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篇1

【關鍵詞】污染土壤；微生物；修復原理；修復技術

土壤污染已經(jīng)成為全球性的重要環(huán)境問題之一。由于礦山開采、金屬冶煉以及工業(yè)污水和污泥的農業(yè)應用，大量的有毒有害重金屬元素進入土壤系統(tǒng)，在土壤中的滯留時間長，具有難降解性、隱蔽性和不可逆性的特點，不僅導致土壤的退化、農作物產(chǎn)量和品質的降低，而且還可能通過食物鏈危及人類的健康和生命。

目前，用于土壤重金屬污染治理的方法包括物理修復、化學修復和生物修復。物理修復、化學修復雖能達到一定的效果，但是能耗大、二次污染等問題也限制了其應用[1]，尤其對于大面積有害的低濃度重金屬污染，更是難以處理。重金屬污染土壤的原位生物修復是利用各種天然生物過程而發(fā)展起來的一種現(xiàn)場處理土壤環(huán)境污染的技術，可利用生物削減土壤中重金屬含量或降低重金屬毒性[2]。根據(jù)修復主體的不同，它主要分為微生物修復、植物修復和植物-微生物聯(lián)合修復。微生物修復較物理修復、化學修復有著無可比擬的優(yōu)越性，操作簡單、處理費用低、效果好，對環(huán)境不會造成二次污染，可以就地進行處理等，具有很大的潛力和廣闊的應用前景。

1.微生物修復機理

重金屬對人的毒性作用常與它的存在狀態(tài)有密切的關系。一般地說，金屬存在形式不同，其毒性作用也不同。微生物不能降解和破壞重金屬，但可以對土壤中的重金屬進行固定、移動或轉化，改變它們在土壤中的環(huán)境化學行為，可促進有毒、有害物質解毒或降低毒性，從而達到生物修復的目的。

1.1 微生物的轉化作用

微生物對重金屬的轉化作用包括氧化還原作用、甲基化與去甲基化作用以及重金屬的溶解和有機絡合配位降解。土壤中的一些重金屬元素可以多種價態(tài)和形態(tài)存在，不同價態(tài)和形態(tài)的溶解性和毒性不同，可通過微生物的氧化還原作用和去甲基化作用改變其價態(tài)和形態(tài)，從而改變其毒性和移動性。

1.1.1 氧化還原作用

微生物可通過改變重金屬的氧化還原狀態(tài)，使重金屬化合價發(fā)生變化，改變重金屬的穩(wěn)定性。Silver等[3]提出，在細菌作用下氧化還原是最有希望的有毒廢物生物修復系統(tǒng)。微生物能氧化土壤中多種重金屬元素，某些自養(yǎng)細菌如硫-鐵桿菌類 （Thiobacillus ferrobacillus）能氧化As、Cu、Mo和Fe等，假單孢桿菌屬 （Pseudomonas）能使As、Fe和Mn等發(fā)生生物氧化，降低這些重金屬元素的活性。微生物對重金屬的轉化作用常見的有對鉻、汞、硒和砷等的轉化。如假單胞菌（ Pseudomonadsp.） 可以把六價鉻還原為三價鉻，從而降低其毒性[4]。

1.1.2 甲基化與去甲基化作用

微生物可通過改變重金屬的甲基化和去甲基化作用改變重金屬的環(huán)境效應。Fwukowa從土壤中得到假單胞桿菌K-62，它能分解無機汞和有機汞而形成元素汞，元素汞的生物毒性比無機汞和有機汞低得多。Frankenber等通過耕作、優(yōu)化管理、施加添加劑等來加速硒的原位生物甲基化，使其揮發(fā)而降低硒的毒性，此生物技術已在美國西部灌溉農業(yè)中用于清除硒污染[5]。有些真菌和細菌能使無機As轉化為揮發(fā)性有機As，從而降低其毒性[6]。

1.1.3 重金屬溶解或配位絡合作用

一些微生物，如動膠菌、藍細菌、硫酸鹽還原菌以及某些藻類，能夠產(chǎn)生胞外聚合物如多糖、糖蛋白等具有大量的陰離子基團，與重金屬離子形成絡合物。如Bargagli在Hg礦附近土壤中分離得到很多高級真菌，一些菌根種和所有腐殖質分解菌都能積累Hg達到100 mg/kg土壤干重[7]。

1.2 微生物的積累和吸著作用

土壤中重金屬離子有5種形態(tài)：可交換態(tài)、碳酸鹽結合態(tài)、鐵錳氧化物結合態(tài)、有機結合態(tài)、殘渣態(tài)。前3種形態(tài)穩(wěn)定性差，后2種形態(tài)穩(wěn)定性強。重金屬污染物的危害主要來自前3種不穩(wěn)定的重金屬形態(tài)[6]。微生物固定作用可將重金屬離子轉化為后兩種形態(tài)或積累在微生物體內，從而使土壤中重金屬的濃度降低或毒性減小。微生物固定作用有胞外吸附作用、胞外沉淀作用和胞內積累作用3種形式。其作用方式有以下幾種：①金屬磷酸鹽、金屬硫化物沉淀；②細菌胞外多聚體；③金屬硫蛋白、植物螯合肽和其他金屬結合蛋白；④鐵載體；⑤真菌來源物質及其分泌物對重金屬的去除[8]。

1.2.1 胞外吸附作用

胞外吸附作用主要是指重金屬離子與微生物的產(chǎn)物或細胞壁表面的一些基團通過絡合、螯合、離子交換、靜電吸附、共價吸附等作用中的一種或幾種相結合的過程[2]。許多研究表明細菌及其代謝產(chǎn)物對溶解態(tài)的金屬離子有很強的絡合能力，這主要因為細菌表面有獨特的化學組成。細胞壁帶有負電荷而使整個細菌表面帶負電荷，而細菌的產(chǎn)物或細胞壁表面的一些基團如-COOH、-NH2、-SH、-OH等陰離子可以增加金屬離子的絡合作用[9]。研究表明，許多微生物，包括細菌、真菌和藻類可以生物積累（bioaccumulation）和生物吸著 （biosorption）環(huán)境中多種重金屬和核素[10]。一些微生物如動膠菌、藍細菌、硫酸鹽還原菌以及某些藻類，能夠產(chǎn)生胞外聚合物如多糖、糖蛋白等具有大量的陰離子基團，與重金屬離子形成絡合物。

