導(dǎo)語：如何才能寫好一篇細(xì)胞研究，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公文云整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

1成纖維細(xì)胞的來源及其生物學(xué)特性

成纖維細(xì)胞(fibroblast)是結(jié)締組織中最常見的細(xì)胞，由胚胎時期的間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymalcell)分化而來。在結(jié)締組織中，成纖維細(xì)胞還以其成熟狀態(tài)—纖維細(xì)胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定條件下可以互相轉(zhuǎn)變。

不同類型的結(jié)締組織含成纖維細(xì)胞的數(shù)量不同。通常，疏松結(jié)締組織中成纖維細(xì)胞的數(shù)量比同樣體積的致密結(jié)締組織中所含成纖維細(xì)胞的數(shù)量要少，故分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞多以真皮等致密結(jié)締組織為取材部位［2，3］。

成纖維細(xì)胞形態(tài)多樣，常見的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形態(tài)尚可依細(xì)胞的功能變化及其附著處的物理性狀不同而發(fā)生改變。成纖維細(xì)胞胞體較大，胞質(zhì)弱嗜堿性，胞核較大呈橢圓形，染色質(zhì)疏松著色淺，核仁明顯。電鏡下，其胞質(zhì)可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體，表明它具有合成和分泌蛋白質(zhì)的功能。成纖維細(xì)胞尚可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維及有機基質(zhì)。它合成的前膠原蛋白分子經(jīng)內(nèi)切酶作用，聚合和重排，可形成與成骨細(xì)胞合成分泌的膠原原纖維一樣具有64nm(640?)周期橫紋的膠原原纖維，膠原原纖維經(jīng)互相粘合形成膠原纖維。經(jīng)檢測，這兩種細(xì)胞合成分泌的膠原纖維均是Ⅰ型膠原纖維，在形態(tài)和生化結(jié)構(gòu)上完全相同［4,5］。

處于成熟期或稱靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞，胞體變小，呈長梭形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體均不發(fā)達(dá)，被稱為纖維細(xì)胞。在外傷等因素刺激下，部分纖維細(xì)胞可重新轉(zhuǎn)變?yōu)橛字傻某衫w維細(xì)胞，其功能活動也得以恢復(fù)，參與組織損傷后的修復(fù)。另外，在結(jié)締組織中，仍保留著少量具有分化潛能的間充質(zhì)細(xì)胞，它們在創(chuàng)傷修復(fù)等情況下可增殖分化為成纖維細(xì)胞。

2成纖維細(xì)胞在一般創(chuàng)傷修復(fù)中的表現(xiàn)

各種創(chuàng)傷均會造成不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損，必須通過細(xì)胞增生和細(xì)胞間基質(zhì)的形成來進(jìn)行組織修復(fù)。在此修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞起著十分重要的作用。以傷口愈合過程為例，成纖維細(xì)胞通過有絲分裂大量增殖，并從4～5天或6天開始合成和分泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分，與新生毛細(xì)血管等共同形成肉芽組織，填補傷口組織缺損，為表皮細(xì)胞的覆蓋創(chuàng)造條件。在傷口愈合中，成纖維細(xì)胞主要來源于真皮層的局部成纖維細(xì)胞和未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，以及血管周圍的成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞。內(nèi)臟損傷時，參與修復(fù)過程的成纖維細(xì)胞多來自間質(zhì)和包膜，以及粘膜下或漿膜下層的結(jié)締組織。有人認(rèn)為創(chuàng)傷愈合過程中傷處聚集的大量成纖維細(xì)胞，一方面是由成纖維細(xì)胞通過分裂增殖而來，另一方面，更多地是由鄰近的間充質(zhì)細(xì)胞、纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管周細(xì)胞等演變或游走到傷處。在創(chuàng)傷修復(fù)的后期，成纖維細(xì)胞通過分泌膠原酶參與修復(fù)后組織的改建。在某些病理條件下，以成纖維細(xì)胞為主要細(xì)胞成分的肉芽組織或增生組織塊還可以在非骨組織內(nèi)發(fā)生鈣化，引起異位骨化(ectopicossification)。但對于異位骨化的參與細(xì)胞及其機制尚不十分清楚，未分化間充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和毛細(xì)血管周細(xì)胞等可劃歸為誘導(dǎo)性骨祖細(xì)胞的細(xì)胞都有可能參與這一過程［6，8］。

3成纖維細(xì)胞在骨創(chuàng)傷修復(fù)過程中的表現(xiàn)

最簡單和常見的骨創(chuàng)傷即是骨折，其愈合過程須經(jīng)過炎性反應(yīng)、清掃、纖維骨痂和骨性骨痂4個階段［4］。不同階段參與的細(xì)胞主體不同。成纖維細(xì)胞從骨折第3天起就出現(xiàn)于骨折局部血腫中［6］，骨折后5天即在機化血腫及骨折斷端的間隙及其周圍大量存在，是參與纖維骨痂階段的主要細(xì)胞成分［4，5］。在此階段成纖維細(xì)胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成和分泌大量Ⅰ型膠原，使肉芽組織逐步變成疏松的結(jié)締組織，將骨斷端包圍起來，形成接合兩骨折斷端的巨大的纖維骨痂。然而，這種由無數(shù)成纖維細(xì)胞和豐富的肉芽組織為主體構(gòu)成的纖維結(jié)締組織卻不會演變?yōu)樵谄渌M織創(chuàng)傷修復(fù)時常見的瘢痕組織，而是通過鈣鹽結(jié)晶在其內(nèi)部不斷沉積，逐漸演變?yōu)楣切怨丘?，使骨折局部的修?fù)達(dá)到骨性愈合，恢復(fù)骨組織的結(jié)構(gòu)。此時，骨折愈合部只有骨組織而不再存在成纖維細(xì)胞［4，5，9～11］。

4成纖維細(xì)胞的成骨作用

成纖維細(xì)胞在骨折愈合過程中不同于其它組織創(chuàng)傷修復(fù)的表現(xiàn)，以及在某些病理條件下可以參與異位骨化［6，7］，使人們對成纖維細(xì)胞的分化能力、鈣化骨化能力以及在成骨過程中其成骨能力如何發(fā)揮、細(xì)胞演變的最終歸宿如何等等問題產(chǎn)生了濃厚的興趣。對成纖維細(xì)胞成骨能力的研究也正是開始于對骨折愈合過程中成纖維細(xì)胞表現(xiàn)的觀察。

對骨折局部骨形成區(qū)的電鏡觀察顯示，除了成骨細(xì)胞在此發(fā)揮成骨作用外，成纖維細(xì)胞確實也存在著類似的成骨表現(xiàn)［4，5，9～13］。例如，在其線粒體內(nèi)可清晰見到鈣鹽顆粒，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)可見成熟的膠原纖維，分泌到其四周的膠原纖維內(nèi)可見高密度的鈣鹽結(jié)晶沉積。不僅如此，成纖維細(xì)胞還能象成骨細(xì)胞一樣產(chǎn)生基質(zhì)小泡并引起小泡內(nèi)的鈣鹽沉積。鈣化的基質(zhì)小泡形成叢毛球狀的鈣球，鈣球隨后合并、融合為骨組織。以上種種現(xiàn)象表明，成纖維細(xì)胞與成骨細(xì)胞一樣具備提供鈣鹽沉積及骨形成所必需的條件。在從纖維性骨痂到骨性骨痂的演變過程中，成纖維細(xì)胞也隨之演變?yōu)楣羌?xì)胞，與成骨細(xì)胞的歸宿相一致。但二者在演變過程中的表現(xiàn)又不盡相同，主要有以下幾點可資鑒別［9，13］：①成纖維細(xì)胞及其細(xì)胞核均呈不規(guī)則的橢圓形或長方形，而成骨細(xì)胞及其細(xì)胞核則為邊緣比較光整的橢圓形；②成纖維細(xì)胞均單獨存在，細(xì)胞之間有眾多的膠原纖維相隔，成骨細(xì)胞則以連續(xù)排列的形式出現(xiàn)；③成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)溶酶體少見，而成骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)則常有溶酶體可見；④成纖維細(xì)胞四周的骨組織都由叢毛球狀鈣球或針狀鈣鹽結(jié)晶組成，成骨細(xì)胞則都有一面緊貼比較成熟與致密的骨組織；⑤成骨細(xì)胞是一個一個地被骨組織(類骨質(zhì))包圍變?yōu)楣羌?xì)胞，而成纖維細(xì)胞則可以是兩個或兩個以上同時被骨組織包圍在一個陷窩內(nèi)，然后再隨著細(xì)胞之間基質(zhì)的鈣化而分隔為各占一個骨陷窩。

對成纖維細(xì)胞的成骨作用，有學(xué)者認(rèn)為這是成纖維細(xì)胞的固有特性在骨折這一特定情況下得以表達(dá)的結(jié)果［9，11］。骨折局部活的和失活的骨組織及軟骨組織，以及骨基質(zhì)中的某些大分子都有可能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)其成骨作用進(jìn)而演變?yōu)楣羌?xì)胞［14，15］。較早在骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)即對成纖維細(xì)胞有一定的誘導(dǎo)作用。對骨折愈合中BMP作用的研究［16，17］，表明創(chuàng)傷使內(nèi)源性BMP呈階段性合成與釋放，并誘導(dǎo)周圍軟組織中的間充質(zhì)細(xì)胞或/和成纖維細(xì)胞等向成骨方向轉(zhuǎn)化。應(yīng)用PAP法發(fā)現(xiàn)［16］，骨折后第3、5天局部纖維肉芽組織中的成纖維細(xì)胞樣間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)以及第14天新生骨小梁間纖維組織中的成纖維細(xì)胞樣間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，都與成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨基質(zhì)一樣存在BMP，表明這些成纖維細(xì)胞樣間充質(zhì)細(xì)胞已被誘導(dǎo)為可合成分泌BMP、具有成骨作用的細(xì)胞。而Sampath［15］從牛骨基質(zhì)中分離提純得到的成骨素對成纖維細(xì)胞的骨誘導(dǎo)能力更是超過了BMP和當(dāng)時已知的其它骨生長因子。

成纖維細(xì)胞在其成骨作用得以表達(dá)后，可能通過兩種方式成骨：①膜內(nèi)成骨；②在環(huán)繞軟骨的纖維層內(nèi)成骨。開始分泌膠原纖維后，參與成骨的成纖維細(xì)胞只有兩個歸宿［4，5，9，13］：①變性、死亡、碎裂直至消失，這種演變發(fā)生早、范圍廣，故從纖維性骨痂形成開始，就逐漸有基質(zhì)成分發(fā)生鈣化，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)楣腔|(zhì)；②演變?yōu)楣羌?xì)胞，這一過程出現(xiàn)較晚，并穿插在前一過程之中，故在形成骨組織的細(xì)胞成分的同時，還使豐富的纖維骨痂演變?yōu)楣切怨丘?，形成骨組織。但這種由成纖維細(xì)胞演變成的骨細(xì)胞，其結(jié)局如何、其生物學(xué)特性與由成骨細(xì)胞演化而來的骨細(xì)胞是否相同仍不清楚。例如，骨細(xì)胞從骨陷窩脫離后，可恢復(fù)為功能活躍的成骨細(xì)胞，再次參與骨組織的形成；而由成纖維細(xì)胞演變成的骨細(xì)胞在脫離骨陷窩后，是成為成骨細(xì)胞還是恢復(fù)為成纖維細(xì)胞、此時是否還具備成骨作用等一系列問題尚缺乏研究。

5成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性［18］

成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)一開始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究細(xì)胞的老化、各種外來因子對細(xì)胞的損傷、細(xì)胞在體外條件下的惡性轉(zhuǎn)化、以及某些先天性代謝異常、酶缺陷等。由于皮膚成纖維細(xì)胞易于獲取，又易于在體外生長，故目前皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)已在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究中得到較廣泛的運用，其分離培養(yǎng)技術(shù)已相對成熟，對其體外生長規(guī)律也有了較全面的認(rèn)識。

成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)可用酶消化法或組織塊法，其中組織塊法又因其操作簡便、條件易于控制而應(yīng)用更為普遍。通常，以酶消化法獲得的成纖維細(xì)胞懸液在接種后5～10min即可見細(xì)胞以偽足初期附著，與底物形成一些接觸點；然后細(xì)胞逐漸呈放射狀伸展，胞體的中心部分亦隨之變扁平；最快者大約在接種后30min，細(xì)胞貼附底物即較為完全，呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞的形態(tài)。采用組織塊法則大約在接種后2～3天［2，3］到1周左右，在接種的皮膚組織塊周圍長出細(xì)胞。待細(xì)胞融合成片，鋪滿培養(yǎng)容器底壁大部分時即可進(jìn)行傳代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，將成纖維細(xì)胞從底壁消化下來后分瓶作傳代培養(yǎng)。成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下能保持良好的分裂增殖能力。細(xì)胞分裂時變?yōu)榍蛐危环至押笥制戒佋诟街锏谋砻娉蔀橛型黄鸬谋馄郊?xì)胞。體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，其生命期限與物種等因素有關(guān)。例如：人胚成纖維細(xì)胞約可培養(yǎng)50代；恒河猴皮膚成纖維細(xì)胞能傳代超過40代；雞胚成纖維細(xì)胞則只有少數(shù)能培養(yǎng)30代；而小鼠成纖維細(xì)胞多數(shù)只能生長8代左右。另外，從老年個體取得的成纖維細(xì)胞的壽命要比取自年輕者短。由于在細(xì)胞傳代和進(jìn)行體外培養(yǎng)時，細(xì)胞的生物學(xué)特性會逐漸發(fā)生一些不同于體內(nèi)的改變，故通常只將前10代視這正常細(xì)胞，可在此時將生長旺盛的成纖維細(xì)胞凍存起來，以備將來復(fù)蘇使用，這在將培養(yǎng)的細(xì)胞由動物實驗向人體實驗過渡的過程中必須給予足夠的重視。

