為保持長期生存有著雙重的生命周期〔1〕。由于其與宿主細(xì)胞復(fù)雜的相互作用,HSV已成為研究蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位、神經(jīng)系統(tǒng)中突觸連接、膜結(jié)構(gòu)、真核基因的表達(dá)調(diào)節(jié)、基因治療、病毒與宿主細(xì)胞相互作用及其他生物學(xué)問題的重要模型和工具〔2〕。本文就近年來HSV復(fù)制與細(xì)胞周期蛋白的關(guān)系的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1HSV概況

HSV屬于α皰疹病毒科,包括HSV-1和HSV-2兩種,以HSV-1為代表(以下簡稱為HSV)。HSV是大型的有包膜的雙螺旋DNA蛋白,基因組全長約152kb,GC含量占68%以上。HSV基因組為一線性雙鏈DNA分子,由共價(jià)連接的長片段(L)和短片段(S)組成,兩者分別占病毒DNA的82%和18%,每一片段由中間的獨(dú)特序列(分別稱為UL和US)和兩端的倒置重復(fù)序列(RL和RS)組成。HSV基因組共約含有74個(gè)基因,編碼近90種蛋白質(zhì)。根據(jù)其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)可將HSV病毒基因分為立即早期基因(immediate-early,IE或α),早期基因(early,E或β)和晚期基因(late,L或γ)3類〔3〕。HSV感染包括增殖性感染和潛伏性感染兩種,除引起皮膚和粘膜的皰疹樣病變外,還能引起諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖器官以及流產(chǎn)、死胎和腫瘤等多種疾病〔3〕。

2HSV與細(xì)胞周期

在正常的情況下,周期中細(xì)胞分為分裂期(M期)和分裂間期,分裂間期包括Gl、S、G2等3個(gè)時(shí)期。細(xì)胞僅在S期含有DNA半保留復(fù)制所需的代謝底物、酶和蛋白因子,因此不編碼大部分DNA復(fù)制所需蛋白的DNA病毒紛紛采取獨(dú)特的策略克服這一變化的核環(huán)境問題。小DNA病毒采取的生存策略就是當(dāng)被感染的細(xì)胞進(jìn)入S期、條件合適時(shí)再復(fù)制其病毒DNA〔4〕。對比之下,象HSV這樣的大DNA病毒,不僅能在分裂細(xì)胞中繁殖,而且還能在靜止細(xì)胞及終末分化的神經(jīng)細(xì)胞中繁殖,因此長期以來一直認(rèn)為大DNA病毒復(fù)制與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白無關(guān)。但近年來的研究發(fā)現(xiàn),HSV復(fù)制不僅需要細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,而且己進(jìn)化到能誘導(dǎo)靜止細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,HSV感染后誘導(dǎo)宿主細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期某一特定時(shí)相,抑制宿主細(xì)胞DNA合成,抑制細(xì)胞凋亡,但支持HSVDNA的復(fù)制,完全為HSV服務(wù)。

2.1HSV感染引起細(xì)胞周期阻滯1988年deBruyn和Knipe用原位雜交技術(shù)確鑿的證明HSV感染引起細(xì)胞DNA合成的抑制〔5〕。人們認(rèn)為這種DNA合成的阻滯是因?yàn)镠SV感染使細(xì)胞周期阻滯于G1/S期檢驗(yàn)點(diǎn)導(dǎo)致的。流式細(xì)胞儀分析表明HSV感染的確能引起細(xì)胞周期阻滯,G1期細(xì)胞增加。Dargan等用無DNA的HSV蛋白感染細(xì)胞也能引起細(xì)胞周期阻滯,且并不導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。說明不是因?yàn)镠SVDNA的合成導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯的,是HSV外殼蛋白對細(xì)胞周期相關(guān)因子起到了抑制作用。多項(xiàng)研究綜合表明是HSV中的ICPO和ICP27蛋白的作用引起的細(xì)胞周期阻滯〔6〕。

HSV具有高度的易感性,其宿主細(xì)胞廣泛,能感染分裂期或非分裂期細(xì)胞,是較理想的基因治療載體。HSV能引起細(xì)胞周期阻滯某種程度上說是對細(xì)胞有一定毒性作用的。鑒于這種細(xì)胞周期的阻滯作用是由于ICPO、ICP27引起的,基于ICPO/ICP27的基因表達(dá)載體構(gòu)建對于病毒的基因治療將有重要意義。