1.2.2 胞外沉淀作用

胞外沉淀作用指微生物產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物與重金屬結合形成沉淀的過程。在厭氧條件下，硫酸鹽還原菌中的脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）和腸狀菌屬（Desulfotomaculum）可還原硫酸鹽生成硫化氫，硫化氫與Hg2+形成HgS沉淀，抑制了Hg2+的活性[11]。某些微生物產(chǎn)生的草酸與重金屬形成不溶性草酸鹽沉淀。

1.2.3 胞內積累作用

胞內積累作用是指重金屬被微生物吸收到細胞內而富集的過程。重金屬進入細胞后，通過區(qū)域化作用分布在細胞內的不同部位，微生物可將有毒金屬離子封閉或轉變成為低毒的形式[12]。微生物細胞內可合成金屬硫蛋白，金屬硫蛋白與Hg、Zn、Cd、Cu、Ag 等重金屬有強烈的親合性，結合形成無毒或低毒絡合物。如真菌木霉、小刺青霉和深黃被包霉通過區(qū)域化作用對Cd、Hg都有很強的胞內積累作用[13]。研究表明，微生物的重金屬抗性與MT積累呈正相關，這使細菌質?？赡苡锌怪亟饘俚幕?，如丁香假單胞菌和大腸桿菌均含抗 Cu基因，芽孢桿菌和葡萄球菌含有抗Cd和抗Zn基因，產(chǎn)堿菌含抗Cd、抗 Ni及抗Co基因，革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌中含抗As和抗Sb基因。Hiroki[14]發(fā)現(xiàn)在重金屬污染土壤中加入抗重金屬產(chǎn)堿菌可使得土壤水懸浮液得以凈化?？梢?，微生物生物技術在凈化污染土壤環(huán)境方面具有廣泛的應用前景。

2.重金屬污染土壤微生物修復技術及其研究進展

微生物修復重金屬污染的技術主要為原位修復和異位修復。微生物原位修復技術是指不需要將污染土壤搬離現(xiàn)場，直接向污染土壤投放N、P等營養(yǎng)物質和供氧，促進土壤中土著微物或特異功能微生物的代謝活性，降解污染物主要包括：生物通風法（bioventing）、生物強化法（enhanced-bioremediation）、土地耕作法（1and farming）和化學活性柵修復法（chemical activated bar）等幾種。異位微生物修復是把污染土壤挖出，進行集中生物降解的方法。主要包括預制床法（preparedbed）、堆制法（composting biorernediation）及泥漿生物反應器法（bioslutrybioreactor）。

2.1 生物刺激技術

生物刺激即向污染的土壤中添加微生物生長所需的氮、磷等營養(yǎng)元素以及電子受體，刺激土著微生物的生長來增加土壤中微生物的數(shù)量和活性。關于這方面的研究國外文獻已有報道。Reddy KR，Cutright T J對鉻污染土壤的微生物修復進行的研究表明，限制鉻污染場地修復進程的一個共同因素是污染場地通常缺乏足夠的營養(yǎng)以供引進的外來微生物或土著微生物生長，以至這些微生物自身具備的還原Cr6+的潛力得不到充分發(fā)揮；為使其潛力得到充分發(fā)揮，需向其生活的環(huán)境中投加營養(yǎng)物質來刺激鉻還原菌的新陳代謝和繁殖，促進鉻污染土壤的修復[15]。HigginsT E將堆肥、鮮肥、牛糞、泥炭加入鉻污染土壤進行原位修復，提高了修復效果[16]。

2.2 生物強化技術

生物強化技術即向重金屬污染土壤中加入一種高效修復菌株或由幾種菌株組成的高效微生物組群來增強土壤修復能力的技術。所加入的高效菌株可通過篩選培育或通過基因工程構建，也可以通過微生物表面展示技術表達重金屬高效結合肽，從而得到高效菌株。

2.2.1 高效菌株篩選

高效菌株有2個來源：一是從重金屬污染土壤中篩選；二是從其他重金屬污染環(huán)境中篩選。從重金屬污染土壤中篩選分離出土著微生物，將其富集培養(yǎng)后再投入到原污染的土壤，這是本土生物強化技術（本土生物強化技術是由日本科學家Ueno A等人于2007年首次提出的[17]）。篩選、富集的土著微生物更能適應土壤的生態(tài)條件，進而更好地發(fā)揮其修復功能。目前已從Cr（VI）、Zn、Pb污染土壤中篩選分離出菌種Pseudo-monasmesophillca和maltophiliaP，Barton等對這2種菌株去除Se、Pb毒性的可能性進行了研究，發(fā)現(xiàn)上述菌種均能將硒酸鹽、亞硒酸鹽和二價鉛轉化為不具毒性且結構穩(wěn)定的膠態(tài)硒與膠態(tài)鉛。Robinson等研究了從土壤中篩選的4種熒光假單胞菌對Cd的富集與吸收效果，發(fā)現(xiàn)這4種細菌對Cd的富集達到環(huán)境中的100倍以上[1]。

2.2.2 基因工程菌構建

基因工程可以打破種屬的界限，把重金屬抗性基因或編碼重金屬結合肽的基因轉移到對污染土壤適應性強的微生物體內，構建高效菌株。由于大多數(shù)微生物對重金屬的抗性系統(tǒng)主要由質粒上的基因編碼，且抗性基因亦可在質粒與染色體間相互轉移，許多研究工作開始采用質粒來提高細菌對重金屬的累積作用，并取得了良好的應用效果[18]。