6成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)中的成骨作用

徐榮輝［2］等通過體外培養(yǎng)家兔皮膚成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，經(jīng)傳代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞至第8天時，其細(xì)胞集落中有不透光的骨小結(jié)節(jié)形成；到37天時，小結(jié)節(jié)擴大、延伸，形成骨小梁樣結(jié)構(gòu)。經(jīng)活體四環(huán)素標(biāo)記顯示，所形成的結(jié)構(gòu)為新生骨組織。他們還注意到，成纖維細(xì)胞在參與骨形成的過程中并無分化為成軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞的明確跡象，故推測并未發(fā)生此種分化，而成纖維細(xì)胞之所以能發(fā)揮成骨作用，很可能是受某些誘導(dǎo)因素作用的緣故。他們認(rèn)為用以培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的中厚皮片中混雜存在的上皮細(xì)胞(或/與內(nèi)皮細(xì)胞)，可能是誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞形成骨組織的一種誘導(dǎo)因素。而Friedenstein［6，19］較早的實驗則認(rèn)為，屬于誘導(dǎo)性骨祖細(xì)胞之一種的成纖維細(xì)胞，在上皮細(xì)胞(如膀胱上皮)或脫鈣骨基質(zhì)等誘導(dǎo)因子作用下，可以分化為成骨細(xì)胞進(jìn)而形成骨組織。鄧廉夫［20］等分離培養(yǎng)取自關(guān)節(jié)內(nèi)的損傷性和晚期骨關(guān)節(jié)炎性的滑膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其中的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞增殖迅速，呈束狀或交叉鋪展并可形成多層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞表面有其分泌物形成的不透光結(jié)節(jié)，經(jīng)四環(huán)素標(biāo)記、ARS(Alizarinreds)和甲苯胺藍(lán)(Toluidineblue)染色，顯示結(jié)節(jié)為新生骨組織。在缺乏常規(guī)的誘導(dǎo)因子——上皮細(xì)胞的作用下，取自滑膜的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞也能發(fā)生成骨作用，他們推測是在關(guān)節(jié)損傷后或骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展過程中，改變的關(guān)節(jié)微環(huán)境(如TNF樣活性物質(zhì)增多等)可能會觸發(fā)滑膜的成纖維細(xì)胞與骨形成相關(guān)的多基因表達(dá)，使其向成骨型細(xì)胞分化，這樣，滑膜成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞在體內(nèi)時即已具備成骨性能，故在培養(yǎng)條件下可發(fā)揮成骨作用。Dodda［21］等的研究則指出，變性滑膜細(xì)胞多種細(xì)胞因子和生長因子的表達(dá)、關(guān)節(jié)液內(nèi)多種細(xì)胞因子的出現(xiàn)，可能是滑膜成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞成骨表型表達(dá)的重要始動因素。這些相關(guān)的研究表明成纖維細(xì)胞成骨表型的表達(dá)可能存在著較復(fù)雜的調(diào)控機制，而其誘導(dǎo)因素也是多樣的。

為獲取大量具有成骨表型的成纖維細(xì)胞并了解其轉(zhuǎn)化機制，鄧廉夫［22］等將分離純化的人皮膚成纖維細(xì)胞置于加有不同濃度EGF、IL-6、TNF-α、BMP-2的培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用生物化學(xué)、組織化學(xué)和電鏡觀察等方法檢測成纖維細(xì)胞成骨性標(biāo)記物的形成狀況，發(fā)現(xiàn)TNF-α和BMP-2聯(lián)合應(yīng)用，可使成纖維細(xì)胞分泌堿性磷酸酶、骨鈣素及膠原纖維的量增加；成纖維細(xì)胞可由梭形向圓形或多突形轉(zhuǎn)化，蛋白分泌旺盛；細(xì)胞外基質(zhì)中，豐富的膠原纖維定向或雜亂排列，其間散在較多的鈣顆粒；細(xì)胞可重疊交織形成多層結(jié)構(gòu)，其表面有分泌顆粒和鈣鹽結(jié)晶堆積，并不斷融合擴大成骨結(jié)節(jié)，表明TNF-α和BMP-2可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞成骨。但這種完全由成纖維細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)而形成的骨組織，在缺乏典型的成骨細(xì)胞參與下是否能在體外或植入體內(nèi)后經(jīng)改建成為成熟的板層骨及其改建過程如何?仍有待進(jìn)一步研究。

篇2

【關(guān)鍵詞】 腫瘤干細(xì)胞

作為神經(jīng)系統(tǒng)常見病，人高級別膠質(zhì)瘤具有極強的侵襲能力，顯微鏡下顯示其惡性細(xì)胞大大超出經(jīng)造影劑強化的影像學(xué)邊界，甚至可以在瘤邊界以外7cm處發(fā)現(xiàn)。這種生物學(xué)特征使先進(jìn)的腦功能顯像技術(shù)難以達(dá)到理想的敏感性和特異性，而以此為支撐手段的微創(chuàng)神經(jīng)外科技術(shù)和三維適形放療技術(shù)也因此失去它們在治療其它疾病的良好療效。新近統(tǒng)計結(jié)果顯示，經(jīng)過綜合治療間變性星形細(xì)胞瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中位生存期分別只有18個月和12個月。為提高療效，人們對其生物學(xué)特征進(jìn)行了深入研究，2003年Sing[1]從腦腫瘤組織中分離到腦腫瘤干細(xì)胞(brain tumor stem cell，BTSC)，這種新的研究視角必將對膠質(zhì)瘤的治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

1 BTSC提出的基礎(chǔ)

BTSC的概念是在神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)研究取得一定成果的基礎(chǔ)上提出來的。長期以來，人們認(rèn)為成年后中樞神經(jīng)系統(tǒng)由成熟的終末分化細(xì)胞構(gòu)成，很難或不能再進(jìn)行分裂和增殖。1992年Reynolds[2]從成年小鼠紋狀體中分離到能夠不斷增殖、具有多向分化潛能的細(xì)胞，并提出了NSC的概念，其后人們又陸續(xù)在哺乳動物及人的不同腦區(qū)體外分離到了NSC，說明成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)確實具有神經(jīng)再生的潛能。

個別腫瘤干細(xì)胞的分離鑒定成功是BTSC提出的另一個前提。白血病的相關(guān)研究最先提供證據(jù)：Bonnet等[3]報道人類急性髓系白血病起源于原始造血細(xì)胞的一個異質(zhì)群體，它們能在糖尿病免疫缺陷鼠（SOD/SCID鼠）中發(fā)生人類白血病，而該細(xì)胞群大部分具有與造血干細(xì)胞相同的表型，即CD34+CD38-，相反CD34+CD38+表型的白血病細(xì)胞絕大多數(shù)不能形成人類白血病。這使人聯(lián)想到白血病具有類似造血干細(xì)胞的特殊群體。最早從實體瘤中分離鑒定出腫瘤干細(xì)胞的報道來自Muhammad研究小組[4]，他們從乳腺癌中分離鑒定出一類表型特異的小比例細(xì)胞群，即ESA+CD44+CD24-/lowLin-。將少至100個此類細(xì)胞注射到NOD/ SCID 小鼠皮下乳房墊上即可生成與人原發(fā)乳腺癌相似的腫瘤。這群成瘤能力極強的細(xì)胞被稱為乳腺癌起始細(xì)胞。該研究還顯示，成瘤細(xì)胞和非成瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布相似，從形態(tài)學(xué)上也無明顯差異，故腫瘤干細(xì)胞表面的分子標(biāo)志對于其鑒別具有更重要的意義。

2 BTSC的鑒定

證實腦腫瘤具有干細(xì)胞的關(guān)鍵問題是找出特異的分子標(biāo)記，并以此篩選出強致瘤能力的細(xì)胞群——腫瘤干細(xì)胞。在這方面，Singh 邁出了關(guān)鍵一步。他們以CD133標(biāo)記分離的腦瘤病人腫瘤細(xì)胞，CD133為跨膜蛋白，定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，其表達(dá)起始于神經(jīng)胚胎形成時，隨著NSC分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞而停止表達(dá)。觀察發(fā)現(xiàn)， CD133陽性組分在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中占19%～29%，在髓母細(xì)胞瘤中占6%～21%，而這一比例與神經(jīng)球形成實驗的結(jié)果具有很好的相關(guān)性。將CD133陽性球體分離成單個細(xì)胞以不同數(shù)目接種于小鼠腦內(nèi)，即形成腫塊并呈浸潤性生長。更為特別的是，少至100個這樣的細(xì)胞即可導(dǎo)致腦瘤形成并連續(xù)傳代。免疫組化顯示，CD133陽性腫瘤細(xì)胞同時表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志nestin和vimentin。該研究顯示，腦腫瘤細(xì)胞中存在與正常腦組織類似的等級現(xiàn)象，具有干細(xì)胞特征的少數(shù)細(xì)胞是膠質(zhì)瘤發(fā)展的基礎(chǔ)，而CD133是這類細(xì)胞的有效鑒別標(biāo)記。

Galli[5]以原發(fā)膠質(zhì)瘤和髓母細(xì)胞瘤術(shù)后標(biāo)本為研究對象，以胎兒NSC作為對照，也發(fā)現(xiàn)在高級別膠質(zhì)瘤及髓母細(xì)胞瘤都產(chǎn)生了與NSC同樣的神經(jīng)球，其形成率在膠質(zhì)瘤為0.5%～31%，在髓母細(xì)胞瘤為50%～80%。分離神經(jīng)球行無血清培養(yǎng)，其中高級別膠質(zhì)瘤經(jīng)長期傳代形成穩(wěn)定細(xì)胞系。值得注意的是此細(xì)胞系中的單個細(xì)胞即能夠形成克隆。將上述細(xì)胞系培養(yǎng)液中的EGF和FGF2去除，加入白血病抑制因子以誘導(dǎo)分化，隨后的免疫組化顯示細(xì)胞帶有神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記?？梢?，在高級別膠質(zhì)瘤及髓母細(xì)胞瘤都存在一定比例的干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞，該類細(xì)胞具有很強的自我更新能力，而在分化培養(yǎng)條件下又顯示出多向分化能力。同年Yuan[6]也報道了針對膠質(zhì)母細(xì)胞進(jìn)行的類似體內(nèi)外實驗，并得出相似的結(jié)果。

一系列實驗結(jié)果表明：大部分腦腫瘤細(xì)胞失去自我更新和增殖能力，構(gòu)成腫瘤的表型特征；小部分腦腫瘤細(xì)胞具備了正常NSC的自我更新、多向分化能力，而經(jīng)系列傳代及原位接種仍保持其生物學(xué)特性。這說明腦腫瘤中確實存干細(xì)胞，而CD133可以作為鑒定BTSC的特異分子標(biāo)記。

3 BTSC的來源

目前多數(shù)腫瘤病因?qū)W理論都假設(shè)細(xì)胞分子遺傳改變是腫瘤發(fā)生的原因。隨著BTSC被分離鑒定和NSC研究逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)BTSC不只是在分離、擴增、分化和鑒定指標(biāo)等方面與NSC類同，而且兩者在發(fā)生學(xué)上可能存在淵源關(guān)系。

室管膜下區(qū)位于側(cè)腦室外側(cè)壁，是一層待分化細(xì)胞，即使到成年，仍持續(xù)保持神經(jīng)元增殖分化的潛能，能夠不斷產(chǎn)生神經(jīng)母細(xì)胞；同時形成吻側(cè)遷移流，遷移到嗅球，替代其中不斷更新的中間神經(jīng)元。有人提出富集于該區(qū)的Nestin陽性細(xì)胞即NSC，而早在上世紀(jì)三四十年代，就有學(xué)者提出腦膠質(zhì)瘤源于室管膜下區(qū)的膠質(zhì)細(xì)胞，這使人想到腦腫瘤發(fā)生于正常的NSC。據(jù)此，Recht等[7]利用ENU(N-乙基-N-亞硝基脲)致瘤模型，并選擇Nestin為標(biāo)記物進(jìn)行膠質(zhì)瘤起源細(xì)胞的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幼鼠出生后最早30d即可在室管膜下區(qū)附近的腦實質(zhì)中出現(xiàn)單個或成團的Nestin陽性細(xì)胞；隨著時間的延長，Nestin陽性細(xì)胞團逐漸增大，最終形成實體瘤，而對照組相同部位未發(fā)現(xiàn)Nestin陽性細(xì)胞及腫瘤發(fā)生。

其實，在更早的時間就有人證實NSC具有潛在的致瘤性。Holland等[8]將致癌基因Ras和Akt聯(lián)合轉(zhuǎn)入小鼠星形細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞，結(jié)果在后者成功誘發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤。這說明，分化終末期的星形細(xì)胞致瘤性減小，而畸變的NSC更易于發(fā)生惡變。有學(xué)者向小鼠腦內(nèi)注入攜帶shh和c-Myc的逆轉(zhuǎn)錄病毒，結(jié)果在其表達(dá)的NSC上也成功誘發(fā)髓母細(xì)胞瘤[9]。

腦腫瘤源于正常的NSC另外的理論基礎(chǔ)是兩者具有共同的分化增殖調(diào)控通路，前者的發(fā)生常常與后者信號通路蛋白的異常表達(dá)有關(guān)。Shh(Sonic hedgehog)通路、PTEN(phosphotase and tensin homologue deleted on chromosome ten)基因、Wnt的下游基因β-catenin、多聚體轉(zhuǎn)錄因子Bmi-1等在保持NSC的自我更新能力中起重要作用。研究表明Shh信號的異常活化依次通過抑癌基因Rb失活和原癌基因n-myc激活促進(jìn)易感神經(jīng)祖細(xì)胞發(fā)展成髓母細(xì)胞瘤[10]；在髓母細(xì)胞瘤和其它腦腫瘤中β-catenin發(fā)生突變[11]，而Bmi-1表達(dá)增加[12]。PTEN編碼一個調(diào)節(jié)NSC增殖的磷酸酶，在惡性膠質(zhì)瘤中是最普遍的基因突變[13]。上述共同通路僅能說明正常干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞有著不可分割的淵源關(guān)系，但不足以說明正常干細(xì)胞就是腫瘤干細(xì)胞的起源細(xì)胞，要確認(rèn)腫瘤干細(xì)胞的來源還需要更多的直接證據(jù)。