HSV既能在靜止細(xì)胞也能在周期細(xì)胞中繁殖,而且本身還編碼DNA聚合酶等復(fù)制相關(guān)蛋白,HSV感染使細(xì)胞周期阻滯是否是為了本身的繁殖目前還不清楚。有報(bào)道說細(xì)胞組蛋白與HSVDNA結(jié)合會(huì)抑制病毒DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄〔7〕。也有人認(rèn)為細(xì)胞周期阻滯是宿主對抗病毒的一種平衡。我們更傾向于認(rèn)為是由于HSV對細(xì)胞代謝的改變亦即通過抑制細(xì)胞DNA的合成,減少原料、細(xì)胞因子的浪費(fèi),而使細(xì)胞被動(dòng)的停滯在G1/S期檢驗(yàn)點(diǎn)。

2.2HSV復(fù)制需要細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的活性曾一度認(rèn)為HSV復(fù)制不需要細(xì)胞周期相關(guān)蛋白。但研究發(fā)現(xiàn),HSV在周期細(xì)胞中的復(fù)制效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于靜止細(xì)胞,HSV雖然編碼DNA聚合酶等DNA合成相關(guān)蛋白,但不編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶、DNA連接酶,而且可在病毒復(fù)制蛋白缺乏的條件下復(fù)制,那么此時(shí)HSVDNA復(fù)制蛋白只能由宿主細(xì)胞來提供。而HSV感染能引起細(xì)胞周期阻滯在并不表達(dá)這些酶和蛋白的G1期,并且HSVDNA得到復(fù)制,說明HSV可能誘導(dǎo)了S期相關(guān)蛋白在Gl期的表達(dá)。這就促使人們研究HSV細(xì)胞周期相關(guān)因子在HSV繁殖中的作用。

早在1978年Yanagi等研究發(fā)現(xiàn),HSV不能在非允許溫度下阻滯于G1期的溫度敏感型幼倉鼠腎細(xì)胞(tsBHK)突變株tsAF8中繁殖,但能在允許和非允許溫度下阻滯于S期的tsBHK突變株tsHJ4中繁殖。對這一結(jié)果最簡單的解釋就是HSV復(fù)制需要S期相關(guān)蛋白。后經(jīng)一系列的實(shí)驗(yàn)證實(shí)tsAF8中編碼細(xì)胞周期相關(guān)蛋白HCF-l(Themammaliantranscriptionalcoactivatorhostcellfactor-1)的基因發(fā)生了突變,亦即細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)因子HCF是HSV繁殖所必需?，F(xiàn)證明HCF與oct-1及間層蛋白V16結(jié)合作用于立即早期基因增強(qiáng)子核心序列TATGRAT上促進(jìn)立早基因的轉(zhuǎn)錄〔8〕。

E2F是促進(jìn)Gl/S期以及S期相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的主要轉(zhuǎn)錄激活因子,關(guān)于E2F在HSV感染細(xì)胞中活性變化的報(bào)道結(jié)果不一。有報(bào)道說HSV感染后代表GO/G1期特征的抑制性復(fù)合物E2F/pRb、E2F/p107增加,許多依賴轉(zhuǎn)錄因子E2F的S期相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄下降〔9〕。ICP4、ICP27功能缺陷型HSV感染宿主細(xì)胞后不能引起E2F以及S期標(biāo)志物EZF/p107活性的升高。說明可能是HSV中ICP4、ICP27蛋白起到了誘導(dǎo)宿主細(xì)胞E2F基因表達(dá)的作用。Song等的結(jié)果進(jìn)一步證明抑制性復(fù)合物E2F/pRb和E2F/p107增加是由于HSV中ICP4、ICP27、ICP0的作用結(jié)果。因此認(rèn)為E2F以及S期標(biāo)志物E2F/p107可能在HSV基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起重要作用。

與正常細(xì)胞的Gl期不同,許多S期相關(guān)蛋白存在于HSV感染的處于G1期的細(xì)胞中。這種HSV能獨(dú)立于細(xì)胞周期而誘導(dǎo)細(xì)胞S期基因表達(dá)但使細(xì)胞呈G1期狀態(tài),說明HSV能改變多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的活性,為HSV復(fù)制服務(wù)。HSV與細(xì)胞周期有著廣泛的相互作用,盡管詳細(xì)的作用蛋白和作用機(jī)理尚未闡明,各家觀點(diǎn)不一,但對這些研究進(jìn)行綜合所得出的一般結(jié)論是:HSV復(fù)制與細(xì)胞周期密切相關(guān),細(xì)胞周期相關(guān)蛋白在HSV復(fù)制中起重要作用。其中細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclindependentkinases,CDK)是HSV繁殖所必需。