2.2.3 微生物表面展示技術

微生物表面展示技術是將編碼目的肽的DN段通過基因重組的方法構建和表達在噬菌體表面、細菌表面（如外膜蛋白、菌毛及鞭毛）或酵母菌表面（如糖蛋白），從而使每個顆?；蚣毎徽故疽环N多肽[19]。微生物表面展示技術可以把編碼重金屬離子高效結合肽的基因通過基因重組的方法與編碼細菌表面蛋白的基因相連，重金屬離子高效結合肽以融合蛋白的形式表達在細菌表面，可以明顯增強微生物的重金屬結合能力，這為重金屬污染的防治提供了一條嶄新的途徑。

LamB、冰晶蛋白、凝集素、a-凝集素和葡萄球菌蛋白A都是表面蛋白，在微生物表面展示技術中用來定位、錨定外源多肽[20-21]。Sousa C等將六聚組氨酸多肽展示在E.coliLamB蛋白表面，可以吸附大量的金屬離子，重組菌株對Cd2+的吸附和富集比E.coli大11倍[22]；Xu Z、Lee S Y將多聚組氨酸（162個氨基酸） 與Omp C融合，重組菌株吸附Cd的能力達32 mol/ g干菌[23]；Schembri M A等將隨機肽庫構建于E.coli 的表面菌毛蛋白FimH粘附素上，經(jīng)數(shù)輪篩選和富集，獲得對PbO2、CoO、MnO2、Cr2O3具有高親和力的多肽[24]；KurodaK、UedM將酵母金屬硫蛋白（YMT） 串聯(lián)體在酵母表面展示表達后，四聚體對重金屬吸附能力提高5.9倍，八聚體提高8.7倍[25]。表面展示技術用于重金屬污染土壤原位修復的研究雖然取得了許多成果，但離實際應用尚有一段距離。其主要原因是用于展示金屬結合肽的受體微生物種類及適應性有限，并且缺乏選擇金屬結合肽的有效方法[19]。

3. 結論與展望

從目前來看，微生物修復是最具發(fā)展和應用前景的生物修復技術，人們在微生物材料、降解途徑以及修復技術研發(fā)等方面取得了一定的研究進展，并展示了一些成功的修復案例。但重金屬污染土壤原位微生物修復技術目前還存在以下幾個方面的問題：（1）修復效率低，不能修復重污染土壤。（2）加入到修復現(xiàn)場中的微生物會與土著菌株競爭，可能因其競爭不過土著微生物，而導致目標微生物數(shù)量減少或其代謝活性喪失。（3）重金屬污染土壤原位微生物修復技術大多還處于研究階段和田間試驗與示范階段，還存在大規(guī)模實際應用的問題。（4）微生物個體微小，難以從土壤中分離；重金屬回收困難。

污染場地應用是各種生物修復技術研發(fā)的最終目的。一般說來，實驗室的微生物修復研究，因修復條件較為理想化，擾因素極少，其修復可能很好。如一旦將室內的微生物修復技術放大到現(xiàn)場條件下，干擾因素復雜，一系列的新問題可能會出現(xiàn)，甚至可能會遭致完全否定等現(xiàn)象。因此，微生物修復技術的場地應用是一項復雜的系統(tǒng)工程，必須融合環(huán)境工程、水利學、環(huán)境化學及土壤學等多學科知識，創(chuàng)造現(xiàn)場的修復條件，如土地翻耕、農藝措施、添加物質、高效微生物、植物修復，季節(jié)更替等，構建出一套因地因時的污染土壤田間修復工程技術。

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篇2

甲硫氨酸是繼谷氨酸之后產(chǎn)量第二大的氨基酸，2011年，針對動物飼料的甲硫氨酸市場年銷售額約28.5億美元，銷量85萬噸，年增長率5%。據(jù)不完全統(tǒng)計，2014年全球甲硫氨酸需求量約100萬噸，呈逐年增長趨勢。目前甲硫氨酸三大主要生產(chǎn)商為贏創(chuàng)（原德固賽）公司，安迪蘇（原普朗克）公司和日本曹達（原孟山都）公司[6]。2006年，中國藍星有限公司收購安迪蘇子公司，并于2010年在江蘇南京開始建廠，將最初年產(chǎn)能7萬噸的計劃翻倍至14萬噸。該廠的建成投產(chǎn)將結束中國重要動物飼料添加劑完全依賴進口的局勢。贏創(chuàng)公司2011年12月決議，在新加坡建立產(chǎn)能15萬噸的甲硫氨酸加工廠，將在2014年第三季度投入生產(chǎn)。韓國杰希公司和法國阿科瑪公司于2012年宣布將在東南亞建立產(chǎn)能8萬噸的甲硫氨酸加工廠，該廠將采用全新的發(fā)酵-化學法聯(lián)合生產(chǎn)線。德國巴斯夫公司雖然于2007年申請了發(fā)酵生產(chǎn)甲硫氨酸的專利，但至今仍不適用于商業(yè)生產(chǎn)。法國邁陀保利克公司和羅蓋特公司合作致力于L-甲硫氨酸發(fā)酵產(chǎn)品的研發(fā)[6]。