近年來，由干細(xì)胞和出現(xiàn)一組腫瘤相關(guān)基因突變的細(xì)胞發(fā)生融合而成為腫瘤起源細(xì)胞的學(xué)說正在形成。該理論認(rèn)為，在人的成神經(jīng)管瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腫瘤干細(xì)胞中觀察到染色體的紊亂可能是由細(xì)胞融合引起的[14]。它解釋了腫瘤發(fā)生早期——并不一定要后期才出現(xiàn)的染色體紊亂現(xiàn)象，而成熟細(xì)胞也可通過細(xì)胞融合得到去分化機會并重新獲得自我更新能力?？偟膩碚f，細(xì)胞融合后的去分化或轉(zhuǎn)分化在腫瘤發(fā)生的起動、形成和進(jìn)展期均可發(fā)生，但目前仍不清楚干細(xì)胞融合理論在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起到多大的作用。

4 BTSC與NSC的差異

在目前階段，正常干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的相似性研究占主要地位，但腫瘤學(xué)家們最終的任務(wù)是確認(rèn)兩者的差異。Singh[1]和Galli[5]都注意到，在所有多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分化培養(yǎng)基中一細(xì)胞同時具有神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志，而這一現(xiàn)象從未在正常胎兒NSC中出現(xiàn)。令人感興趣的是，這種雙標(biāo)記細(xì)胞在各種膠質(zhì)瘤細(xì)胞中比例不同，其數(shù)量與增殖力指數(shù)具有相關(guān)性。Yuan[6]也發(fā)現(xiàn)，充分誘導(dǎo)分化從神經(jīng)球分離的BTSC，然后轉(zhuǎn)到NSC增殖條件下繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果這些單個細(xì)胞又能重新生成神經(jīng)小球，而正常NSC則失去這樣的能力。

Singh針對上述現(xiàn)象的解釋是，腫瘤干細(xì)胞錯誤的分化程序被激活。Galli 對BTSC核型進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在各種細(xì)胞中普遍存在染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變，同時非整倍體頻繁發(fā)生。而在正常NSC卻不存在這種變化。特別的是，上述細(xì)胞的染色體畸變在長期培養(yǎng)條件下仍然保持不變。與正常細(xì)胞不同，在幾乎所有的腫瘤中都發(fā)現(xiàn)非整倍體和染色體數(shù)目改變，近期的研究顯示染色體過客蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)紊亂是其發(fā)生原因之一[15]。細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)而形成永生表型往往與端粒維持機制有關(guān)[16]，Galli的研究也顯示出BTSC的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶高度表達(dá)?？傊?，BTSC經(jīng)誘導(dǎo)分化后的逆分化機制尚不明確，其可能原因是染色體不穩(wěn)定及相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)失調(diào)。

5 對膠質(zhì)瘤治療的啟示

腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為腫瘤為非均質(zhì)群體，其中占少數(shù)的干細(xì)胞是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源。為此，人們對這部分細(xì)胞與臨床治療相關(guān)的生物學(xué)特性進(jìn)行了深入研究。Liu有關(guān)膠質(zhì)瘤病例耐藥的報告顯示，在含有替莫唑胺、卡鉑、Vp-16和泰素的培養(yǎng)液中CD133陽性細(xì)胞較陰性細(xì)胞具有更高的活性。耐藥基因表達(dá)分析顯示，CD133陽性細(xì)胞與陰性細(xì)胞相比，耐藥基因（BCRP1和MGMT）和抗凋亡基因（FLIP、Bcl-2和 Bcl-XL）均有顯著性升高[17]。研究證實了BTSC對細(xì)胞毒藥物具有更高的耐藥性，也為腦腫瘤較差的化療療效提供理論依據(jù)，同時強調(diào)逆轉(zhuǎn)干細(xì)胞耐藥對提供腦瘤化療療效具有重要作用。

細(xì)胞對DNA損傷做出應(yīng)答的一個重要過程是檢查點活化，當(dāng)細(xì)胞受到照射時檢查點激酶CHK1和CHK2使關(guān)鍵蛋白磷酸化，從而阻止正常的細(xì)胞周期進(jìn)行。受到有關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞放射敏感性研究的啟示[18]，Bao[19]以膠質(zhì)瘤病人標(biāo)本和人膠質(zhì)瘤異種移植物為對象，檢測腫瘤干細(xì)胞放射敏感性。結(jié)果顯示，CD133陽性細(xì)胞較陰性細(xì)胞放射敏感性顯著降低，原因是前者更早活化DNA損傷檢測點，并且高效修復(fù)射線所致?lián)p傷。實驗進(jìn)一步采用CHK1和CHK2特異抑制劑，結(jié)果明顯提高腫瘤干細(xì)胞的放射敏感性。該研究從腫瘤干細(xì)胞角度分析膠質(zhì)瘤輻射耐受的產(chǎn)生機理，為腦瘤放療生物靶區(qū)理論提供了有力證據(jù)。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins， BMPs)廣泛分布于人體多種細(xì)胞和組織，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、凋亡、遷移和分化，進(jìn)而參與全身多種器官的發(fā)育和形成過程[20~23]。其基因表達(dá)異常和突變將導(dǎo)致胚胎死亡、組織器官發(fā)育異常。來自約翰·霍普金斯和米蘭大學(xué)的科學(xué)家用骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 (BMP4)預(yù)處理人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞，把這些處理細(xì)胞注射到小鼠腦內(nèi)，結(jié)果未見腫瘤生長，而對照組可見大片浸潤性癌腫生長。隨后他們將含有緩慢釋放BMP4的粒子直接送達(dá)植入惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的小鼠腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比小鼠生存時間顯著延長[24]。證實上述抗瘤作用源于 BMP4與腫瘤干細(xì)胞上的受體結(jié)合后激發(fā)Smad 信號通路，進(jìn)而阻止后者的分裂能力。利用BTSC與干細(xì)胞的相似性，抑制其分裂增生能力，進(jìn)而控制腫瘤，上述研究對腦瘤治療具有很好的啟示作用。類似的研究也見于Aguado的最新報道[25]：已知大麻可通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管形成產(chǎn)生抗膠質(zhì)瘤作用，Aguado以多形性膠質(zhì)瘤活檢組織分離得到的細(xì)胞和具有大麻受體的U87MG、U373MG細(xì)胞為對象研究大麻的抗腫瘤干細(xì)胞作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大麻在體內(nèi)阻止干細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化，在體外減少神經(jīng)球形成。研究顯示，大麻受體激活后可改變BTSC增殖分化的基因表達(dá)，通過加速分化抑制膠質(zhì)瘤形成。

BTSC理論的提出有著重要意義，使臨床腦腫瘤治療更加具有針對性的同時，也為廣為關(guān)注腫瘤發(fā)生問題提供依據(jù)。另外，BTSC與NSC屬性上的相似，暗示著BTSC與NSC可能存在著某種必然的聯(lián)系，對BTSC的研究也必將推動對NSC的研究。

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篇3

福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2010年6月 第44卷第3期王樹崗等：肺癌干細(xì)胞研究進(jìn)展肺癌是當(dāng)前危害人類生命和健康最嚴(yán)重的惡性腫瘤。據(jù)報道，經(jīng)手術(shù)、放化療等治療后5年存活率不足15%[1]。隨著環(huán)境污染的日益加重，1950年代后發(fā)病率迅速上升，目前在男性惡性腫瘤中占第一位，女性的發(fā)病率也在不斷增長，占惡性腫瘤的第二位[2]。腫瘤干細(xì)胞（tumor stem cell， TSC）是當(dāng)前研究的熱點，人們希望從肺癌干細(xì)胞的角度找到根治肺癌的途徑，近年來對肺癌干細(xì)胞的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，筆者就肺癌干細(xì)胞的分離、鑒定方法等最新研究進(jìn)展綜述如下。

1 腫瘤干細(xì)胞

腫瘤發(fā)病率居高不下，但目前腫瘤治療效果卻遠(yuǎn)不能令人滿意，造成這一結(jié)果的主要原因在于腫瘤的發(fā)病機理至今仍不明確。人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞在自我更新、信號傳導(dǎo)、耐化療藥物等方面有許多相似之處，人們就二者之間的相似性提出了TSC學(xué)說，認(rèn)為主導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)鍵細(xì)胞是TSC[3]。

TSC的最早報道見于白血病。Dick等發(fā)現(xiàn)大多數(shù)急性粒細(xì)胞性白血病中只有CD34+、CD38-細(xì)胞能在NOD/SCID小鼠骨髓中形成白血病細(xì)胞克隆，而CD34+、CD38+和CD34-細(xì)胞則未能形成克隆[4]。由于血液細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞，故與其他實體組織相比具有一定的特殊性。近年來，隨著干細(xì)胞表面抗原的研究發(fā)展，實體TSC的研究也取得了較大發(fā)展。

AiHajj等研究后發(fā)現(xiàn)，所有接種ESA+、CD44+、CD24-、Lin-乳腺癌細(xì)胞的小鼠在12周內(nèi)均出現(xiàn)明顯的腫瘤，而接種CD44-或CD24+細(xì)胞的小鼠則少有腫瘤生長。ESA+、CD44+、CD24-、Lin-細(xì)胞遂被稱為乳腺癌干細(xì)胞，首次證明了在實體瘤中同樣有TSC的存在[5]。Singh等報道，在腦腫瘤中分離出了TSC，但與乳腺癌干細(xì)胞不同的是，腦TSC的分離是以CD133為干細(xì)胞膜蛋白標(biāo)記的[6]。2006年，O'brien等在研究結(jié)腸癌時將CD133+細(xì)胞接種于NOD/SCID鼠腎被囊中，以鑒定結(jié)腸癌起始細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)CD133+結(jié)腸癌細(xì)胞可以起始腫瘤，因此認(rèn)為CD133+細(xì)胞就是結(jié)腸TSC[7]。迄今為止，已成功分離并鑒定的實體TSC還包括前列腺癌、黑色素瘤及胰腺癌等[810]，肺癌TSC的研究也取得了巨大進(jìn)展。其他腫瘤，如胃癌中是否存在TSC目前尚不清楚[11]。

2 肺癌干細(xì)胞

2.1 研究進(jìn)展

2005年，Kim等從小鼠支氣管肺泡導(dǎo)管連接處分離出一群Sca+CD45-Pecam-CD34+細(xì)胞，命名為支氣管肺泡干細(xì)胞(bronchioalveolar stem cells， BASCS)。研究發(fā)現(xiàn)，BASCS在支氣管、肺泡損傷和上皮細(xì)胞體內(nèi)修復(fù)更新時發(fā)揮作用，當(dāng)體內(nèi)支氣管和肺泡損傷時發(fā)生增殖；BASCS能夠分化為終末細(xì)支氣管上皮細(xì)胞 (Clara細(xì)胞)、I型肺泡上皮細(xì)胞(AT I細(xì)胞)和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(ATⅡ細(xì)胞)，表明其具有自我更新和多向分化潛能，故認(rèn)為鼠肺末梢支氣管癌的發(fā)生和BASCS有關(guān)[12]。這個結(jié)果為人肺TSC的研究提供了一個重要線索。

2006年，黃盛東等將A549單細(xì)胞懸液接種到96孔板，觀察其克隆形成率、克隆形態(tài)及傳代情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞可形成3種類型的克隆集落，其中Holoelone型占總克隆數(shù)的4%，克隆體積大，可連續(xù)傳代20次以上，并可分化為其他2種類型的集落，增殖活性不隨時間延長而降低，并表達(dá)Sca1+等干細(xì)胞標(biāo)記[13]。2007年，Summer等利用干細(xì)胞排斥Hoechst染料的特性，并結(jié)合CD45、CD31成功從鼠的肺組織中分離出肺內(nèi)源的間充質(zhì)干細(xì)胞[14]。同年，Ho等對6種人肺癌細(xì)胞株的側(cè)群（side population，SP）細(xì)胞進(jìn)行了一系列實驗研究，發(fā)現(xiàn)肺癌SP細(xì)胞較非SP細(xì)胞具有更強的致瘤性，同時人端粒末端轉(zhuǎn)移酶表達(dá)增高，說明這部分SP細(xì)胞具有TSC特性。同時發(fā)現(xiàn)肺癌SP細(xì)胞表達(dá)乳腺癌耐藥蛋白（ABCG2)等多種ATPbinding cassette（ABC）家族膜轉(zhuǎn)運蛋白是其對化療藥物不敏感的主要原因[15]。2008年，國外學(xué)者從A549中分離出有干細(xì)胞特性的SP細(xì)胞，這些SP細(xì)胞在總細(xì)胞群里約占24%。在增殖實驗中，發(fā)現(xiàn)SP和非SP細(xì)胞均可形成含SP和非SP細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群落，但SP較非SP細(xì)胞增殖的速度明顯提高，而且SP較非SP細(xì)胞更高表達(dá)ABCG2，有更強的抗凋亡能力，從而認(rèn)為A549中的SP細(xì)胞具有干細(xì)胞特性[16]。同年，Eramo等報道了肺癌干細(xì)胞屬于CD133+細(xì)胞亞群，他們發(fā)現(xiàn)在肺癌中存在小部分表達(dá)CD133的未分化細(xì)胞，這些CD133+細(xì)胞可在無血清培養(yǎng)基中以球體的形式生長，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)注射104個細(xì)胞即可很容易的使之產(chǎn)生與原細(xì)胞相同性質(zhì)的腫瘤，認(rèn)為CD133+細(xì)胞擁有TSC特性[17]。

董強剛等采用流式細(xì)胞及RTPCR技術(shù)檢測肺癌細(xì)胞株中干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志表達(dá)，并通過裸鼠移植評估其致瘤性，結(jié)果在A549和SPCA肺腺癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)一個新穎的癌細(xì)胞亞群，其表型特征為CD24+IGF-1R+，具有高侵襲性和高致瘤性并具有自主生長特性，能夠在無血清條件下長期培養(yǎng)，認(rèn)為其是肺腺癌干細(xì)胞[18]。2009年，Tirino等對89例非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者的活體腫瘤組織進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)89例中有72%表達(dá)CD133，其平均表達(dá)值為6%，CD133+肺癌細(xì)胞在其后的實驗中表現(xiàn)了更強的致瘤能力[19]。同年，文加斌等對NCIH446人小細(xì)胞肺癌（SCLC）細(xì)胞株的干細(xì)胞特性進(jìn)行研究，結(jié)果15個單細(xì)胞克隆生長形成克隆，形態(tài)上大致分為2種克隆，實驗說明人SCLC細(xì)胞株存在異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞克隆，可能來源于TSC的分化[20]。