3CDK在HSV復(fù)制中的作用機(jī)制

CDK:周期蛋白依賴性蛋白激酶,屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,它只有與相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白(cyclin)結(jié)合后才有活性。1998年Shang等對很多抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、細(xì)胞某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑的抗病毒作用的篩選結(jié)果表明,只有能抑制CDK1、2、5、7的藥理學(xué)CDKs抑制劑(pharmacologicalCDKSinhibitors,PCI)Roscovitine能抑制HSV的復(fù)制,此抑制作用發(fā)生于對細(xì)胞周期的抑制之前,且PCI對HSV的抑制程度與其對CDK的抑制程度相關(guān)〔10〕。也就是說不是細(xì)胞周期的阻滯,而是CDK活性的抑制使HSV基因的轉(zhuǎn)錄以及DNA的復(fù)制不能進(jìn)行,說明了CDK在病毒復(fù)制中的重要性。

3.1CDK可能通過促進(jìn)RNA聚合酶ⅡCTD的磷酸化而促進(jìn)HSV基因轉(zhuǎn)錄的起始Roscovitine抑制HSV的轉(zhuǎn)錄可能是通過抑制起到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的CDK進(jìn)行的。RNA聚合酶Ⅱ在轉(zhuǎn)錄起始前先要形成轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物,然后其羧基末端結(jié)構(gòu)域(carboxyl-terminaldomain,CTD)被CDK7等磷酸化從而使RNA聚合酶Ⅱ從轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物中釋放出來起始轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄過程中RNA聚合酶Ⅱ的CTD進(jìn)一步被CDK9磷酸化。CDK1、2也參與RNA聚合酶ⅡCTD的磷酸化〔11〕。因此CDK活性的抑制可能影響到RNA聚合酶ⅡCTD的磷酸化從而抑制HSV基因的轉(zhuǎn)錄起始。體外提取HSV感染的細(xì)胞核,用Run-On實(shí)驗(yàn)證明Roscovitine能抑制HSV立即早期基因轉(zhuǎn)錄的起始,在轉(zhuǎn)錄起始后加入能抑制CDK1、2、5、7的Roscovitine并不影響HSV立即早期轉(zhuǎn)錄本的量,說明Roscovitine對轉(zhuǎn)錄的延長過程沒有作用,只是抑制轉(zhuǎn)錄的起始。參與轉(zhuǎn)錄延長的是CDK9,CDK5的功能不涉及轉(zhuǎn)錄,而CDK1僅在HSV感染后期起作用。那么可能是CDK2、7是HSV轉(zhuǎn)錄起始所必需的。

3.2CDK可能通過影響HSV染色體的構(gòu)象而促進(jìn)HSV基因轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝Roscovitine能抑制HSV基因的轉(zhuǎn)錄但對細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄沒有影響,甚至在Roscovitine存在下細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本的量更多。說明可能Roscovitine并不是單純通過抑制依賴于CDK的RNA聚合酶Ⅱ的CTD而抑制HSV基因的轉(zhuǎn)錄的。由于Roscovitine抑制基因的轉(zhuǎn)錄與啟動(dòng)子無關(guān)〔12〕,我們推論CDK可能通過影響HSV染色體的構(gòu)象而影響HSV基因的轉(zhuǎn)錄。目前支持這一推論的實(shí)驗(yàn)還不多。我們的初步實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn):未用Roscovitine處理的轉(zhuǎn)錄活躍的HSV基因組能被DNA酶水解成彌漫狀,而用Roscovitine處理的HSV基因組能夠抵抗DNA酶的水解。說明Roscovitine處理和非處理的HSV染色體構(gòu)象不同,CDK的確對HSV染色體的構(gòu)象有影響。有學(xué)者研究,只要HSV啟動(dòng)子結(jié)合了各種轉(zhuǎn)錄因子及RNA聚合酶形成了轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物,HSV基因的轉(zhuǎn)錄就不受Roscovitine的影響。說明Roscovitine并沒有作用于HSV轉(zhuǎn)錄的起始過程,而是影響了HSV染色體的活化阻止了轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物在HSV啟動(dòng)子上的組裝從而抑制了HSV基因的轉(zhuǎn)錄。亦即CDK可能通過促進(jìn)HSV染色體的活化而促進(jìn)了HSV基因的轉(zhuǎn)錄。

3.3CDK可能通過使HSv調(diào)控蛋白磷酸化而促進(jìn)HSV基因的轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)的磷酸化是調(diào)控蛋白質(zhì)生物活性的重要方式。HSV基因組中僅編碼兩種蛋白激酶(UL13,US13)〔13〕,不能滿足HSV調(diào)節(jié)蛋白磷酸化的需要。因此細(xì)胞蛋白激酶在通過磷酸化調(diào)控HSV蛋白中起重要作用,其中CDK可能通過促進(jìn)HSV調(diào)控蛋白的磷酸化而促進(jìn)HSV基因的轉(zhuǎn)錄和DNA的復(fù)制。