2生物技術生產(chǎn)甲硫氨酸研究進展

2.1微生物發(fā)酵路線的相關研究

2.1.1甲硫氨酸生物合成途徑的研究

為構建甲硫氨酸生產(chǎn)菌，首先需要了解甲硫氨酸的生物合成途徑，其中最基本的氨基酸生產(chǎn)菌——大腸桿菌(Escherichiacoli)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)成為研究者關注的焦點。如圖1，細菌中甲硫氨酸合成途徑以天冬氨酸為起點，經(jīng)天冬氨酸激酶(aspartokinase，AK)和高絲氨酸脫氫酶(homoserinedehydrogenase，HSD)兩個限速酶催化，生成高絲氨酸，進而分別合成蘇氨酸和甲硫氨酸。甲硫氨酸合成存在兩個途徑：巰基轉移途徑以胱硫醚為中間體，以半胱氨酸為硫源，而直接巰基化途徑則可利用無機硫源。大腸桿菌只通過巰基轉移途徑合成甲硫氨酸，谷氨酸幫桿菌可同時利用兩個途徑。2002年Hwang等[14]在谷氨酸棒桿菌中發(fā)現(xiàn)了甲硫氨酸生物合成的直接巰基化途徑，并對metY或metB進行突變，比較突變株生長參數(shù)。兩種酶在序列上存在相似性，但微生物優(yōu)先選擇巰基轉移途徑。因此它們在進化上可能來自同一種酶，而MetY是長期進化過程中突變和自然選擇的結果，存在受甲硫氨酸反饋抑制、與底物親和性低的缺陷。2007年，該課題組[15]對MetB和MetY進行純化，比較了二者的生化參數(shù)。發(fā)現(xiàn)MetB和MetY對O-乙酰高絲氨酸催化作用的Km值分別為3.9和6.4mmol/L，與之前的推測吻合。同時，MetY對硫化物離子的Km也過高，證明其與硫化物離子的結合也很微弱，溫度和pH耐受性也較MetB差。至此，MetY存在的生理意義和利用價值尚不明晰。2006年，Krmer等[16]在對大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌甲硫氨酸代謝途徑進行計算機模擬分析時發(fā)現(xiàn)，以甲硫醇為硫源時，NADPH的消耗減少，可使甲硫氨酸理論產(chǎn)量得到提高。以甲硫醇或其二聚體二甲基二硫為硫源的原理是將其-S-CH3基團完整地插入甲硫氨酸的R基而直接生成甲硫氨酸。這一理論在2010年被Bolten等[17]證實，并通過基因敲除和14C同位素示蹤實驗證明，催化這一反應的酶正是MetY。至此，MetY這一獨特功能為該領域的研究提供了全新的線索。

2.1.2甲硫氨酸生產(chǎn)菌選育的相關研究

除發(fā)酵常用的谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌之外，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、百合棒桿菌(Corynebacteriumlilium)也常用作改造的出發(fā)菌株。2012年，Dike等[3]從不同土樣中篩選出三株蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)RS-16，DS-13,和AS-9，其中最優(yōu)菌株RS-16經(jīng)96h發(fā)酵產(chǎn)甲硫氨酸1.84mg/mL。但野生型菌株氨基酸的生物合成受到嚴格的代謝調控，一般不能滿足大量生產(chǎn)氨基酸的需要。因此，需要人為打破微生物對甲硫氨酸生物合成的代謝調節(jié)。篩選抗結構類似物菌株和營養(yǎng)缺陷型菌株是最常用的育種方法。2003年，Kumar等[18]采用紫外和亞硝基胍誘變技術處理百合屬棒桿菌，篩選獲得M-128菌株，其甲硫氨酸產(chǎn)量為2.3g/L；2009年，閔偉紅等[19-20]通過抗結構類似物的篩選獲得北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)突變株E31，其甲硫氨酸產(chǎn)量達1.479g/L。2011年，該課題組以E31為出發(fā)菌株，采用復合誘變和青霉素濃縮法篩選獲得12株賴氨酸和蘇氨酸雙重營養(yǎng)缺陷型突變株，其中突變株GE37的甲硫氨酸產(chǎn)量達3.55g/L。這些傳統(tǒng)的改造方法機理難以闡明，工作量大，但突變全面、有效。隨著基因技術的發(fā)展，2007年，Park等[1]解除了蘇氨酸對HSD的反饋抑制，同時敲除了thrB基因，阻止蘇氨酸合成。分批發(fā)酵過程中甲硫氨酸產(chǎn)量達2.9g/L。2011年，Chen等[21]利用分子動力學模擬與統(tǒng)計耦合分析相結合鑒別出30個關鍵氨基酸殘基，并證明這些殘基的突變可在不同程度上解除大腸桿菌AKⅢ的反饋抑制。至此，對于兩大限速酶的研究逐漸趨于半理性，能在代謝和進化水平上做出合理的解釋，改造目標更明確。在菌種選育過程中，一些新發(fā)現(xiàn)也給研究人員以啟示。2005年，Mampel等[22]對谷氨酸棒桿菌進行轉座子誘變，得到7000個具有乙硫氨酸抗性的突變株，轉座子插入位點為ORFNCgl2640，NCl2640失活會導致甲硫氨酸產(chǎn)量增加，證明該位點與L-甲硫氨酸合成途徑中某種抑制的解除密切相關。其結構和具體功能有待科研工作者深入研究。2010年，Bolten等[17]發(fā)現(xiàn)了MetY的獨特功能后，試圖對MetY進行過表達以增加甲硫氨酸產(chǎn)量，結果MetY酶活力提高近30倍，但發(fā)酵液中并無甲硫氨酸，胞內甲硫氨酸產(chǎn)量也只提高2倍。胞內組分分析發(fā)現(xiàn)其底物O-乙酰高絲氨酸已完全耗盡。這說明半理性的單基因修飾難以保證整個代謝網(wǎng)絡的平衡，以途徑中各代謝物和酶的功能性質及代謝流分布信息為基礎，更加理性化的多基因修飾成為下一階段的研究目標。2002年BiranD發(fā)現(xiàn)大腸桿菌[23]中MetA極易被四種依賴ATP催化的蛋白酶水解，且該基因受熱轉錄休克調控。2013年，Dike等[24]對根癌土壤桿菌中MetA進行表征時發(fā)現(xiàn)了相同的不穩(wěn)定性和極端不耐熱特性。這極有可能也是賴氨酸和蘇氨酸易發(fā)酵生產(chǎn)，在同一途徑下游的甲硫氨酸卻一直難以實現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)的重要原因。