國外的研究對象較為籠統(tǒng)，如Tirino對NSCLC進(jìn)行了干細(xì)胞方面的研究，Eramo的研究對象包括所有肺癌，但均未針對肺腺癌、鱗癌等具體組織學(xué)分型進(jìn)行細(xì)分研究[17，19]。鑒于不同肺癌類型生物學(xué)特性的巨大區(qū)別，未來還需在不同肺癌組織學(xué)分型上進(jìn)行深入研究。國內(nèi)對肺癌干細(xì)胞的研究雖有很大進(jìn)展，但同樣有其不足之處。國內(nèi)研究僅停留在體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞株水平，未對活體的新鮮肺癌細(xì)胞進(jìn)行深入研究，而肺癌細(xì)胞在體內(nèi)、體外環(huán)境中的生物學(xué)特性肯定是有區(qū)別的，要使肺癌干細(xì)胞理論有效指導(dǎo)臨床工作，就必須在體內(nèi)培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞領(lǐng)域進(jìn)行突破。

2.2 肺癌干細(xì)胞的分選方法

肺癌干細(xì)胞的分選主要采用兩種方法，一種是應(yīng)用細(xì)胞表面特異性標(biāo)記進(jìn)行分選，另一種是根據(jù)SP表型進(jìn)行TSC的分選。

應(yīng)用細(xì)胞表面特異性標(biāo)記分選使用的主要儀器有兩種，即熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS)和磁性激活細(xì)胞分選(magnetic activated cell sorting，MACS)。FACS是利用干細(xì)胞表面一些膜蛋白，主要是一些CD抗原表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的特點，用流式細(xì)胞儀分選干細(xì)胞，如董強剛等即是采用FACS對A549和SPCA肺腺癌細(xì)胞株進(jìn)行了TSC的研究[18]。MACS則是利用未標(biāo)記的CD抗原等蛋白的單克隆抗體作為第一抗體與單細(xì)胞懸液結(jié)合，再用免疫磁珠標(biāo)記的第二抗體與之結(jié)合，利用這種特異性一抗、二抗標(biāo)記的細(xì)胞懸液流過特制的磁場，經(jīng)柱內(nèi)洗脫收集干細(xì)胞。人們發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞具有將熒光染料泵出細(xì)胞外的特性，即SP特性[21]。目前利用這一特性進(jìn)行純化已成為一種常用的分離方法。如Ho等對6種人肺癌細(xì)胞株中提取的SP細(xì)胞研究后發(fā)現(xiàn)其具有TSC特性[15]。SP細(xì)胞表面表達(dá)ABCG2等ABC家族膜轉(zhuǎn)運蛋白，因此，同樣可以應(yīng)用ABCG2作為標(biāo)記分選TSC。

2.3 肺癌干細(xì)胞的鑒別方法

TSC的定義是腫瘤組織中存在的極少量具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的腫瘤細(xì)胞。目前研究認(rèn)為TSC是一個功能學(xué)概念，所以其功能測定有重要意義，單純利用TSC共有標(biāo)記物得到的細(xì)胞還不能被認(rèn)為是TSC，必須通過一些經(jīng)典的干細(xì)胞實驗進(jìn)行檢驗。自我更新是干細(xì)胞的三大重要特性之一，是指干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂時，其所產(chǎn)生的后代中至少有一個保持與親代細(xì)胞完全相同的性狀，而另一個可以定向分化增殖，即不對稱性分裂方式。某些細(xì)胞如CD133+肺癌細(xì)胞能夠在含多種生長因子的無血清培養(yǎng)基內(nèi)以細(xì)胞球的方式懸浮生長，這是鑒定其是否具有自我更新能力的重要步驟，也是鑒定其是否為TSC的重要方法[17]。

致瘤能力是鑒定TSC的最重要環(huán)節(jié)，目前一般通過裸鼠致瘤實驗進(jìn)行檢驗，通常做法是將分選的細(xì)胞接種于免疫缺陷動物體內(nèi)，觀察其在一定時間內(nèi)形成移植瘤的情況（如成瘤時間、腫瘤大小等）[22]。目前已經(jīng)鑒定的TSC均進(jìn)行了此實驗，比如Eramo和Tirino對肺癌干細(xì)胞的研究[17，19]。分化潛能也是TSC的重要特征之一。從細(xì)胞分化角度來看，從干細(xì)胞到成熟細(xì)胞要經(jīng)過全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、定向祖細(xì)胞、組織特異性干細(xì)胞直至終末分化細(xì)胞。TSC分化的最終結(jié)果也至少會有一種分化細(xì)胞，實驗中可通過單克隆實驗進(jìn)行檢驗，以此鑒定其干細(xì)胞特性。如黃盛東等對A549細(xì)胞株中Holoelone群落的研究[13]。

3 肺癌干細(xì)胞研究的臨床意義及展望

腫瘤困擾人類的健康已有上千年的歷史，其原因可能是現(xiàn)有的治療主要針對腫瘤組織內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞，并沒有將那些數(shù)量很少但對腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)起決定作用的TSC殺死，即使腫瘤組織消失了，但經(jīng)過一段時間后仍可以重新形成腫瘤。TSC學(xué)說是當(dāng)前腫瘤研究的前沿，它為腫瘤研究開辟了一個新的視野，這將徹底的顛覆腫瘤的既往治療策略。在未來的腫瘤治療中，應(yīng)該強調(diào)針對TSC的治療，力求將TSC全部清除。

目前肺癌的主要治療方法即手術(shù)加放化療，但肺癌干細(xì)胞比普通肺癌細(xì)胞更能耐受放化療，它的殘留是腫瘤復(fù)發(fā)的根源，尋找更為有效的治療方法已經(jīng)是目前的迫切要求。隨著干細(xì)胞研究技術(shù)和應(yīng)用水平的不斷進(jìn)步，提取和純化TSC建立細(xì)胞庫已經(jīng)成為可能，肺癌干細(xì)胞的研究不但有助于了解肺癌的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，同時可能對肺癌的臨床診斷及治療帶來重大突破。

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篇4

關(guān)鍵詞：臺燈 模型 可變 細(xì)胞

中圖分類號：J6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2013）01（c）-0097-01

在現(xiàn)在快節(jié)奏生活中，一般臺燈單一的方向照明已經(jīng)無法滿足人們快速轉(zhuǎn)變的工作環(huán)境需求，尤其是在工作中，人們根本無法使用一般臺燈照亮整個房間，而為了照亮整個房間，人們也往往需要花費更多的能源及時間。而此設(shè)計可以輕松解決此問題，實現(xiàn)由單一方向照明與多方向照明之間的轉(zhuǎn)換，從而避免了人們因上述原因而造成的一些麻煩和能源、時間的損失。

1 功能簡介

“細(xì)胞臺燈”通過一個滑塊與一根滑軸進(jìn)行變化，這特有的機械結(jié)構(gòu)能讓人們輕松的實現(xiàn)其功能；從而達(dá)到“人們工作時呈現(xiàn)單一方向照明”及“人們需要時呈現(xiàn)多方向照明”的功能。即解決了一系列現(xiàn)實生活中的實際問題。

2 “細(xì)胞臺燈”的主要結(jié)構(gòu)及視圖

如圖1～4。

3 “細(xì)胞臺燈”的物理原理

可變系統(tǒng)原理。

利用轉(zhuǎn)軸組、滑塊、滑軸組合成一個可升降裝置，模擬了細(xì)胞收縮時的空間變化。需將轉(zhuǎn)軸組固定于直線滑軸導(dǎo)軌的滑塊上，光源則是安裝在各個葉片上，作用時人為給力滑塊上下運動，隨之改變光的照射角度，從而達(dá)可變效果。

4 “細(xì)胞臺燈”的制作方法

（1）取一根一般臺燈高度的滑軸，將其固定于底座上，滑塊置于滑軸上。

（2）制作上下燈片，將上下兩片用轉(zhuǎn)軸組連接，一端置于滑軸頂部，一端置于滑塊。

（3）連接電路。

5 “細(xì)胞臺燈”的使用說明

（1）安裝好后，連接電源，打開開關(guān)即可使用。

（2）需獲得單一向下方向照明時，可推動滑塊向上，直至最頂端。

（3）需獲得多方向照明時，可推動滑塊向下，直至最底端。

（4）平日以普通燈具對待之。

6 相關(guān)拓展

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，人民生活水平的不斷提高，人們對生活品質(zhì)提出了更高的實用及外觀要求。

在造型設(shè)計方面，此產(chǎn)品簡介大方。當(dāng)臺燈處于閉合狀態(tài)時，形態(tài)接近普通臺燈，人們能直觀的了解其功能。當(dāng)臺燈處于展開狀態(tài)時，臺燈形成一個內(nèi)腔，不由讓人聯(lián)想起中國傳統(tǒng)文化中的燈籠，作為擁有同樣文化底蘊的我們，這將帶來一絲親切的感觸，而這種感觸又不失時代感。

在使用配置方面，細(xì)胞臺燈是利用一般的電源供電。使用者通過簡單的物理原理，解決人們?nèi)粘Ｉ钪械男栴}，即單一方向照明與多方向照明之間的迅速轉(zhuǎn)變。其結(jié)構(gòu)直接暗示功能使用，且不帶有復(fù)雜的操作，是一件一切從實用主義出發(fā)的產(chǎn)品。

在生產(chǎn)成本方面，由于結(jié)構(gòu)的特殊性，導(dǎo)致其比一般臺燈成本略有增加，所以產(chǎn)品前期定位面向中高端消費人群。當(dāng)然隨著產(chǎn)品種類的豐富以及產(chǎn)量的增加，成本下降的同時將具有更大的市場競爭力，并逐步在發(fā)展中被普通民眾接受。

篇5

本文就近幾年國內(nèi)外白細(xì)胞介素與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的研究進(jìn)展作一綜述。

1 細(xì)胞移植干細(xì)胞的選擇

干細(xì)胞最大的特性是可塑性大，對組織再生的肝細(xì)胞基本要求是：具有多樣性，容易獲得，有增殖能力，體外轉(zhuǎn)化率高，可選擇細(xì)胞移植治療肝衰竭的干細(xì)胞有造血干細(xì)胞，成人肝臟干細(xì)胞和祖細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其他類型的細(xì)胞。

1.1造血干細(xì)胞 造血干細(xì)胞是從骨髓、臍帶血、外周血中分離出來的標(biāo)準(zhǔn)的多能干細(xì)胞，具有自我更新及分化增殖的能力，但他們在體外很難增殖，并且確定此類細(xì)胞的身份和表型主要靠選擇過程，但選擇的標(biāo)準(zhǔn)是有爭議的。

1.2成熟肝臟干細(xì)胞和祖細(xì)胞 成熟肝臟干細(xì)胞大約有四種主要類型：卵圓細(xì)胞、小肝細(xì)胞、肝上皮細(xì)胞和間質(zhì)樣細(xì)胞。在肝臟損傷時卵圓細(xì)胞來源于排膽汁的細(xì)胞，有兩種分化潛能，即分化成肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，在體外能增殖，但是否起源骨髓還不清楚，同種類型在健康的肝臟能分離到。小肝細(xì)胞最先是Mitaka T在肝細(xì)胞離心方式獲得的，這種細(xì)胞小，體外有增殖能力，能分化成成熟的肝細(xì)胞，肝上皮細(xì)胞是Tsao MS最先報道的，在成人的肝臟中含量高[3]，間質(zhì)樣細(xì)胞團也來自成人肝臟，這種細(xì)胞團能高水平的增殖，巨大的分化潛能。肝臟內(nèi)的主要細(xì)胞形式為成熟的肝細(xì)胞。肝細(xì)胞是單能干細(xì)胞，對有害刺激的反應(yīng)迅速[4]。成熟肝臟干細(xì)胞雖然能分化成肝細(xì)胞，但其轉(zhuǎn)化具有諸多不足，如獲取肝細(xì)胞難度較大、異基因肝細(xì)胞可能產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)、體外培養(yǎng)易失去活性與功能等，因而不能成為滿意的治療細(xì)胞。