ICPO和ICP4是調(diào)控HSV基因轉(zhuǎn)錄的主要蛋白。Roizman等發(fā)現(xiàn)Roscovitine能抑制ICP0和ICP4的磷酸化。Davido等發(fā)現(xiàn)在Roscovitine存在下ICP0的電泳特性不同亦即ICP0的結(jié)構(gòu)有所不同,Roscovitine影響了ICPO的轉(zhuǎn)錄后加工過程。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在Roscovitine存在下ICPO對早期基因ICP6轉(zhuǎn)錄激活作用大大下降。這一結(jié)果與前述Roscovitine即使在立即早期蛋白得到表達(dá)仍然能夠抑制HSV早期基因的轉(zhuǎn)錄的結(jié)果一致,立即早期蛋白必須經(jīng)過CDK的修飾活化才能促進(jìn)早期基因的轉(zhuǎn)錄。

綜上,與小的DNA病毒類似,HSV的復(fù)制也與細(xì)胞周期密切相關(guān)。HSV在周期細(xì)胞中的復(fù)制速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于靜止細(xì)胞。HSV感染引起細(xì)胞周期阻滯但誘導(dǎo)了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性以促進(jìn)HSV的的復(fù)制。CDK可能通過通過促進(jìn)RNA聚合酶CTD的磷酸化、影響HSV染色體的構(gòu)象、使HSV調(diào)控蛋白以及細(xì)胞蛋白的磷酸化等多種機(jī)制促進(jìn)HSV基因的轉(zhuǎn)錄和DNA的復(fù)制。

4展望

目前發(fā)現(xiàn)能被PCI抑制的病毒越來越多,亦即眾多的病毒的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄都需要CDK〔14〕。說明CDK2在病毒復(fù)制中作用的普遍性。CDK似乎是病毒與宿主細(xì)胞抗衡的的焦點(diǎn)。因此CDK抑制劑正在作為抗病毒藥物進(jìn)行積極的研發(fā)中,PCI作為抗腫瘤藥已進(jìn)入臨床二期實(shí)驗(yàn)階段。雖然自從1998年首次發(fā)現(xiàn)PCI能抑制HSV的繁殖以來,關(guān)于PCI抗病毒作用的研究較多,但是具體哪種CDK在HSV繁殖中起作用,在HSV感染的哪一階段起作用所知不多。正像過去HSV是研究真核生物轉(zhuǎn)錄機(jī)理及調(diào)控的模型一樣,目前HSV也成了研究病毒于宿主細(xì)胞相互作用以及抗病毒藥物研制開發(fā)的重要模型。深入研究CDK與HSV復(fù)制的關(guān)系將會(huì)對HSV以及其他重要疾病病毒在細(xì)胞內(nèi)的活動(dòng)過程有更清晰的認(rèn)識(shí),同時(shí)對PCI作為抗病毒藥的研發(fā)具有重要意義。

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篇9

中小企業(yè)是與所處行業(yè)的大企業(yè)相比人員規(guī)模、資產(chǎn)規(guī)模與經(jīng)營規(guī)模都比較小的經(jīng)濟(jì)單位。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,中小企業(yè)日益成為國民經(jīng)濟(jì)的重要力量。但是,

(三)努力促進(jìn)商業(yè)性擔(dān)保機(jī)構(gòu)的擴(kuò)大和發(fā)展

從結(jié)構(gòu)上來看,

雖然商業(yè)擔(dān)保是以盈利為目的,而中小企業(yè)貸款又呈現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)高和缺少反擔(dān)保品的特點(diǎn),但是中小企業(yè)貸款擔(dān)保市場還是有足夠的吸引力吸引民間資本的進(jìn)入。首先,從需求來說中小企業(yè)始終存在資金缺口。需要外源性間接融資,但中小企業(yè)的資信有限,所以離不開外部的融資擔(dān)保。中小企業(yè)擔(dān)保市場的需求是客觀存在的,市場容量也很大。其次,商業(yè)擔(dān)保機(jī)構(gòu)可以采用多種風(fēng)險(xiǎn)分散機(jī)制來規(guī)避自身的擔(dān)保風(fēng)險(xiǎn)。如再擔(dān)保、參加貸款保險(xiǎn)、反擔(dān)保條款和實(shí)行經(jīng)營多元化等。政府除了積極建立再擔(dān)保機(jī)構(gòu)外,還應(yīng)該從工商和財(cái)稅等方面提供優(yōu)惠政策,扶持和鼓勵(lì)民間資本型中小企業(yè)擔(dān)保機(jī)構(gòu)的發(fā)展。

(四)建立健全有關(guān)法律制度,營造擔(dān)保業(yè)發(fā)展的良好的運(yùn)行環(huán)境

完善的法律體系是信用擔(dān)保業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的制度保障。綜觀美國、日本等發(fā)達(dá)國家的信用擔(dān)保體系,其共同點(diǎn)之一首先是相應(yīng)的法律、法規(guī)建設(shè)非常完善。編輯整理