2.1.3甲硫氨酸向胞外輸出的研究

發(fā)酵法生產(chǎn)甲硫氨酸在合成水平上不易達到增產(chǎn)目標，即便細胞質內甲硫氨酸產(chǎn)量得到提高，釋放至培養(yǎng)液中的量卻極少?？偨Y有以下兩方面原因：①微生物自身調控嚴格，為趨利避害，甲硫氨酸在自然條件下不會過量積累，即使經(jīng)改造的菌株，甲硫氨酸的產(chǎn)量與微生物細胞適應性之間的平衡也難把握。②即使細胞質內甲硫氨酸過量積累，但其輸出體系不完善，產(chǎn)物被微生物自身再利用或直接傷害細胞。2005年，Trtschel等[25]在已經(jīng)提高了胞內甲硫氨酸濃度的條件下，利用DNA微陣列技術識別出過量表達的膜蛋白基因brnF（編碼BrnFE中較大的亞基），之前研究表明其與異亮氨酸輸出體系有關。當BrnFE的合成被氯霉素關閉時，仍能觀察到大量甲硫氨酸輸出，只有極大提高氯霉素水平，其輸出才會減弱。這說明甲硫氨酸輸出體系不止一個，還存在不易被識別、但輸出能力高的其它體系。發(fā)掘并擴增輸出通道既可增加發(fā)酵液中甲硫氨酸產(chǎn)量，又能避免代謝物積累對微生物的損傷。

2.1.4發(fā)酵條件的相關研究

對于甲硫氨酸發(fā)酵，最特殊的培養(yǎng)基成分即硫和甲基。以谷氨酸棒桿菌為例，2006年，Krmer等[16]用計算機模擬了不同硫源在甲硫氨酸合成途徑中的應用。以硫酸鹽為硫源通過直接巰基化途徑生成1mol甲硫氨酸消耗8molNADPH，巰基轉移途徑消耗9molNADPH，而以硫代硫酸鹽為硫源，整個代謝過程只需要5.5molNADPH，以硫化物為硫源，NADPH消耗量僅為硫酸鹽的一半。但PPP途徑和TCA循環(huán)所能提供的NADPH是固定的，因此不同硫源的利用效率有待在實踐中考證。硫與甲基來源的結合可以考慮比較硫代硫酸鹽與甲酸鹽、硫化物與甲酸鹽及甲硫醇的利用情況。除了這兩種關鍵組分，2014年，Anakwenze等[26]從發(fā)酵的油豆種子中分離出甲硫氨酸產(chǎn)量為1.89mg/ml的赤云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)EC1，對發(fā)酵總體積、接種量、碳源及氮源濃度、促生長物質均進行探索優(yōu)化，最終赤云金芽孢桿菌EC1甲硫氨酸的產(chǎn)量可以達到3.18mg/mL。對于發(fā)酵工藝的探索一直是實際生產(chǎn)中的關鍵。Sharma等[27]研究了百合棒桿菌產(chǎn)甲硫氨酸中稀釋速率與溶解氧對甲硫氨酸產(chǎn)量的影響。最終確定當稀釋速率為0.16、溶氧為42%時，甲硫氨酸生產(chǎn)速率最大值為160mg/(L•h)。2012年，賈翠英等[28]研究了不同破壁方法對細菌甲硫氨酸產(chǎn)量的影響。結果表明，經(jīng)堿破壁、溶菌酶破壁，超聲波破壁、堿與超聲波復合破壁、溶菌酶與超聲波復合破壁后，甲硫氨酸產(chǎn)量分別提高10.9%、12%、18.3%、19.6%、22.2%。這種工藝可以將胞內甲硫氨酸釋放出來，增加收率，復合破壁比單一破壁效果更顯著。

2.2酶法生產(chǎn)路線的相關研究

2.2.1外消旋混合物拆分生產(chǎn)甲硫氨酸

酶法拆分又分為兩種思路，傳統(tǒng)的拆分是消除外消旋混合物中的D-甲硫氨酸，另一種路線將D型轉化為L型，純化的同時也增加了產(chǎn)量無疑是更理想的選擇。2007年，F(xiàn)indrik等[29]利用原玻璃蠅節(jié)桿菌(Arthrobacterprotophormiae)中D-氨基酸氧化酶、過氧化氫酶、紅球菌(Rhodococcus)中L-苯丙氨酸脫氫酶、博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)中甲酸脫氫酶串聯(lián)實現(xiàn)D-甲硫氨酸向L-甲硫氨酸的完全轉化。更具意義的是，D-氨基酸氧化酶和L-苯丙氨酸脫氫酶可以作用于不同的底物，因此，該體系也適用于其它D型氨基酸及某種氨基酸外消旋體向L型的轉化合成。

2.2.2化合物酶解生產(chǎn)甲硫氨酸

2014年，Jin等[30]對大腸桿菌中經(jīng)密碼子優(yōu)化的腈水解酶基因進行重新合成和表達，從而有效利用2-氨基-4-甲硫基丁腈水解生產(chǎn)甲硫氨酸。并在催化劑充足的情況下，以固定的底物/催化劑比值探索底物最佳濃度。該課題組也對在填充床反應器中利用固定化靜息細胞生產(chǎn)甲硫氨酸進行了研究，結果顯示固定化腈水解酶100h后活性仍大于80%，甲硫氨酸總回收率達97%。該項研究表明，重組腈水解酶應用于甲硫氨酸生產(chǎn)具有巨大潛力，酶在微生物體內的過表達與酶的固定化技術相結合可能實現(xiàn)產(chǎn)量突破。

2.3發(fā)酵與體外酶催化路線相結合

發(fā)酵法即以培養(yǎng)基組分為原料，利用微生物自身體內代謝反應，將低成本原料轉化為高價值產(chǎn)品，是最經(jīng)濟環(huán)保的氨基酸生產(chǎn)方式。發(fā)酵法之所以至今無法應用于甲硫氨酸生產(chǎn)，關鍵在于其合成途徑的每一步均受到嚴格地反饋抑制，經(jīng)本課題組改造后的菌株GE37的甲硫氨酸發(fā)酵產(chǎn)量也僅為3.55g/L[20]。因此發(fā)酵法生產(chǎn)甲硫氨酸仍處于科研階段。體外酶催化反應目前并沒有一套完整的獨立生產(chǎn)體系，而是作為化學生產(chǎn)方法的輔助手段，2000年之前即用于DL-同型半胱氨酸向L-甲硫氨酸的合成及DL-甲硫氨酸的分離[31]。近年的研究也多屬于化學合成法的下游，目的是獲得高純度的L-甲硫氨酸。酶催化與發(fā)酵法相比，反應過程較短，反應體系及條件易靈活操控。因此，發(fā)酵與體外酶催化路線相結合可以回避微生物的部分反饋抑制，縮短發(fā)酵過程以得到產(chǎn)量較大的中間體，進而以此為底物合成L-甲硫氨酸。韓國杰希公司采用的發(fā)酵/化學法聯(lián)合生產(chǎn)工藝即為兩種路線結合的實例，并于2012年宣布在東南亞建立產(chǎn)能80000噸的甲硫氨酸加工廠。該路線以葡萄糖為基質，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酰高絲氨酸，隨后用酶將這一中間產(chǎn)物轉化成甲硫氨酸和琥珀酸。如圖3所示，經(jīng)計算，這種全新的發(fā)酵/化學法聯(lián)合工藝生產(chǎn)的L-甲硫氨酸成本略高于化學合成法[6]。