肝祖細(xì)胞在肝臟持續(xù)和嚴(yán)重的損傷后僅僅是邊緣的擴張，無法補充成熟肝細(xì)胞的損傷。因此也難成為首選的治療細(xì)胞。

1.3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是從骨髓中分離出來的[5]，也可以從其他組織中分離，如脂肪組織，胚胎，羊水，和臍帶血液[6，7]。在體內(nèi)，他們的功能和習(xí)性還不十分清楚[8]。在體外，間充質(zhì)干細(xì)胞有高度增殖的特性，容易轉(zhuǎn)染，且在體外展現(xiàn)巨大的分化潛能[9]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于中胚層的成體干細(xì)胞，可以重復(fù)利用，釋放多種祖細(xì)胞，然后分化為各種功能性的細(xì)胞，如肝細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，骨細(xì)胞及內(nèi)胚層來源的細(xì)胞等[10]。由于它以下的優(yōu)勢，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞被認(rèn)為是目前細(xì)胞治療中的首選，第一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以辨別各種來源于中胚層的組織細(xì)胞，當(dāng)組織細(xì)胞受到損傷時骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以自我復(fù)制用以補充細(xì)胞修復(fù)組織。第二、最新研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用來治療時，可分泌可溶性的細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)機體的免疫環(huán)境。第三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可調(diào)節(jié)機體內(nèi)的微環(huán)境用以緩解炎癥因子及腫瘤因子對機體的損傷。盡管其機制還沒有完全的研究透徹，但是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已被用于多種疾病的治療如肝衰竭，移植物抗宿主疾病，骨髓移植后，心血管疾病，自身免疫性疾病等[11]。近期研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化及自我增殖的能力，具有分化成肝細(xì)胞的潛能，在肝臟損傷修復(fù)過程中，能參與修復(fù)損傷的肝組織，在肝臟疾病的治療中有廣闊的治療前景。而且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的有效調(diào)節(jié)劑，與多種免疫細(xì)胞間有相互作用關(guān)系并可抑制白細(xì)胞或使之激活成特異性的抗炎因子[12]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能通過旁分泌途徑分泌細(xì)胞因子和生長因子，從而抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、肝星狀細(xì)胞的激活及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，改善肝纖維化及促進(jìn)肝細(xì)胞的再生，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不僅能增強肝臟再生的能力，而且還能抑制肝細(xì)胞的凋亡，修復(fù)受損肝細(xì)胞功能。其中最有利的是他們的免疫特性，即無明顯免疫源性，易形成免疫耐受，這就有利于細(xì)胞移植[13]。在動物實驗中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過門靜脈注入，肝動脈注入，周圍靜脈注射、腹腔內(nèi)注射或直接注入肝臟或脾臟等發(fā)現(xiàn)，其在不同的誘導(dǎo)條件下可分化為肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞等[14，15]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在肝細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基下分化成成熟肝細(xì)胞，分化率在30%～80%。從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)獲得的肝細(xì)胞樣細(xì)胞能表現(xiàn)出肝細(xì)胞的功能，如產(chǎn)生白蛋白，儲存糖元，分化尿素，吸收低濃度的脂蛋白等[16]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是通過抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)損傷的肝細(xì)胞達(dá)到修復(fù)作用[17]。它具有免疫抑制及抗炎作用，在慢性肝損傷中是另一種改善機制，可能涉及抗炎細(xì)胞因子的分泌（例如IL-10，IL-1Ra，）或者生長因子的分泌（例如肝細(xì)胞生長因子，血管內(nèi)皮生長因子或胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白）[17]。從骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分離，培養(yǎng)到形成肝細(xì)胞樣細(xì)胞受到很多因素的影響，特別是受到許多細(xì)胞因子的影響，主要影響的是各個階段獲得的細(xì)胞數(shù)量，而細(xì)胞的數(shù)量對細(xì)胞移植治療肝衰竭尤為重要。一般來說，移植數(shù)目越多，治療肝衰竭就越易成功，相反治療效果就越差。

1.4其他類型的細(xì)胞 最后是其它類型細(xì)胞，如胎兒干細(xì)胞是體細(xì)胞分化的模板，但他的倫理的局限性和可能發(fā)生腫瘤而限定臨床應(yīng)用。單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞是否分化成肝細(xì)胞仍在研究中[18]。

2 白細(xì)胞介素與肝細(xì)胞再生

白細(xì)胞介素是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子，由于最初是由白細(xì)胞產(chǎn)生又在白細(xì)胞間發(fā)揮作用而得名。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了29種白細(xì)胞介素，分別命名為白細(xì)胞介素1到白細(xì)胞介素29，功能復(fù)雜，形成一個網(wǎng)絡(luò)，相互重疊，是非常重要的細(xì)胞因子家族，在免疫細(xì)胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過程中均發(fā)揮了重要作用，此外它們還參與多種生理及病理反應(yīng)。Conget等報道骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面有白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素3及白細(xì)胞介素6及堿性成纖維細(xì)胞生長因子等多種細(xì)胞因子受體。目前研究與肝細(xì)胞有關(guān)的白介素有白介素6、白介素10。

恢復(fù)肝臟體積主要在于肝細(xì)胞的再生，研究表明肝細(xì)胞的再生受IL-6/Jak/STAT3通路的影響，在非病理及靜態(tài)下肝細(xì)胞并不進(jìn)行細(xì)胞的有絲分裂，在各種條件的刺激下，肝細(xì)胞能在IL-6或者TNF-α的作用下進(jìn)行有絲分裂。IL-6/STAT3信號通路是由IL-6受體，Jak激酶，gp130和STAT3共同組成的，IL-6受體形成2個復(fù)雜的gp130受體，當(dāng)其被IL-6識別后，馬上將信號傳遞給肝細(xì)胞，Jak激酶主要的責(zé)任是激活gp130受體和STAT3。IL-6通過激活STAT3發(fā)送有絲分裂信號給肝細(xì)胞，并在肝細(xì)胞的再生中扮演者重要的角色。STAT3激活是肝細(xì)胞再生的促動反應(yīng)，通過觀察IL-6缺失型小鼠肝部分切除后30min～3h STAT3的激活過程，STAT3活化是受抑制的，因此肝細(xì)胞再生與IL-6是通過激活STAT3是密切關(guān)聯(lián)的。TNF-α主要表達(dá)在庫普弗細(xì)胞中，主要激活NF-kB，增加IL-6的產(chǎn)生，與IL-6受體結(jié)合，激活激活STAT3發(fā)送有絲分裂信號給肝細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生。

研究表明，巨噬細(xì)胞激活和多種細(xì)胞因子的分泌在急性肝衰竭的發(fā)病機理中起著重要的作用，內(nèi)毒素，巨噬細(xì)胞的激活和促炎細(xì)胞因子都可能誘發(fā)CD163的表達(dá)[19]。而IL-10能上調(diào)CD163在單核細(xì)胞中的表達(dá)，從而減少肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)。CD163和白介素IL-10在抗炎反應(yīng)扮演了一個重要的角色。有研究表明，IL-10和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）可能誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞，這可能進(jìn)一步上調(diào)CD163 mRNA和蛋白表達(dá)[20]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過調(diào)控抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10及分泌白細(xì)胞介素1受體拮抗劑，從而減少前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕肝臟的炎癥反應(yīng)。白細(xì)胞介素10可通過減少Bcl-2的表達(dá)及促進(jìn)FasL和Bax的表達(dá)促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的凋亡。

3 展望

近年來隨著肝衰竭的發(fā)病率的增加，傳統(tǒng)的治療及器官的移植已經(jīng)不能滿足我們對疾病治療的期望，因此干細(xì)胞的移植成為研究的熱點。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有低免疫源性，自我復(fù)制及能夠分泌細(xì)胞因子或生長因子等多種優(yōu)勢，已經(jīng)成為我們干細(xì)胞移植的首選治療細(xì)胞。但是，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源少，并且隨著動物年齡的增長逐漸減少，而且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的具體機制尚不明確，因此怎樣能夠大量獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，促進(jìn)體內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化及白細(xì)胞介素對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞樣細(xì)胞的各個階段的影響，至今還沒有弄清楚。通過各種途徑對肝細(xì)胞特征性蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄水平、糖原染色等來分析誘導(dǎo)分化的效果，了解白細(xì)胞介素對干細(xì)胞生長的可能影響，能夠為干細(xì)胞移植治療肝衰竭提供積極的指導(dǎo)意義。

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篇6

【關(guān)鍵詞】肌干細(xì)胞；肌再生；肌肉修復(fù)；肌衛(wèi)星細(xì)胞

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2013）03-0141-01

肌衛(wèi)星細(xì)胞Mauro[1]等于1961年首次在蛙骨骼肌中發(fā)現(xiàn)。肌衛(wèi)星細(xì)胞是具有增殖和自我更新能力的成肌前體細(xì)胞，這種組織特異的祖細(xì)胞在出生后骨骼肌的損傷、修復(fù)和維持再生中起著重要的作用。Gussoni等[2]用Hoechest/FACS方法從骨骼肌中分離到多能干細(xì)胞，有關(guān)性質(zhì)尚不清楚。這些肌源干細(xì)胞既能形成再生肌纖維，也能有效重建造血系統(tǒng)。肌源干細(xì)胞的這種可塑性，使有關(guān)肌衛(wèi)星細(xì)胞的起源、激活與分化的分子調(diào)控機制以及肌衛(wèi)星細(xì)胞的干細(xì)胞特性等方面的研究成為該領(lǐng)域的熱門課題。

1 肌衛(wèi)星細(xì)胞的起源

肌衛(wèi)星細(xì)胞屬于肌源性細(xì)胞譜系，起源仍不完全清楚，目前有兩種假說：體節(jié)來源和內(nèi)皮來源。體節(jié)來源假說來自雞雛鵪鶉異源嵌合體實驗，將鵪鶉的胚胎中胚層生肌節(jié)移植到宿主雞的胚胎中，且被移植的鵪鶉細(xì)胞有明顯的形態(tài)特征，可以觀察到這些細(xì)胞從移植的中胚層生肌節(jié)遷徙到胚胎發(fā)育的肢體，并組成出生后雞骨骼肌的肌衛(wèi)星細(xì)胞群。以后，大量的研究也證明了這一假說。De Angelis等認(rèn)為，衛(wèi)星細(xì)胞也有可能是內(nèi)皮來源的。從胚胎背側(cè)主動脈分離到的細(xì)胞具有與肌衛(wèi)星細(xì)胞相似的形態(tài)和基因表達(dá)特征，此外，將這種主動脈來源的細(xì)胞移植到新生小鼠后，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞參與出生后肌肉的生長和再生，并可與中胚層生肌節(jié)來源的肌纖維融合。因此，他們認(rèn)為肌衛(wèi)星細(xì)胞可能起源于胚胎血管祖細(xì)胞。

2 肌衛(wèi)星細(xì)胞的分布、形態(tài)學(xué)特征及自我更新

2.1 肌衛(wèi)星細(xì)胞的分布

肌肉衛(wèi)星細(xì)胞只存在于骨骼肌內(nèi)，心肌和平滑肌內(nèi)沒有衛(wèi)星細(xì)胞。骨骼肌的肌纖維分為快肌纖維和慢肌纖維，衛(wèi)星細(xì)胞在這兩種肌纖維內(nèi)均有分布，但在慢肌纖維的衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量要多于快肌纖維。這種不均勻分布的調(diào)節(jié)機制仍不清楚。

2.2 肌衛(wèi)星細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

肌肉衛(wèi)星細(xì)胞是未分化的單核肌源性細(xì)胞群，在哺乳動物、爬行動物、鳥類、兩棲動物的骨骼肌內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)。Mauro[1]等在蛙的肌肉中首先發(fā)現(xiàn)了衛(wèi)星細(xì)胞的存在。電鏡觀察提示衛(wèi)星細(xì)胞位于骨骼肌纖維的肌細(xì)胞膜與基底膜之間，其核較大、胞漿少、細(xì)胞器數(shù)量少。

2.3 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的自我更新

肌肉衛(wèi)星細(xì)胞具有自我更新的能力，以維持其數(shù)量的相對穩(wěn)定。肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的自我更新存在兩種機制：一是由于非對稱性分裂所造成的；二是肌肉衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行對稱性分裂。但還無法確定自我更新的確切機制，研究提示，轉(zhuǎn)錄因子、Pax7或Notch/ Numb信號途徑可能參與其中。

3 肌衛(wèi)星細(xì)胞在骨骼肌組織創(chuàng)傷修復(fù)過程中的重要作用

正常肌肉創(chuàng)傷后的修復(fù)主要靠肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化完成。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞屬于組織干細(xì)胞，起源于胚胎中胚層，具有增殖分化潛力，正常處于靜止?fàn)顟B(tài)，呈小圓球形存在于肌細(xì)胞基底膜與肌膜之間，因此有人也把它稱為靜止的肌干細(xì)胞。當(dāng)肌肉受到創(chuàng)傷等刺激條件時，肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活進(jìn)入有絲分裂循環(huán)，及時提供肌肉修復(fù)的成肌細(xì)胞。

不論損傷形式如何，骨骼肌的再生過程大致相同。創(chuàng)傷研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后首先是受損肌纖維出現(xiàn)不同程度壞死，然后在受累區(qū)域出現(xiàn)巨噬細(xì)胞清除壞死肌纖維，但保留壞死肌纖維周圍的基底膜，就像許多中空“管道”樣的支架。肌組織受創(chuàng)后約3～12h，肌衛(wèi)星細(xì)胞即有骨骼肌調(diào)節(jié)因子MyoD/Myf5的表達(dá)，此時肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活，在傷后1周內(nèi)迅速分裂、增殖，數(shù)量達(dá)到高峰，之后仍維持一定的分裂能力，但數(shù)量卻逐漸減少。減少的衛(wèi)星細(xì)胞沿著殘留的基底膜在原肌纖維（已被清除） 部位相互融合，成為肌小管。肌小管不斷接受新生的肌衛(wèi)星細(xì)胞，相鄰肌小管互相融合而逐漸長大，同時肌小管能合成肌原纖維，這就是幼稚的肌纖維。在局部微環(huán)境調(diào)節(jié)下，幼稚肌纖維逐漸成熟，修復(fù)損傷肌組織。

可見，受損骨骼肌再生主要取決于3個方面：（1）基底膜的完整性；（2）受損肌肉的血供重建；（3）受損肌肉的神經(jīng)支配。其中最為重要的在于衛(wèi)星細(xì)胞被激活，以及激活的衛(wèi)星細(xì)胞在短時間內(nèi)迅速大量分裂增殖的能力。目前研究的重點之一是該環(huán)節(jié)中各細(xì)胞因子的作用。

4 肌衛(wèi)星細(xì)胞的標(biāo)志物

自從成體骨骼肌中發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星細(xì)胞以來，主要利用轉(zhuǎn)基因芯片和基因敲除的方法來研究肌肉損傷修復(fù)過程中起重要作用的細(xì)胞的分子標(biāo)記?？勺鳛槌审w骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)記的有細(xì)胞表面受體，黏著蛋白，生長因子和轉(zhuǎn)錄因子等。

4.1 細(xì)胞表面受體

c-Met是肝細(xì)胞生長因子（HGF）的受體，屬多功能細(xì)胞因子酪氨酸激酶受體。來源于間質(zhì)細(xì)胞的肝細(xì)胞生長因子通過與受體結(jié)合，能促進(jìn)腫瘤及新生血管生成，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移或直接浸潤周圍組織及腫瘤血管生成過程中發(fā)揮重要作用。酪氨酸激酶受體在體節(jié)的生肌節(jié)和神經(jīng)脊衍生物的發(fā)育期間都有廣泛的表達(dá)，并集中在成人骨骼肌靜止期的衛(wèi)星細(xì)胞群上。假定前體從體節(jié)中遷移失敗，胚胎就會因缺乏c-Met而死亡并伴有肢帶肌組織的缺失。迄今為止，應(yīng)用原位雜交和RT-PCR 等分子生物學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌和乳腺癌組織中，c-MetmRNA及蛋白呈高表達(dá)，在肌肉損傷組織表達(dá)的研究少見報道。