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篇10

一、信息非對稱視角下中小企業(yè)融資障礙

根據(jù)古典經(jīng)濟(jì)學(xué)理論，在以對稱信息、完全競爭、生產(chǎn)要素自由流動(dòng)為特征完善市場條件下，主要由信貸市場的價(jià)格杠桿—利率來調(diào)節(jié)信貸資金的供給和需求，最終使信貸市場趨于均衡，信貸資源配置實(shí)現(xiàn)了帕累托最優(yōu)。但是，現(xiàn)實(shí)中很難具備的這種理想條件，非對稱信息現(xiàn)象是處處存在。根據(jù)非對稱理論不對稱信息可以分為事前非對稱和事后非對稱兩類。在信貸市場上，事前非對稱信息主要包括有關(guān)企業(yè)資產(chǎn)運(yùn)營能力、償債能力、發(fā)展能力、投資項(xiàng)目質(zhì)量等信息非對稱，導(dǎo)致逆向選擇。事后信息非對稱主要是指經(jīng)營管理者對投資項(xiàng)目的決策以及經(jīng)營者本身素質(zhì)能力等信息非對稱，導(dǎo)致道德風(fēng)險(xiǎn)。信息非對稱，成為中小企業(yè)中融資的主要障礙。

（一）內(nèi)部治理結(jié)構(gòu)缺陷增加企業(yè)邊際信用成本 企業(yè)內(nèi)部的信息結(jié)構(gòu)應(yīng)與其內(nèi)部治理結(jié)構(gòu)相匹配。多數(shù)中小企業(yè)是家族式企業(yè)，采用集權(quán)式管理模式，一般是最高管理層直接指揮操作層的員工進(jìn)行生產(chǎn)活動(dòng)，中層管理人員很少甚至不參與?；鶎有畔⒘闼榍曳稚ⅲǔＲ圆灰?guī)范的表達(dá)形式傳遞給最高管理層。中小企業(yè)的這種信息結(jié)構(gòu)在一定程度上減少內(nèi)部信息利用成本，卻增大了外部投資者、債權(quán)人、供應(yīng)商等外部信息使用者獲取和利用信息的成本，減少了信息對外披露的透明度。中小企業(yè)融資問題從根本取決于外部投資者和債權(quán)人等資金供給者對企業(yè)內(nèi)部各種信息的信任度。因此，中小企業(yè)信息披露不規(guī)范必然會(huì)增加融資的邊際信用成本。

（二）中小企業(yè)自身特性增加銀行的交易成本 一般而言，在利息給定的情況下，影響銀行貸款決策的根本因素是銀行對客戶對象的風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和評估。中小企業(yè)多為個(gè)人或家族管理，規(guī)模小、經(jīng)營周期短，而且基本上不需要由會(huì)計(jì)師事務(wù)所對其財(cái)務(wù)報(bào)表進(jìn)行審計(jì)，一般信息內(nèi)部化不透明。商業(yè)銀行貸款決定前，不得不耗費(fèi)大量的時(shí)間來調(diào)查企業(yè)的財(cái)務(wù)和信用狀況以防范逆向選擇問題；發(fā)放貸款后，加大對借貸資金使用的監(jiān)管力度，以防范道德風(fēng)險(xiǎn)問題。此外，中小企業(yè)由于缺少符合銀行標(biāo)準(zhǔn)要求的抵押品和擔(dān)保人，銀行也很難提供抵押擔(dān)保貸款。因此，國有銀行才能夠防范信息非對稱可能產(chǎn)生的道德風(fēng)險(xiǎn)，對于中小企業(yè)的小規(guī)模融資需求需要支付額外的信用評估與監(jiān)督成本，以此防范信息非對稱，導(dǎo)致交易成本增加。

（三）中小企業(yè)非國有產(chǎn)權(quán)加劇信息非對稱風(fēng)險(xiǎn) 我國中小企業(yè)主要由鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)、城鎮(zhèn)集體企業(yè)、個(gè)體私營企業(yè)等非國有經(jīng)濟(jì)組成，約占80%，其非國有產(chǎn)權(quán)的特性削弱了銀行對其放貸的意愿。由于我國傳統(tǒng)的體制因素，國有銀行、國有企業(yè)和國家財(cái)政在產(chǎn)權(quán)上都屬于中央政府，而中央政府并沒有建立有效的權(quán)力與約束相對稱的國有產(chǎn)權(quán)經(jīng)營管理體制，所以，國有產(chǎn)權(quán)在經(jīng)營管理上呈現(xiàn)出風(fēng)險(xiǎn)的“軟約束”。國有銀行貸款給國有企業(yè)時(shí)無須過多考慮國有企業(yè)的逆向選擇和道德風(fēng)險(xiǎn)問題，因?yàn)樾畔⒎菍ΨQ造成的風(fēng)險(xiǎn)最終會(huì)由國家財(cái)政來化解。所以國有商業(yè)銀行并不完全按照風(fēng)險(xiǎn)與收益對等的原則來確定貸款對象。當(dāng)銀行貸款給非國有的中小企業(yè)時(shí)，由于產(chǎn)權(quán)歸屬不同，國有商業(yè)銀行不能將信息非對稱風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)嫁給政府，完全由銀行來承擔(dān)，從而導(dǎo)致國有商業(yè)銀行在貸款給中小企業(yè)時(shí)出現(xiàn)“惜貸”現(xiàn)象。