3面臨的問題及展望

3.1發(fā)酵法生產(chǎn)面臨的問題和建議

甲硫氨酸與其他氨基酸相比至今難以實現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)，綜合上文所述，總結了以下三個方面原因和建議：

3.1.1硫源的利用效率

甲硫氨酸與其他氨基酸最大的不同即對硫源的需求，而發(fā)酵法應用最普遍的硫源為硫酸鹽，需消耗大量NADPH，但生物體能提供的NADPH有限；硫化物對NADPH需求量雖少，但因多有毒且穩(wěn)定性差，不適用于培養(yǎng)基；硫代硫酸鹽兼具氧化性與還原性，應該對其進行進一步選擇和研究。甲硫醇作為硫和甲基的綜合供體，可以縮短代謝途徑并為最后一步提供更多甲基。因此，應該對硫代硫酸鹽與甲硫醇或二甲基二硫的復合使用進行新的嘗試。提高NADPH的供應量也是菌株改造的策略之一。

3.1.2代謝途徑調控的改造硫和甲基的參與已經(jīng)使代謝途徑增長，而合成途徑中涉及到諸多反饋抑制性酶，進一步削弱了代謝流。如何確定關鍵酶、發(fā)現(xiàn)酶的活性中心及抑制劑結合位點，并進一步識別關鍵殘基成為一個艱巨的課題。通過半理性設計，本課題組已找出北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)天冬氨酸激酶與抑制劑結合位點有直接或間接作用的所有關鍵氨基酸殘基，并通過突變解除反饋抑制得到高活力菌株。2013年，李慧穎[32]得到突變體R169H，酶活較突變前提高2.3倍；同年，郭永玲[33]得到突變體T361N、A362I，酶活分別提高47.99倍、34.60倍；2014年，任軍等[34]得到突變體G277K，酶活提高9.48倍；同年，朱運明等[35]得到突變體G377F，酶活提高9.3倍。此外，類似的單基因修飾研究缺少全面性和持續(xù)性，還應對改造前后的代謝流變化進行對比分析，嘗試針對改造后的缺陷進行多基因修飾，繼續(xù)對甲硫氨酸產(chǎn)量是否提高進行試驗。較成功的理性設計在甲硫氨酸同族氨基酸——賴氨酸生產(chǎn)中有成功的先例。2013年，SKind等人[36]根據(jù)TCA循環(huán)和賴氨酸合成途徑相關知識，通過敲除sucCD在琥珀酰輔酶A合成酶水平上有目的性地阻斷TCA循環(huán)，使其與賴氨酸合成途徑相結合，增加目的產(chǎn)物合成途徑代謝流，產(chǎn)量提高60%。由于理性設計需要大量全面準確的生物學信息，直接針對代謝流的整合在甲硫氨酸研究領域還需要嘗試和突破。

3.1.3關鍵酶在代謝過程中的穩(wěn)定性

在大腸桿菌和根癌土壤桿菌中均證實了高絲氨酸?；D移酶(homoserinetranssuccinylase,HTS)的不穩(wěn)定性，這可能也是賴氨酸和蘇氨酸易發(fā)酵生產(chǎn)，而同一途徑下游的甲硫氨酸卻一直難以實現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)的重要原因。其極端不耐熱和易被蛋白酶分解這兩大特性，是發(fā)酵法面臨的難題。對Biran等人發(fā)現(xiàn)的四種可能分解HTS的蛋白酶進行修飾，或與嗜熱菌關鍵基因整合都是菌株改造可以嘗試的方向。此外，甲硫氨酸向胞外輸出的研究尚不成熟，可在菌株改造后，對胞內組分進行量化分析，以探索胞內甲硫氨酸產(chǎn)量最大時的條件，以及能分泌到胞外營養(yǎng)缺陷型菌種選育。

3.2酶法生產(chǎn)面臨的問題和建議

篇3

關鍵詞：肽類毒素　脂多糖內毒素　霉菌毒素　檢測方法

項目類別：農業(yè)科技 項目編號：XF11C004 項目名稱：徐州市乳品質量安全檢測技術

生物毒素主要指微生物在生長代謝過程中產(chǎn)生的有毒化學物質，微量毒素侵入機體后即可引起生物機能破壞，使人畜中毒。包括肽類毒素、脂多糖內毒素、霉菌毒素等。

肽類毒素主要有溶血素、腸毒素等，其中產(chǎn)生溶血素的細菌主要有單核細胞增生李斯特菌、霍亂弧菌等。溶血素的致病機理是作用于細胞膜，造成其結構和功能的紊亂，使大量細胞內的成分泄漏，導致細胞死亡。產(chǎn)生腸毒素的細菌主要有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌等。腸毒素是細菌外毒素，通過吸收或在腸內產(chǎn)生，作用于腸黏膜，通常引起腹瀉等不適癥狀。

脂多糖內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組成成分。研究表明，過量的脂多糖內毒素可引起機體嚴重的病理生理反應，表現(xiàn)為發(fā)熱、低血壓、休克、器官功能衰竭甚至死亡等。