4.2 M鈣黏蛋白15

M鈣黏蛋白15是一種鈣依賴型細(xì)胞黏著分子，在靜止期衛(wèi)星細(xì)胞的亞群表達(dá)，而且在激活的衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)明顯增加。Cdh15可能是對衛(wèi)星細(xì)胞的定位起錨定作用和（或）促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞向受傷區(qū)域移行修復(fù)。當(dāng)小鼠缺乏M鈣黏蛋白時，肌肉的發(fā)育和再生仍是正常的，有可能是因為其他的鈣黏蛋白替代了M鈣黏蛋白的缺失，說明了這些黏著因子在功能上的重復(fù)。其他用于肌肉衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)記的整聯(lián)蛋白和黏著蛋白包括VCAM-1（血管細(xì)胞黏附分子-1）和NCAM（神經(jīng)細(xì)胞黏著因子）。

4.3 生長因子

肝細(xì)胞生長因子或者分散因子是在骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)的分子量為90Kd的蛋白，由于機械性的牽拉或者損傷而釋放增加。有活性的肝細(xì)胞生長因子是c-Met（肝細(xì)胞生長因子受體）的配體，是一種在衛(wèi)星細(xì)胞群中通過有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)p38 MAPK和PI3K信號通路促進(jìn)細(xì)胞周期（從G0靜止?fàn)顟B(tài)到G1）興奮折返的活化劑。關(guān)于一氧化氮（NO）介導(dǎo)的HGF的釋放即在沒有衛(wèi)星細(xì)胞的情況下NO和HGF是否參與肌肉的再生仍然是需要解決的問題。

4.4 轉(zhuǎn)錄因子

Foxk1轉(zhuǎn)錄因子控制級聯(lián)最終調(diào)節(jié)細(xì)胞群落。Foxkl是叉頭/ 翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，表達(dá)于胚胎晚期、出生后和成熟肌肉內(nèi)的靜止和增殖期衛(wèi)星細(xì)胞群。Foxk1也是肌肉衛(wèi)星細(xì)胞中p21CIP（周期素依賴性蛋白激酶抑制因子） 的逆行調(diào)節(jié)因子。Foxk1缺陷小鼠發(fā)育遲緩并且因為衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量的下降和細(xì)胞周期動力學(xué)的損害引起骨骼肌再生功能嚴(yán)重受損。

Budkingham實驗室使用綠色熒光蛋白（GFP） 受體定位了Pax3基因座。這個模型揭示了Pax3和Pax7在胚胎發(fā)育期共同表達(dá)于大部分成肌節(jié)細(xì)胞（>87%），對成肌節(jié)細(xì)胞的增殖發(fā)揮重要作用。Pax7突變小鼠可以有正常的肌肉發(fā)育，并且最初可以有整個衛(wèi)星細(xì)胞群落，但在出生后卻無法維持，有嚴(yán)重的肌肉再生能力損害，說明Pax7在衛(wèi)星細(xì)胞維持方面（或者作為抗凋亡因子）的作用。

5 肌衛(wèi)星細(xì)胞在生物治療和組織工程中的應(yīng)用

5.1 應(yīng)用于遺傳性肌病的基因治療

肌衛(wèi)星細(xì)胞移植較早用于某些遺傳性肌病的基因治療，如杜興肌營養(yǎng)不良癥（DMD），患者肌細(xì)胞缺少編碼dystrophin蛋白的基因，細(xì)胞膜不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致肌纖維壞死，患者常死于呼吸衰竭。目前在肌營養(yǎng)不良對應(yīng)的動物模型小鼠上進(jìn)行了大量的肌衛(wèi)星細(xì)胞移植治療肌營養(yǎng)不良癥的動物實驗，結(jié)果表明，將正常肌衛(wèi)星細(xì)胞移植到MDX小鼠的骨骼肌肉組織后，能與宿主（MDX小鼠）的肌纖維融合，形成雜交肌纖維。dystrophin特異性免疫組織化學(xué)染色結(jié)果說明，正常肌衛(wèi)星細(xì)胞能與MDX小鼠的肌纖維融合并表達(dá)其基因產(chǎn)物dystrophin。

5.2 應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)和組織工程

肌衛(wèi)星細(xì)胞是哺乳動物體內(nèi)唯一能大量分裂、增殖及遷移的肌組織前體細(xì)胞，具有與宿主肌纖維融合的能力，可作為一種有效載體廣泛用于目的基因的轉(zhuǎn)移。目前已經(jīng)通過基因工程獲得能表達(dá)人類Ⅸ因子、紅細(xì)胞生成素（EPO）及克隆形成刺激因子（CSF21） 等基因產(chǎn)物的肌衛(wèi)星細(xì)胞株。將這些基因工程化的肌衛(wèi)星細(xì)胞移植到相對應(yīng)疾病的動物模型后，均能在受者的外周血中測得相應(yīng)的基因產(chǎn)物。

6 展望

盡管對肌衛(wèi)星細(xì)胞的研究已有近半個世紀(jì)，且大量研究也揭示了肌衛(wèi)星細(xì)胞在骨骼肌生長、修復(fù)和再生中的重要作用，但肌衛(wèi)星細(xì)胞從靜止到激活、增殖直到終末分化狀態(tài)的基因表達(dá)特性及其分子調(diào)控機理還不甚明了。此外，有關(guān)肌衛(wèi)星細(xì)胞的起源和是否是多能干細(xì)胞等問題也需要進(jìn)一步證明。這些問題的解決對包括DMD肌萎縮癥和帕金森病在內(nèi)的多種臨床退行性疾病的治療具有重要的價值。

參考文獻(xiàn)：

篇7

1.1一般資料2008年9月~2010年3月在我院婦科門診就診的13150例宮頸疾病患者,年齡18~70歲,中位年齡35歲,來自柳州市及郊區(qū)各縣?；颊叽蠖辔醋鲞^細(xì)胞學(xué)檢查,包括宮頸炎癥、宮頸糜爛、宮頸贅生物、陰道不規(guī)則流血等,無宮頸椎切和子宮切除史。

1.2標(biāo)本采集及處理:用宮頸刷收集宮頸及頸管細(xì)胞,將收集的細(xì)胞洗入細(xì)胞保存液中,經(jīng)美國Cy-tyc公司液基細(xì)胞處理器程序化處理制成直徑2cm的薄層細(xì)胞片,95%酒精固定,巴氏染色。

1.3細(xì)胞學(xué)分析方法:采用TBS(2001版)診斷標(biāo)準(zhǔn)[1],即:未見上皮內(nèi)病變或惡性病變(NILM)、意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)、不典型鱗狀上皮細(xì)胞不除外高級病變(ASC-H)、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL,包括HPV感染),高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、鱗狀細(xì)胞癌(SCC)、意義不明的不典型腺細(xì)胞(AGC)和腺癌(AC)。

1.4陰道鏡檢查及活檢:對細(xì)胞學(xué)陽性及臨床懷疑宮頸病變的陰性患者共3185例行陰道鏡檢下多點取材活檢術(shù);將活檢結(jié)果按年齡段分析,即≤29歲組、30~39歲組、40~49歲組、≥50歲組,差異性分析用?2檢驗,顯著性差異界限為P<0.05。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞學(xué)結(jié)果13150例TCT篩查:未見上皮內(nèi)病變或惡性病變(NILM)12219例(92.92%)、LSIL(包括HPV感染)240例(1.83%)、HSIL96例(0.73%)、SCC9例(0.06%)、AC4例(0.03%)、ASC-US508例(3.86%)、ASC-H74例(0.06%);微生物感染項中,HPV感染121例(0.92%)、滴蟲感染59例(0.45%)、真菌感染232例(1.76%)、線索細(xì)胞>20%,提示細(xì)菌性陰道病(BV)457例(3.48%)、皰疹病毒感染5例(0.00%)。

2.2SIL的年齡分布篩查發(fā)現(xiàn)40歲以下年齡組發(fā)病率高于40歲以上年齡組;30~39歲年齡段宮頸上皮內(nèi)病變的發(fā)生率高于其它年齡段,顯著性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.3組織學(xué)對照在活檢確診240例LSIL、96例HSIL、9例SCC及4例AC標(biāo)本中,TCT陽性305例,敏感性為87.39%;活檢2836例陰性者中,TCT陰性2695例,特異性是95.03%。細(xì)胞學(xué)跟組織學(xué)符合率分別為:LSIL84.17%(202/240);HSIL93.75%(90/96);SCC100%(9/9);AC100%(4/4)。

3討論

3.1近年來,我國宮頸癌的發(fā)生有明顯上升和年輕化趨勢,發(fā)病以每年2%~3%的速度增長。宮頸癌是一種感染性疾病(HPV感染),是可預(yù)防、可治愈的疾病。據(jù)報道,宮頸浸潤性癌5年生存率為67%;早期癌為90%;原位癌即CINⅢ為100%。因此對宮頸CIN和早期癌的及時高效篩查和正確處理是防治宮頸癌的關(guān)鍵。本次13150例TCT篩查SIL以上級別病變病例349例(2.65%),對照活檢,TCT檢測的敏感性為87.39%、特異性是95.03%。SIL檢出率跟國內(nèi)崔彬[2]等用TCT檢測4000例(SIL以上病變檢出率2.21%)相接近;敏感性較王榮妹[3]等報道的稍偏高,表明TCT的推廣應(yīng)用,提高了篩查的敏感性和特異性,降低了假陰性和假陽性,有助于預(yù)防宮頸病變的發(fā)病率和降低宮頸癌的死亡率,這亦是防治宮頸癌的關(guān)鍵所在。

3.2本研究發(fā)現(xiàn)40歲以下年齡組發(fā)病率高于40歲以上年齡組;30~39歲年齡段SIL的發(fā)生率高于其它年齡組(P<0.001),與文獻(xiàn)報道相同,提示宮頸癌有年輕化趨勢[4],也說明了宮頸上皮內(nèi)病變與生育年齡段婦女有密切關(guān)系,提示該年齡段婦女定期進(jìn)行宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的必要性。

篇8

【關(guān)鍵詞】 天然腦活素； 人胚肺成纖維細(xì)胞；增殖活度；復(fù)制性衰老；延緩

〔Abstract〕

Objective

To explore the effects of Natural Cerebrolysin on cell proliferation activity and replicative senescence of human embryonic lung diploid fibroblasts (MRC-5 cells) and its mechanism. Methods

To observe the changes of senescent phenotype by light microscope， count the passage ages and velocity， detect the potential of cell proliferation by MTT. The changes of cells senescence of Natural Cerebrolysin-effected MRC-5 cells were studied by X-Gal staining method， and the positivecell rates of senescence cells were detected and analyzed.． Results

Natural Cerebrolysin maintainedunaltered cell morphology and increased life span of MRC-5 by at least 18-21 passages. Comparing withthe control senium cells， the proliferation potential of MRC-5 cells incubated with Natural Cerebrolysin was increased obviously (P < 0.05)， and the passage velocity was enhanced double of that of the controlsenium cells (P < 0.01). In addition， the positive cell rate of senescence cells was significantly lower in late passage cells in sequenced multigeneration culture in Natural Cerebrolysin than those of control senium cells (P < 0.01)， and similar to those of young cells.

Conclusion

As a result， we concluded that Natural Cerebrolysin could notably promote the proliferation activity of MRC-5 cells and delay the cells replicative senescence efficiently.

〔Key Words〕

Natural Cerebrolysin; Human embryonic lung diploid fibroblasts; Proliferation activity; Delay; Replicative senescence

衰老（senescence）是細(xì)胞的重要生命現(xiàn)象之一，絕大多數(shù)正常細(xì)胞被認(rèn)為僅有有限的分裂能力，當(dāng)其經(jīng)過一定的倍增之后，將進(jìn)入終末增殖狀態(tài)，稱為細(xì)胞衰老。一般來講，人類胚胎的成纖維細(xì)胞在達(dá)到衰老時，能夠復(fù)制 50 代左右（Population Doublings， Pds），由于這種衰老是由分裂傳代而達(dá)到的，故又稱之為復(fù)制性衰老（replicative senescence）[1]。探討細(xì)胞衰老的分子機理是人類認(rèn)識自我研究的重要組成部分，從分子水平研究衰老過程中基因及調(diào)控變化，已成為目前衰老機理研究的主要方向，同時研究開發(fā)延緩衰老的藥物將為提高人類生存質(zhì)量提供重要保證，也為衰老相關(guān)疾病的防治提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

天然腦活素為結(jié)合臨床經(jīng)驗和現(xiàn)代藥效學(xué)正交實驗優(yōu)化篩選而成，本研究在以往基礎(chǔ)上以人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞（MRC-5）為研究對象，觀察了天然腦活素對 MRC-5 細(xì)胞表型、細(xì)胞代齡、傳代速度、細(xì)胞生長增殖能力及衰老相關(guān)指標(biāo)的影響，旨在探討其延緩 MRC-5 細(xì)胞復(fù)制性衰老的作用及其機理。

1

材料與方法

1.1

材料

1.1.1

細(xì)胞株與動物

MRC-5 細(xì)胞是人胚肺成纖維細(xì)胞，由美國 ATCC 細(xì)胞庫提供（ATCC No: CCL-171），并規(guī)定 28 代及以下為年輕細(xì)胞，50 代及以上為老年細(xì)胞，采用含 10% 胎牛血清（FBS）的 EMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)。

新西蘭家兔，雄性，體重（1.5±0.2）kg，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，經(jīng) 1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)之后進(jìn)行實驗。

1.1.2

藥品及試劑

研究用藥天然腦活素由深圳市中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所進(jìn)行生藥鑒定并由西安楊森制藥廠制備成臨床安全級粉劑，純度為 98%。

胎牛血清、EMEM 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司。MTT 購自 Sigma 公司。β- 半乳糖苷酶細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒購自美國 KPL 公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.1.3