二、信用擔(dān)保是解決信息非對稱的有效途徑

在信息非對稱的條件下，解決中小企業(yè)融資難問題，實(shí)質(zhì)上就是解決信息非對稱問題。中小企業(yè)信用擔(dān)保發(fā)揮作用，其核心在于直接減少信息非對稱或規(guī)避和抑制逆向選擇和道德風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生，使得更多中小企業(yè)獲得信貸支持，同時(shí)分散了銀行貸款風(fēng)險(xiǎn)，擴(kuò)大了銀行信貸規(guī)模和收益。

（一）信用擔(dān)保能夠提升中小企業(yè)信用水平與融資能力 由于自身特性因素，中小企業(yè)普遍存在著信用缺失的問題。無論自身資格條件還是抵押擔(dān)保條件都達(dá)不到銀行規(guī)定要求，中小企業(yè)很難直接從銀行獲得資金支持。管理規(guī)范的中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)具有嚴(yán)密的風(fēng)險(xiǎn)管理措施，在擔(dān)保對象的準(zhǔn)入門檻、融資擔(dān)保規(guī)模的控制、反擔(dān)保措施的落實(shí)、擔(dān)保運(yùn)作程序等方面，均有明確的管理規(guī)程，并在工作中嚴(yán)格執(zhí)行。因此，由上述機(jī)構(gòu)提供介入擔(dān)保，協(xié)作銀行對其具有較高的信任度，能使中小企業(yè)信用得到提升。擔(dān)保機(jī)構(gòu)除為中小企業(yè)提供融資擔(dān)保服務(wù)外，還為中小企業(yè)提供創(chuàng)業(yè)指導(dǎo)、信息咨詢、信用評級等方面服務(wù)，促進(jìn)中小企業(yè)加強(qiáng)信用管理，樹立信用意識(shí)，營造良好企業(yè)信用環(huán)境。

（二）信用擔(dān)保有利于銀行分散風(fēng)險(xiǎn)、降低管理成本 由于中小企業(yè)資產(chǎn)規(guī)模較小、經(jīng)營管理能力較弱、缺乏市場競爭力，另一方面金融機(jī)構(gòu)對中小企業(yè)信貸激勵(lì)機(jī)制沒有建立起來，商業(yè)銀行出于資產(chǎn)的質(zhì)量和貸款的安全性等要求，更傾向于將資金投放于大型企業(yè)。管理規(guī)范、運(yùn)作專業(yè)的中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)介入中小企業(yè)貸款業(yè)務(wù)后，對受保中小企業(yè)、企業(yè)業(yè)主和主要經(jīng)營者從道德、責(zé)任、財(cái)務(wù)、市場、政策、過程等方面實(shí)施全方位的考核和監(jiān)控，與銀行注重企業(yè)財(cái)務(wù)報(bào)表信貸考核體系形成優(yōu)勢互補(bǔ)，提高了對信貸風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別、評估和控制能力。同時(shí)，信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)方面作為中小企業(yè)貸款風(fēng)險(xiǎn)的直接承擔(dān)者，使銀行的信貸風(fēng)險(xiǎn)得到轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)了銀行貸款的信心。

（三）信用擔(dān)保促進(jìn)了政府對中小企業(yè)的政策扶持作用 與大企業(yè)相比，中小企業(yè)在管理、信息、資金、技術(shù)、人才等方面都處于弱勢地位。由于中小企業(yè)在促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展和解決就業(yè)等方面都發(fā)揮著重要作用，國家和地方出臺(tái)多項(xiàng)優(yōu)惠政策，從稅收、用地、用工等方面對中小企業(yè)進(jìn)行扶持，多面促進(jìn)和支持中小企業(yè)的發(fā)展。能夠獲得足夠的資金支持是各項(xiàng)對中小企業(yè)扶持政策充分發(fā)揮作用的前提條件。信用擔(dān)?？梢跃徑庵行∑髽I(yè)融資難的問題，有利于各項(xiàng)政府政策的扶持功能的充分發(fā)揮。