霉菌毒素是霉菌產(chǎn)生的一種有毒的次級代謝產(chǎn)物，它是主要的真菌毒素，多數(shù)具有致癌作用。霉菌毒素主要有：黃曲霉素、赭曲霉素、單端孢霉烯族毒素等。目前為止，黃曲霉毒素有　B　1、B　2、M　1、M　2、G　1、G2　等幾種，其中黃曲霉素B1的毒性和致癌性最強，被稱為第一大類致癌物。赭曲霉素有　A、B、C、D　共4　種，其中毒性最大的是赭曲霉素A。單端孢霉烯族毒素中比較常見的是A　類單端孢霉烯族毒素，它主要包括T-2　毒素和HT-2　毒素。

目前，生物毒素的檢測技術已得到越來越多的重視，國內外學者對這些毒素也研究頗多。傳統(tǒng)的檢測技術以檢測致病菌為主，需要培養(yǎng)，檢測時間長。現(xiàn)代檢測技術簡便、快速、靈敏度高，且能達到微量檢測的目的。本文對這些生物毒素的檢測技術進行較為詳細的闡述并對這些方法的特點進行總結。

1、肽類毒素的檢測

肽類毒素傳統(tǒng)的檢測方法主要有：酶聯(lián)免疫檢測技術、聚合酶鏈反應技術和生物傳感技術等。近年來產(chǎn)生了一些新興檢測技術，如：懸浮芯片技術等。

1.1　酶聯(lián)免疫檢測技術

酶聯(lián)免疫檢測技術是利用酶標記物同抗原抗體復合物的免疫反應與酶的催化放大作用相結合，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原或抗體反應和酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。所生成的顏色深淺與待測標本含量成比例，由此進行定性或定量分析。酶聯(lián)免疫檢測技術是一種敏感、快速、簡單的方法，應用較廣，但是利用酶聯(lián)免疫檢測技術檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素時，會因為假陽性或假陰性影響檢測結果。

1.2　聚合酶鏈反應技術

聚合酶鏈反應技術是一種在體外模擬DNA　復制過程，對特定的DNA或DN段進行快速擴增的方法。聚合酶鏈反應技術具有靈敏度高、檢測時間短等優(yōu)點。目前常用的聚合酶鏈反應種類有定性聚合酶鏈反應和熒光定量聚合酶鏈反應。熒光定量聚合酶鏈反應是把熒光基團加入普通聚合酶鏈反應技術反應體系中，利用熒光信號積累檢測整個聚合酶鏈反應反應的進程，通過標準曲線對未知物進行定量。熒光定量聚合酶鏈反應比常規(guī)聚合酶鏈反應技術自動化程度更高、特異性更強，其應用也更廣泛。根據(jù)報道已有包括葡萄球菌各型腸毒素，大腸桿菌毒素等30多種毒素可以應用聚合酶鏈反應來檢驗。

1.3　生物傳感技術

生物傳感技術是以酶的催化或者抗原抗體結合等特異反應，通過換能器將反應結果輸出為可檢測的信號通過信號分析定性或定量待測物質。生物傳感器檢測法具有分析速度快、檢樣微量、生物功能膜可反復多次使用等特點，可用于許多物質的檢測。

1.4　懸浮芯片技術

懸浮芯片技術具有操作簡便、重復性好、靈敏度高以及線性范圍寬等優(yōu)點。國外已經(jīng)有利用懸浮芯片技術檢測的報道。國內孫肖紅等利用懸浮芯片系統(tǒng)建立檢測模型，檢測不同濃度金黃色葡萄球菌腸毒素B，其線性范圍為0.2～1653.4ng/mL，最低檢測值為203pg/mL均優(yōu)于酶聯(lián)免疫檢測技術（最低檢測質量濃度為60ng/mL），除與2.μg/mL金黃色葡萄球菌熱休克毒素有交叉反應外，和其他幾種細菌、毒素、蛋白均無交叉反應。實驗證明懸浮芯片定量檢測方法對于模擬添加的金黃色葡萄球菌腸毒素B　具有良好的檢測效果。這比國外報道的熒光免疫層析法、磁免疫層析法、芯片傳感器等方法的靈敏度都要高，與生物傳感器-　質譜聯(lián)用技術、毛細管芯片技術等在同一數(shù)量級。綜合國內外對懸浮芯片的研究來看，該技術應用前景十分廣闊，但是懸浮芯片能否從粉末樣品中直接檢測毒素和病原，尚缺乏模型和評價。

2、脂多糖內毒素的檢測

1968年，國外研究人員Levin等建立了利用鱟實驗檢測脂多糖內毒素的方法。近幾十年來，脂多糖內毒素的檢測方法已有很大進展，實驗簡便、經(jīng)濟、準確性高，但是由于費時、響應慢、自動化程度低等原因已限制了其應用。近十年來出現(xiàn)了利用生物傳感技術和氣相色譜-質譜聯(lián)用儀檢測細菌內毒素的報道。國外研究人員Goh等用增強型綠色熒光蛋白固定在傳感器上制成了熒光內毒素生物傳感器，根據(jù)脂多糖內毒素與之結合時熒光強度的衰減檢測細菌內毒素的含量。此熒光生物傳感器存在非分析物產(chǎn)生的熒光干擾問題，是近年來發(fā)展較快的一類光學生物傳感器。國內岳麗娜等利用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀聯(lián)用技術，對脂多糖內毒素標準品所含的3-羥基脂肪酸種類進行檢測，用于分析脂多糖內毒素標準品菌種來源的純度。結果表明脂多糖內毒素工作標準品中含有非腸道細菌，因此會出現(xiàn)誤差，對檢測結果產(chǎn)生影響。氣相色譜-質譜聯(lián)用儀聯(lián)用法檢測脂多糖內毒素，不受其標準品及細菌的生物活性的限制，可用于細菌內毒素標準品菌株來源的輔助監(jiān)控及應用中的異常情況的研究分析。

此外，檢測脂多糖內毒素也有酶聯(lián)免疫檢測技術、流式細胞術、化學發(fā)光測定法等方法，這些方法特異性、準確性高，但需要專業(yè)人員操作，步驟多，必須在實驗室完成，其應用需要大量實際操作驗證。