主要儀器

BIO-RAD 680 型酶聯(lián)免疫檢測儀（USA），Leica DM16000B 型圖象分析系統(tǒng)（Germany），SANYO MCO-15AC 型二氧化碳培養(yǎng)箱（Japan）。

1.2

方法

1.2.1

實驗分組

共分 5 組，年輕對照組；空白老齡對照組；天然腦活素低劑量組；天然腦活素中劑量組；天然腦活素高劑量組，年輕對照組和空白老齡對照組以含 10% 正?？瞻籽宓?EMEM 培養(yǎng)，天然腦活素低、中、高劑量組分別以含 2.5%、5%、10% 天然腦活素含藥血清的 EMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，血清含量不足 10% 的用正常空白血清補充。

1.2.2

實驗含藥血清的制備

含藥血清的制備：將雄性新西蘭家兔隨機分為天然腦活素灌胃組、空白對照灌胃組，每組 6 只，根據(jù)成人治療量換算為家兔用量灌胃。每個家兔每天灌藥量相當(dāng)于上述配成的成藥液 2~3 mL 。連續(xù)灌胃 1 個月，末次給藥后 2 h 內(nèi)后行頸動脈采血，離心分離血清，無菌過濾，56℃ 滅活補體，即為含藥血清，10 mL分裝后 -70℃保存?zhèn)溆谩Ｕφ湛瞻籽宓闹迫∈窃诠辔赶嗤w積的生理鹽水及相同的時間后，用同樣方式提取分離保存。

1.2.3

細(xì)胞培養(yǎng)

人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞 MRC-5 采用加入雙抗的含 10% 胎牛血清（FBS）的 EMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，在飽和濕度、37℃ 、5% CO2 常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度約 90% 時，按照 1:3 或 1:4 傳代。

1.2.4

細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查

從第 30 代起，天然腦活素低、中、高劑量組、及空白老齡對照組細(xì)胞分別以含 2.5%、5%、10% 天然腦活素含藥血清及 10% 正常空白血清 EMEM 培養(yǎng)液代替含 10% FBS 的 EMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)傳代。光鏡下跟蹤觀察細(xì)胞形態(tài)大小、胞漿折光性、漿內(nèi)顆粒大小和密度以及細(xì)胞排列情況。

細(xì)胞總傳代次數(shù)按 ∑log 2（ D/Do/R）計算，D、Do 分別為收獲和接種時的細(xì)胞密度，R 為細(xì)胞貼壁率； 細(xì)胞平均傳代速度按公式（傳代次數(shù)-28）/周數(shù)計算，細(xì)胞傳代后如 3 周內(nèi)不能融合，定義為細(xì)胞復(fù)制性衰老終末。

1.2.5

細(xì)胞增殖活度的檢測——MTT 法測定

將第 52 代 MRC-5 細(xì)胞以每孔 1.0×104/mL 的密度接種于 96 孔板，200 L / 孔，常規(guī)培養(yǎng) 20 h，待細(xì)胞貼壁后，更換不同含藥血清培養(yǎng)液 200 L / 孔，分別于培養(yǎng) 48 h 后，加 入 0.5% MTT 溶液 50 L，置 37℃ ，5 % CO2 條件下 4 h，出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)晶后，棄上清，PBS 洗 1~2 次，加入 DMSO 150 L / 孔，室溫輕柔震搖 2~3 min 以充分溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀于 490 nm 測 A（OD） 值。

1.2.6

衰老細(xì)胞數(shù)的檢測

將各組 MRC-5 細(xì)胞接種于蓋玻片上，經(jīng)干預(yù)處理后，PBS 洗 1 次，用 40 g/L 多聚醛固定細(xì)胞 45 min，用 X - 半乳糖苷酶（X-Gal）染液（含 20 mmol/L X-gal、40 mmol/L 醋酸-磷酸鈉（pH 6.0）、5 mmol/L 鐵氰化鉀、5 mmol/L 亞鐵氰化鉀、150 mmol/L 氯化鈉、2 mmol/L 氯化鎂），37℃ 保溫 4~8 h，然后用雙蒸水沖洗 2 次，再固定 4 min（固定液：體積分?jǐn)?shù)為 70% 乙醇、福爾馬林、冰醋酸按 20:2:1 比例混合），流水輕輕沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。細(xì)胞胞漿染成青綠色的為衰老的陽性細(xì)胞，每張片子鏡下計數(shù) 400 個細(xì)胞，確定 X-Gal 染色陽性衰老細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.3

統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果以數(shù)據(jù)和圖表表示，測定值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用 SPSS 8.0 軟件包分析，兩組比較采用 student t 檢驗，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，以 P < 0.0 5 為存在統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。

2

結(jié)

果

2.1

天然腦活素對細(xì)胞表型的影響

由圖 1 可見，年輕組細(xì)胞呈梭性或長梭形，核仁清晰，胞漿折光性強，細(xì)胞融合速度快，細(xì)胞排列整齊有序；復(fù)制性衰老細(xì)胞形態(tài)變異，胞體扁平寬大不規(guī)則，核仁不明顯，細(xì)胞排列凌亂無序，胞漿內(nèi)顆粒累積，出現(xiàn)空泡，細(xì)胞融合速度減慢；天然腦活素處理組細(xì)胞老齡化程度不明顯，細(xì)胞形態(tài)變化不大，而與年輕細(xì)胞相似。將已經(jīng)出現(xiàn)衰老表型的老齡細(xì)胞轉(zhuǎn)入含天然腦活素的 EMEM 中繼續(xù)培養(yǎng) 24~72 h，細(xì)胞的衰老表型出現(xiàn)一定程度的改善，但未見完全逆轉(zhuǎn)。

2.2

天然腦活素對 MRC-5 細(xì)胞代齡和傳代速度的影響

含天然腦活素血清的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng) MRC-5 細(xì)胞，與用含同體積空白對照血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)的 MRC-5 細(xì)胞進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天然腦活素低、中、高劑量組細(xì)胞的代齡顯著高于空白老齡對照組細(xì)胞。天然腦活素培養(yǎng)的細(xì)胞傳代速度亦明顯快于老齡對照細(xì)胞（見表 1）。

2.3

天然腦活素對細(xì)胞增殖活度（MTT 值）的影響

分別用空白對照血清和天然腦活素血清培養(yǎng)第 50 代 MRC-5 細(xì)胞 48 h 后，應(yīng)用 MTT 法檢測細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)天然腦活素培養(yǎng)的細(xì)胞增殖活度明顯高于空白老齡對照組細(xì)胞（P < 0.05），且隨濃度增加而升高；與年輕細(xì)胞無顯著性差異（P > 0.05） 。 提示，天然腦活素可促進(jìn) MRC-5 細(xì)胞的生長增殖（見表 2）。

2.4

天然腦活素對 MRC-5 細(xì)胞衰老細(xì)胞數(shù)目的影響

天然腦活素作用于衰老成纖維細(xì)胞一定時間，固定后用 X-gal 染色檢測其 β- 半乳糖苷酶活性。 SA-β- 半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞的胞漿染為青綠色，空白老齡對照組細(xì)胞 SA-β- 半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于年輕組細(xì)胞，而天然腦活素處理細(xì)胞組陽性細(xì)胞數(shù)較空白老齡對照組顯著降低（P < 0.01），見表 2。提示，天然腦活素可下調(diào) MRC-5 細(xì)胞 SA-β-半乳糖苷酶的表達(dá)，抑制細(xì)胞衰老，延長細(xì)胞壽命。

3

討

論

絕大多數(shù)正常人類細(xì)胞在體外組織培養(yǎng)的序列傳代過程中，逐漸喪失其增殖傳代的能力，最終達(dá)到一種不可逆的增殖停滯狀態(tài)，并可保持代謝活力的穩(wěn)定，能夠維持?jǐn)?shù)月甚至數(shù)年。這種似乎是無限期的增殖停滯狀態(tài)被命名為衰老（senescence），而細(xì)胞達(dá)到衰老狀態(tài)時的傳代次數(shù)稱為壽限[1，2]。衰老是由細(xì)胞所經(jīng)歷的傳代次數(shù)決定的，而與時間無關(guān)。體外細(xì)胞的衰老與體內(nèi)組織的衰老有直接的相關(guān)性[3，4]

人二倍體成纖維細(xì)胞（human diploid fibroblasts， HDFs）一般沒有端粒酶活性，所以當(dāng)端粒 DNA 長度丟失達(dá)到臨界長度時，染色體變形急劇增加，染色體間發(fā)生融合， 細(xì)胞不再增殖，從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡[5]，故常常被作為衰老研究的理想模型。衰老細(xì)胞除了不能復(fù)制傳代之外，還表現(xiàn)出一系列生理學(xué)、形態(tài)學(xué)和多種分子生物學(xué)的改變，如形態(tài)大小不規(guī)則，胞漿內(nèi)顆粒性物質(zhì)累積，細(xì)胞排列散亂，培養(yǎng)基中多見細(xì)胞碎片，細(xì)胞失去融合能力、縫隙連接減少等[6-8]。

筆者以在體外只能進(jìn)行有限次數(shù)分裂的人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）制備復(fù)制性衰老細(xì)胞模型，研究天然腦活素延緩衰老的作用及機理。實驗發(fā)現(xiàn)，天然腦活素培養(yǎng)的細(xì)胞在老年階段未見上述衰老表型，將已出現(xiàn)衰老樣改變的細(xì)胞轉(zhuǎn)入天然腦活素培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞的衰老表型出現(xiàn)一定程度的改善，但尚未見完全逆轉(zhuǎn)，上述結(jié)果提示：天然腦活素能夠維持 MRC-5 的非衰老表型。

細(xì)胞壽命常以體外培養(yǎng)時細(xì)胞傳代次數(shù)表示。本研究結(jié)果顯示，低劑量、中劑量、高劑量天然腦活素的 EMEM 培養(yǎng)的 MRC-5 細(xì)胞平均傳代次數(shù)，顯著高于老齡對照細(xì)胞；天然腦活素培養(yǎng)的 MRC-5 細(xì)胞傳代速度也快于老齡對照細(xì)胞。提示天然腦活素可顯著增加細(xì)胞壽命，其可能促進(jìn)了細(xì)胞的增殖速度，這一結(jié)論被 MTT 實驗進(jìn)一步證實。

天然腦活素作用于正常衰老型成纖維細(xì)胞，通過測定衰老細(xì)胞的百分比，與老齡對照組細(xì)胞相比衰老細(xì)胞數(shù)目明顯減少，衰老細(xì)胞百分比顯著降低，提示天然腦活素可延緩衰老細(xì)胞的群體死亡的發(fā)生，從而延長細(xì)胞的體外壽命。

總之，本研究通過對細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞壽命、細(xì)胞增殖活度、衰老細(xì)胞百分比等指標(biāo)的研究，初步證實天然腦活素可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖速度，進(jìn)而延緩 MRC-5 細(xì)胞的復(fù)制性衰老，為中藥延緩衰老開辟了新的研究途徑。關(guān)于天然腦活素對端粒酶活性、細(xì)胞端區(qū)縮短速率、基因損傷與修復(fù)能力以及衰老主導(dǎo)基因的表達(dá)的影響，本室正在進(jìn)一步研究中。

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篇9

1.1參加培訓(xùn)人員所屬醫(yī)院級別及工作崗位來自三級醫(yī)院占45%（72/160），二級醫(yī)院占51.3%（82/160），一級醫(yī)院占0.6%（1/160），其他醫(yī)療機構(gòu)占3.1%（5/160）；本人所屬工作崗位（可多選），在臨床檢驗室的占60.6%（97/160），在骨髓細(xì)胞形態(tài)室的占28.1%（45/160），在輸血科（室）的占3.8%（6/160），在生化室的占13.1%（21/160），在免疫室的占10.6%（17/160），在微生物室的占7.5%（12/234），在止血與凝血崗位的占8.8%（14/160），在PCR室的占1.3%（2/160）。

1.2各醫(yī)院骨髓細(xì)胞學(xué)檢驗設(shè)置骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗歸屬于臨檢室的占48.8%（78/160），歸屬于骨髓細(xì)胞形態(tài)室的占21.9%（35/160），歸屬于其他部門的占15%（24/160），歸屬于血液科的占11.8%（19/160）。

1.3血液分析儀檢測結(jié)果的復(fù)片率在0%~5%占37.5%（60/160），5%~10%占41.3%（66/160），10%~15%占14.4%（23/160），15%~25%占3.7%（6/160），>25%占5%（3.1/160）。

1.4關(guān)于培訓(xùn)內(nèi)容與培訓(xùn)方式的調(diào)查在對希望了解的培訓(xùn)內(nèi)容調(diào)查中（可多選），外周血異常細(xì)胞形態(tài)占78.1%（125/160）；骨髓細(xì)胞學(xué)檢驗占61.3%（98/160）；脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗占56.3%（90/160）；尿液檢驗占55%（88/160）；腦積液檢驗占37.5%（60/160）；疑難病例分析占33.8%（54/160）；室間質(zhì)控答疑占31.9%（51/160）。在培訓(xùn)方式的調(diào)查中，認(rèn)為理論授課與實踐操作比例為2∶1占48.1%（77/160）；為1∶1占34.4%（55/160）；為1∶2占17.5%（28/160）；認(rèn)為純理論授課或純實踐操作培訓(xùn)的人數(shù)均為0。

2討論

2.1健全體制機制調(diào)查結(jié)果表明，參加本次培訓(xùn)的檢驗人員絕大多數(shù)來自二級以上醫(yī)療機構(gòu)（占96.3%）。各醫(yī)院骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗的設(shè)置不統(tǒng)一，歸屬于臨檢室的占48.8%，歸屬于骨髓細(xì)胞室的占21.9%，歸屬于檢驗科其他部門的占15%，歸屬于血液科的占11.8%?？梢姡鄶?shù)醫(yī)院將血液和骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)分類檢驗歸屬檢驗科臨床檢驗室承擔(dān)；部分三級醫(yī)院檢驗科設(shè)立專門的骨髓細(xì)胞形態(tài)室；有的醫(yī)院將骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗歸屬血液病研究所。有專家建議應(yīng)給細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗崗位提供充分的人力與物力支持，建立健全細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗的激勵機制和約束機制，建立形態(tài)學(xué)檢驗人員評價認(rèn)可制度，對從事細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗的技術(shù)人員給予充分的鼓勵。