（四）信用擔(dān)保有利于優(yōu)化社會(huì)信用環(huán)境 信用是市場經(jīng)濟(jì)的基礎(chǔ)。市場化程度越高，對信用的要求就越高?，F(xiàn)代金融、商品交換都是構(gòu)建在信用之上的。企業(yè)作為我國市場經(jīng)濟(jì)主體的重要組成部分，其信用水平直接影響著市場經(jīng)濟(jì)秩序，企業(yè)信用等級越高，整個(gè)市場經(jīng)濟(jì)的信用等級也會(huì)越高。信用擔(dān)保的出現(xiàn)，為企業(yè)贏得較高的信用等級獲得長期的資金支持，同時(shí)對優(yōu)化社會(huì)的信用環(huán)境起到了重要的引導(dǎo)作用，是提升整個(gè)社會(huì)信用水平的必然選擇。

三、中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)制構(gòu)建思路

（一）多層次的信用擔(dān)保體系 信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)作為市場經(jīng)濟(jì)重要的參與主體，是中小企業(yè)信用體系建設(shè)的重要組成部分。根據(jù)我國中小企業(yè)自身特點(diǎn)，建立一個(gè)多層次、多渠道的信用擔(dān)保體系。依據(jù)《擔(dān)保法》和有關(guān)法律規(guī)定，分別建立企業(yè)法人、事業(yè)法人和社團(tuán)法人三類法律形式三種擔(dān)保機(jī)構(gòu)：（1）以政府為主體信用擔(dān)?；?，在政府機(jī)構(gòu)的監(jiān)管下實(shí)行市場化運(yùn)作，其基金主要來源于地方政府財(cái)政預(yù)算撥款、社會(huì)發(fā)行債券集資、中小企業(yè)閑置資金。（2）地方政府、金融機(jī)構(gòu)和本地企業(yè)共同出資組建的擔(dān)保公司。由地方財(cái)政部門推薦中小企業(yè)，并對金融機(jī)構(gòu)做出承諾保證責(zé)任，由擔(dān)保公司為當(dāng)?shù)氐闹行∑髽I(yè)提供擔(dān)保。（3）會(huì)員制的擔(dān)保機(jī)構(gòu)，由若干中小企業(yè)聯(lián)合組成信用共同體，實(shí)行封閉式基金運(yùn)作形式，按“風(fēng)險(xiǎn)共擔(dān)，利益共享”的原則運(yùn)作。

（二）多元化的信用評級機(jī)制 要建立以中小企業(yè)、政府相關(guān)部門、擔(dān)保機(jī)構(gòu)、再擔(dān)保機(jī)構(gòu)、中介機(jī)構(gòu)和金融機(jī)構(gòu)為主體的信用評級機(jī)制，其主要職能為信用登記、信用采集、信用評估和信用。首先，由政府相關(guān)部門與再擔(dān)保公司組織聘請權(quán)威評級機(jī)構(gòu)對貸款擔(dān)保機(jī)構(gòu)實(shí)施信用評級，根據(jù)評定的等級對擔(dān)保機(jī)構(gòu)實(shí)行差異化管理。其次，政府有關(guān)部門組織信用評級機(jī)構(gòu)，每年定期對有信貸需求的中小企業(yè)開展信用評級，銀行金融機(jī)構(gòu)可以向符合信貸標(biāo)準(zhǔn)的中小企業(yè)提供融資服務(wù)；對信用等級較低的中小企業(yè)，通過信用培育幫助其提高信用水平。最后，在擔(dān)保機(jī)構(gòu)、再擔(dān)保公司、銀行、企業(yè)、政府之間的建立信息互通機(jī)制，解決融資中信息非對稱問題。

（三）擔(dān)保機(jī)構(gòu)的資金補(bǔ)償機(jī)制 可以借鑒國外通行做法，建立中小企業(yè)信用擔(dān)保體系風(fēng)險(xiǎn)補(bǔ)償基金?；鹬饕獊碓词钦磕暝陬A(yù)算內(nèi)安排一定的資金設(shè)立扶持擔(dān)保機(jī)構(gòu)發(fā)展專項(xiàng)資金，為擔(dān)保公司對民營及中小企業(yè)開展擔(dān)保業(yè)務(wù)提供適當(dāng)?shù)慕?jīng)濟(jì)補(bǔ)償。也可以利用自身的發(fā)展推動(dòng)中小企業(yè)更大的發(fā)展，按照一定比例從征自中小企業(yè)稅收中提取一部分資金專門用于擔(dān)保機(jī)構(gòu)的資金補(bǔ)償。各級政府還可以通過發(fā)行專門用于補(bǔ)償政府中小企業(yè)擔(dān)保資金的專項(xiàng)國債。此外，為促進(jìn)擔(dān)保機(jī)構(gòu)規(guī)范運(yùn)作和可持續(xù)發(fā)展，從擔(dān)保實(shí)力、規(guī)范運(yùn)作、風(fēng)險(xiǎn)控制、無形資產(chǎn)、行業(yè)管理評價(jià)等方面制定中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)擔(dān)?？冃гu價(jià)指標(biāo)體系。

（四）分散與規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制 擔(dān)保是高風(fēng)險(xiǎn)行業(yè)，相關(guān)部門應(yīng)設(shè)計(jì)了一套風(fēng)險(xiǎn)分散機(jī)制，即擔(dān)保機(jī)構(gòu)、銀行和企業(yè)在風(fēng)險(xiǎn)共擔(dān)、利益共享的基礎(chǔ)上共同協(xié)定責(zé)任比例。一是規(guī)范擔(dān)保機(jī)構(gòu)自身運(yùn)作。按合理的比例提取未到期責(zé)任準(zhǔn)備金及風(fēng)險(xiǎn)準(zhǔn)備金，用于防范擔(dān)保賠付。同時(shí)拓寬業(yè)務(wù)范圍，探索與銀行在中小企業(yè)貿(mào)易融資、融資租賃、票據(jù)貼現(xiàn)等業(yè)務(wù)領(lǐng)域的擔(dān)保合作，做大做強(qiáng)擔(dān)保業(yè)務(wù)，提高自身盈利水平；二是對中小企業(yè)實(shí)行風(fēng)險(xiǎn)約束，強(qiáng)化業(yè)主和管理者的責(zé)任，避免道德風(fēng)險(xiǎn)，在擔(dān)保條款中要求主要股東、管理者提供個(gè)人財(cái)產(chǎn)抵押；三是建立完善的信息披露機(jī)制，中小企業(yè)都要向有關(guān)部門匯報(bào)信貸保證計(jì)劃執(zhí)行情況，并審查計(jì)劃預(yù)算執(zhí)行情況。

（五）外部監(jiān)管機(jī)制 首先，由國有資產(chǎn)監(jiān)督管理委員會(huì)、財(cái)政、銀行等部門組成擔(dān)保監(jiān)督委員會(huì)，對擔(dān)保機(jī)構(gòu)進(jìn)行監(jiān)督和政策扶持。擔(dān)保機(jī)構(gòu)應(yīng)采取公司制的形式，要規(guī)范運(yùn)作，防范風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)將政策性中小企業(yè)擔(dān)保機(jī)構(gòu)統(tǒng)一納入中小企業(yè)信用擔(dān)保體系，并實(shí)行市場化運(yùn)作。其次，建立信用擔(dān)保行業(yè)協(xié)會(huì)，加強(qiáng)行業(yè)協(xié)作與自律。協(xié)會(huì)要依據(jù)有關(guān)法律、法規(guī)和政策的規(guī)定，制定統(tǒng)一的業(yè)務(wù)準(zhǔn)則，規(guī)范執(zhí)業(yè)行為，監(jiān)督擔(dān)保機(jī)構(gòu)依法運(yùn)作。同時(shí)，協(xié)會(huì)通過搭建平臺(tái)，通過培訓(xùn)、研討等方式加強(qiáng)擔(dān)保行業(yè)協(xié)作、信息交流，樹立中小企業(yè)信用擔(dān)保機(jī)行業(yè)的良好社會(huì)形象和社會(huì)公信力。

（六）法律保障機(jī)制 要借鑒國外的成功經(jīng)驗(yàn)，完善我國中小企業(yè)信用擔(dān)保的法律法規(guī)。整合現(xiàn)有的《中小企業(yè)促進(jìn)法》、《擔(dān)保法》和《公司法》，盡快出臺(tái)擔(dān)保行業(yè)的專門法律法規(guī)，搭建起中小企業(yè)信用擔(dān)保體系的基本框架，確定信用擔(dān)保活動(dòng)的基本規(guī)則，使其更好地服務(wù)于中小企業(yè)。同時(shí)，完善中小企業(yè)信貸法、中小企業(yè)促進(jìn)法等與信用擔(dān)保有關(guān)的配套法律，為信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)處理企業(yè)信息披露、債權(quán)保護(hù)、欺詐處理等方面提供法律依據(jù)和訴訟渠道，促進(jìn)擔(dān)保機(jī)構(gòu)的整體發(fā)展。另外，還應(yīng)加快有關(guān)社會(huì)信用體系方面的法律法規(guī)建設(shè)，內(nèi)容包括信用等級的評定、資信評估等，以利于中小企業(yè)信用擔(dān)保體系的發(fā)展。

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