2.2加強質(zhì)量管理隨著高新技術(shù)的日新月異，血液分析儀所提供的測量參數(shù)也不斷增多，給臨床醫(yī)學(xué)提供的信息量越來越豐富。但值得一提的是，血涂片的鏡檢分類可提供許多重要的信息（尤其是可以觀察血小板分布、識別血液寄生蟲與各種異常血細(xì)胞），這些信息都是儀器分類所無法替代的。因此，自動化儀器只能充當(dāng)血液細(xì)胞檢查的“鏡檢篩選”角色。2005年，世界衛(wèi)生組織WHO涂片復(fù)檢協(xié)作組調(diào)查復(fù)檢結(jié)果時發(fā)現(xiàn)，每天有25%~30%的臨床血液標(biāo)本需要進(jìn)行血細(xì)胞形態(tài)學(xué)的顯微鏡檢查。因此，自動化儀器具有其自身無法克服的局限性，具有臨床意義的細(xì)胞形態(tài)改變均必須經(jīng)鏡檢才能得以確認(rèn)。有文獻(xiàn)報道只有形態(tài)學(xué)觀察才是最重要和最關(guān)鍵的復(fù)核，是一項重要的質(zhì)控內(nèi)容。從調(diào)查結(jié)果顯示，各醫(yī)院檢驗科血液分析儀檢測結(jié)果的復(fù)片率>15%的不足10%。因此，各實驗室應(yīng)建立已經(jīng)過驗證的篩選標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)出報告前應(yīng)有一個復(fù)核機制，尤其要強調(diào)顯微鏡檢查，杜絕由于忽視形態(tài)學(xué)觀察而造成臨床的漏檢或誤診，以避免給患者帶來不良影響。

2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗崗位需要高素質(zhì)的檢驗人員有文獻(xiàn)報道：細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗是檢驗科工作中難度最大的一項檢驗技術(shù)，因此，必須重視從事血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗人員的崗前培訓(xùn)，強化基本功訓(xùn)練，不斷提高其業(yè)務(wù)能力。調(diào)查的結(jié)果表明，我省檢驗人員對有關(guān)細(xì)胞形態(tài)方面培訓(xùn)表現(xiàn)出濃厚興趣。通過本次調(diào)查，我們對參加培訓(xùn)者細(xì)胞形態(tài)學(xué)識別的總體水平和存在的問題有了整體了解。在后續(xù)的培訓(xùn)中，我們將更有針對性地進(jìn)行專項培訓(xùn)，建立“點菜式”培訓(xùn)機制，做到臨床需要什么，我們培訓(xùn)什么。同時，結(jié)合血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗的特點，探索適宜的培訓(xùn)方法。在調(diào)查中顯示：100%參加培訓(xùn)的人員認(rèn)為需要采用理論講授與實踐操作鏡檢相結(jié)合的方式，而51.9%的人認(rèn)為實踐操作比例要≥50%，所有參訓(xùn)人員都不建議采取純理論授課或純實踐操作的培訓(xùn)方式。可見要改變以往純理論授課的培訓(xùn)模式，應(yīng)在理論講授的同時增加實踐操作訓(xùn)練，使講授者和學(xué)員能進(jìn)行有效互動，或講講做做、做做講講，或先講后做、先做后講，做到有的放矢，確保培訓(xùn)學(xué)習(xí)收到實效。

篇10

[關(guān)鍵詞] 胚胎干細(xì)胞；綠色熒光蛋白；分化；角膜上皮細(xì)胞；誘導(dǎo)

[中圖分類號] R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2013）03（b）-0013-03

角膜上皮位于眼角膜表面，是維持眼表正常生理功能的重要條件。健全的角膜上皮細(xì)胞是角膜抵御外界各種有害因素?fù)p傷的重要條件。人的角膜自我更新由位于角膜緣區(qū)域的角膜緣干細(xì)胞來維持，結(jié)構(gòu)與功能健全的角膜緣干細(xì)胞是角膜上皮再生的主要來源，當(dāng)角膜受到化學(xué)及熱燒傷，以及患有Stevens-Johnson syndrome等疾病時，角膜緣上皮細(xì)胞將會缺失，導(dǎo)致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危險[1]。因此，重建完整的角膜上皮就顯得異常重要。

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ES細(xì)胞）是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團分離獲得的，具有體外增殖和全能性兩大特點。近年來隨著ES細(xì)胞研究的不斷深入，其逐漸應(yīng)用于細(xì)胞、組織的修復(fù)和移植[2]。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一種新型的報告基因，用GFP作為標(biāo)志物來標(biāo)記ES細(xì)胞，可用來追蹤ES細(xì)胞在體內(nèi)的分化[3]。本研究利用質(zhì)粒pEGFP-N1脂質(zhì)體復(fù)合體轉(zhuǎn)染鼠ES細(xì)胞，并在體外誘導(dǎo)鼠ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化，為治療角膜損傷及重建角膜上皮提供細(xì)胞組織來源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鼠ES細(xì)胞由北京大學(xué)深圳研究生院分子生物學(xué)實驗室提供。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、B-巰基乙醇、非必需氨基酸，購自Sigma公司；絲裂霉素C，購自Kogyo公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、G418，均購自Invitrogen公司；白血病抑制因子（1eukemia inhibitory factor，LIF）、L-谷氨酰胺，購自Sigma公司；質(zhì)粒pEGFP-N1，購自Clontech公司；明膠、TaqDNA 聚合酶，購自博大泰克公司；CK14、CK12、CD44引物，委托寶生物工程公司合成；免疫組化二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒，購自武漢博士德公司；其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 ES細(xì)胞的培養(yǎng) ES細(xì)胞復(fù)蘇后，經(jīng)絲裂霉素C滅活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）做飼養(yǎng)層培養(yǎng)，加入預(yù)先鋪有明膠（Ⅳ型膠原）的培養(yǎng)皿中，37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日更換ES細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM（內(nèi)含0.1 mol/L β-巰基乙醇、2 mmol/L谷氨酰胺、150 mL/L胎牛血清、1 000 U/mL LIF、15 g/L非必需氨基酸）。2～3 d傳代1次。

1.2.2 轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)ES細(xì)胞 將真核細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP-N1轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞作為實驗組，空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞作為對照組。在轉(zhuǎn)染前2 h改為無血清的DMEM培養(yǎng)液；含載體pEGFP-N1質(zhì)粒的無血清DMEM 培養(yǎng)液與含脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的無血清DMEM培養(yǎng)液混合，加入ES細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，換液，培養(yǎng)基為不含LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)基。G418篩選GFP陽性細(xì)胞克隆，接種在絲裂霉素C處理的MEF飼養(yǎng)層上，繼續(xù)擴增培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。ES細(xì)胞誘導(dǎo)前去除飼養(yǎng)層細(xì)胞，接種于涂抹明膠（Ⅳ型膠原）的培養(yǎng)皿中，加入無LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)液，隔日換液，傳3～4代，誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成角膜上皮細(xì)胞。

1.2.3 形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)鑒定 顯微鏡下觀察ES細(xì)胞形態(tài)，誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞基本融合，將培養(yǎng)分化的ES細(xì)胞用PBS洗滌3次后，冷4%多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封閉30 min，滴加K14、K12及CD44單抗，4℃過夜，0.02% Triton-PBS洗滌，加人生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育40 min，PBS洗滌數(shù)次后，加入鏈親和素一過氧化物酶溶液，放置于室溫下10 min，0.02% Triton-PBS洗滌，最后DAB顯色，顯微鏡下觀察。

1.2.4 RT-PCR檢測 Trizol R試劑盒提取ES細(xì)胞總RNA，具體過程參照Trizol Reagent說明書。引物序列分別為：CD44 正義鏈5'-atcaacctgcctatgcaacc-3'，反義鏈5'-cttggacgggaactgacact-3'（248 bp）； K12正義鏈5'-cgagagtggtatgaaaca-3'， 反義鏈5'-tgggctctcatttcattg-3'（218 bp）； K14正義鏈5'-ggtcgatttgatggatttgg-3'，反義鏈5'-gttcagtgttggcctcttcc-3'（192 bp）；內(nèi)參照β-actin 正義鏈5'-gatgacgatatcgctgcgctg-3'， 反義鏈5'-gtccgaccagaggcatacagg-3'（512 bp）。每個周期參數(shù)如下：94℃ 30 s， 60℃ 35 s， 72℃ 60 s，共30個循環(huán)周期。采用小鼠角膜上皮細(xì)胞做陽性對照，每組PCR反應(yīng)均設(shè)一個陰性對照。取RT-PCR產(chǎn)物20 μL行瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

2.1 ES細(xì)胞的形態(tài)

在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的ES細(xì)胞生長旺盛，邊界光滑，呈現(xiàn)巢狀生長，集落大多呈多角形或橢圓形，集落內(nèi)細(xì)胞排列緊密，邊界不清；細(xì)胞邊界清，胞漿較豐富，細(xì)胞核大，核仁大。GFP陽性ES細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)有微弱的綠色熒光（圖1～2）。

2.2 誘導(dǎo)分化的角膜上皮細(xì)胞形態(tài)

GFP陽性ES細(xì)胞經(jīng)Ⅳ型膠原誘導(dǎo)培養(yǎng)1周，可見在細(xì)胞集落中爬出上皮樣細(xì)胞， 貼壁生長，增殖迅速，逐漸呈集落式生長，生長胞體多為扁平，呈多角型或不規(guī)則形態(tài)生長，表現(xiàn)出典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)有很強的綠色熒光（圖3～4）。

2.3 K12、K14及CD44表達(dá)情況

RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)分化的ES細(xì)胞中有K12及CD44表達(dá)，而K14則無表達(dá)，證實轉(zhuǎn)染后ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞方向分化（圖5）；免疫組化結(jié)果顯示：角膜上皮樣細(xì)胞K14的表達(dá)很少，而K12及CD44的免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性（圖6）。

3 討論

嚴(yán)重的角膜損傷一直是眼科治療的難題。一些嚴(yán)重的化學(xué)或熱燒傷，以及Stevens-Johnson syndrome等疾病，常導(dǎo)致角膜上皮的大量缺失。傳統(tǒng)的移植方法雖有一定療效，但由于供體缺乏、移植免疫及倫理等問題，在臨床上的應(yīng)用發(fā)展受到很大限制[4]。重建角膜的關(guān)鍵是獲得足夠的角膜上皮材料。本研究探索采用誘導(dǎo)有多向分化潛能的ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化，為角膜上皮移植提供無限的供體來源。

ES細(xì)胞是一種具有全能性、可無限增殖和多向分化潛能的未分化細(xì)胞，具有兩個重要特性：①自我更新潛能。干細(xì)胞在未分化狀態(tài)下可不斷增殖，從而可自我更新。②多向分化潛能。在體內(nèi)外ES細(xì)胞均有分化成許多特定細(xì)胞類型的能力。它能遷移到不同部位分化成相應(yīng)的細(xì)胞類型，恢復(fù)受損細(xì)胞的功能，成為一種新型細(xì)胞替代治療和基因治療的途徑。經(jīng)絲裂霉素C處理的含LIF的MEF作為飼養(yǎng)層，能夠抑制ES細(xì)胞的分化和促進(jìn)其增殖，并使其保持未分化狀態(tài)以及多向分化潛能[5]。本研究將Ⅳ型膠原作為誘導(dǎo)劑，加入不含LIF的培養(yǎng)板中，誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化。

GFP是一種由238個氨基酸組成的蛋白，作為熒光標(biāo)記分子，在研究細(xì)胞的分化、細(xì)胞移植中具有重要作用[6]。本研究用脂質(zhì)體方法將含有GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠ES細(xì)胞中，選擇G418篩選并純化后的GFP陽性ES細(xì)胞。將這些能夠持續(xù)表達(dá)GFP的ES細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下分化成角膜上皮樣細(xì)胞，并穩(wěn)定表達(dá)GFP，證明GFP基因已完全整合到ES細(xì)胞基因組中，這對ES細(xì)胞在體內(nèi)的分化、遷移及整合具有重要意義。

本研究對誘導(dǎo)分化后的ES細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)分化后的細(xì)胞符合具有典型上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。細(xì)胞呈集落式生長，排列緊密，邊界不清；細(xì)胞邊界清，胞漿較豐富，細(xì)胞核大，核仁大。對于眼表上皮而言，區(qū)分角膜上皮細(xì)胞與結(jié)膜上皮細(xì)胞是非常重要的，因為它們在功能上有很大區(qū)別，影響角膜上皮組織的移植。細(xì)胞角蛋白（cytokeratin）是細(xì)胞骨架成分中間絲的重要組成部分，是一類在上皮細(xì)胞中表達(dá)豐富的蛋白質(zhì)，也是某些上皮細(xì)胞重要的標(biāo)志物，其中，K14主要在結(jié)膜上皮表達(dá)而不在角膜上皮表達(dá)，K12則是在角膜上皮細(xì)胞表達(dá)的角蛋白，是特異性角膜上皮細(xì)胞標(biāo)志物。而CD44也存在于角膜上皮細(xì)胞中，功能與組織修復(fù)有關(guān)，它可以促進(jìn)角膜上皮的愈合。本實驗誘導(dǎo)分化的上皮細(xì)胞CD44和K12表達(dá)陽性，而表達(dá)K14陰性，說明誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是角膜上皮細(xì)胞，而非結(jié)膜上皮細(xì)胞。提示ES細(xì)胞能在體外定向誘導(dǎo)分化為角膜上皮樣細(xì)胞。本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測ES細(xì)胞及分化的角膜上皮樣細(xì)胞中均有K12及CD44的表達(dá)，而結(jié)膜上皮標(biāo)志物K14則無表達(dá)，證實轉(zhuǎn)染GFP后的ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞方向分化。

總之，通過以上實驗本研究成功建立了轉(zhuǎn)染GFP基因的ES細(xì)胞系，并利用Ⅳ型膠原體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為角膜上皮樣細(xì)胞，為臨床治療角膜損傷提供新的材料來源。

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