3、霉菌毒素的檢測

檢測霉菌霉素的常規(guī)方法由經(jīng)典的薄層色譜法發(fā)展到高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫檢測技術、免疫親和層析法等?，F(xiàn)在，質譜分析已被引入毒素分析中并衍生出各種質譜方法，如高效液相色譜法-常壓化學電離質譜測定法、液質連用法、電噴霧-質譜法、液相串聯(lián)質譜法、超高壓液相聯(lián)合三重四極桿質譜儀法，及同時測定上百種樣品的高效液相色譜法-串聯(lián)質譜-電噴霧陽離子等技術。隨著這些新方法、新手段的發(fā)展，為霉菌毒素的檢測提供了比較廣的選擇，適應了不同的檢測目的和要求。

3.1　薄層色譜法

薄層色譜法是測定食品中霉菌毒素的經(jīng)典方法，該方法操作簡便、費用低、能同時定性定量霉菌毒素。其檢測過程是：提取、柱層析、洗脫、濃縮、薄層分離。由于此方法操作繁瑣、靈敏度低，現(xiàn)在的研究重點是改進樣品的提取和凈化方法，因此建立了薄層掃描法來測定霉菌毒素，進而提高薄層色譜法的精度。國內張寰等報道了利用薄層掃描法，在掃描儀上繪制黃曲霉毒素掃描圖譜，并由此分辨出黃曲霉素種類，然后定量分析，從而得到樣品的黃曲霉毒素含量。鑒于此方法的靈敏度低、安全性差等缺點，已越來越不適用現(xiàn)代分析的要求。

3.2　高效液相色譜法

高效液相色譜法具有高效、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測限低、定量準確的特點，是定性定量霉菌毒素的常用方法，其中應用最廣的是反相高效液相色譜法。國外研究人員Sobolev等利用高效液相色譜法，以新研發(fā)的氧化物質Al2O3作為流動相，對農產(chǎn)品的甲醇　―　水提取液進行凈化處理，樣品中加標品2.5～7.5ng/g，結果表明：AFBl、AFB2、AFGl、AFG2　的回收率為　80%～87%，最低檢測限為1.0ng/g，此方法與商業(yè)檢測黃曲霉素方法相比，凈化設備費用更低。國外研究人員Razzazi-Fazeli等利用高效液相色譜法-質譜聯(lián)用儀檢測單端孢霉烯族毒素，檢測限為　5　0～8　5　n　g　/　g，回收率為77%～101%。鑒于高效液相色譜法的這些優(yōu)點，其在霉菌毒素檢測中的應用越來越多，但是由于樣品前處理較復雜，設備昂貴，操作時需專門人員等問題，難以滿足快速檢測的目的，限制了其應用。

3.3　酶聯(lián)免疫檢測技術

酶聯(lián)免疫檢測技術法靈敏度高、特異性強、操作簡便，適宜大量樣品的快速篩選，且設備費用比高效液相色譜法低，因此廣泛用于霉菌毒素的檢測。利用此方法檢測霉菌毒素可以達到定性定量的目的。此外，根據(jù)酶聯(lián)免疫檢測技術開發(fā)的毒素試劑盒實現(xiàn)了快速檢測霉菌毒素的目的。國外Saha等利用基于酶聯(lián)免疫檢測的流動裝置檢測紅辣椒中黃曲霉素B1與赭曲霉毒素A，檢測限分別為2ng/g　和10ng/g，結果證明此方法準確性高，與單獨酶聯(lián)免疫檢測相關性良好，并且為歐盟的法定標準提供了簡單、快速、有效的檢測方法。酶聯(lián)免疫檢測測定結果易出現(xiàn)假陽性問題，且只能測定單一毒素。目前的一項研究是將酶聯(lián)免疫檢測技術和膠體金技術與噬菌體展示技術相結合，此方法可以顯著提高檢測限，縮短檢測時間，同時可以減少毒素測定中所使用的毒素標準品對實驗人員及環(huán)境的危害，這種結合技術應用前景廣闊[　31]。

3.4　免疫親和柱法

免疫親和柱是以單克隆免疫親和柱為分離手段，根據(jù)單克隆抗體與載體蛋白偶聯(lián)后將其填柱形成免疫親和柱，并與霉菌毒素抗原產(chǎn)生一一對應的特異性吸附關系。免疫親和柱法包括免疫親和柱-熒光光度法和免疫親和柱-高效液相色譜法。裴道國等采用改良型免疫親和柱凈化-　熒光光度檢測技術檢測花生及花生制品中的黃曲霉毒素。結果表明：改良后的方法具有更好的準確性和精密度，檢測技術操作更簡便，檢測時間由傳統(tǒng)的25min縮短至10min，大大提高了檢測效率。免疫親和柱-高效液相色譜法用于檢測霉菌毒素在國內外的報道中也比較多。陳新等利用免疫親和柱-高效液相色譜法分別定量地檢測飼料中的黃曲霉毒素B1、B2、G1　和G2，在黃曲霉毒素B1為0～50μg/kg　測定范圍內其線性相關系數(shù)為0.91，檢測靈敏度為1μg/kg，可以作為測定飼料及飼料原料中的黃曲霉毒素B1的定量確認法。國外研究人員Aksenov等利用免疫親和柱-熒光-高效液相色譜法檢測了赭曲霉素，將檢測限提高至0.5mg/kg，優(yōu)化了其檢測方法。免疫親和柱法簡便快速、靈敏度極高，一個樣品只需10～15min，比傳統(tǒng)方法快。特別是免疫親和柱-高效液相色譜法可以特效性地將霉菌毒素或其他真菌毒素分離出來，分離效率和回收率高，比高效液相色譜法更有優(yōu)勢和應用前景。

4、結論

生物毒素的檢測方法多種多樣，但其靈敏度、精度、適用條件各不相同。近幾年來，檢測肽類毒素切實可用的檢測方法主要是熒光定量聚合酶鏈反應技術和酶聯(lián)免疫檢測技術，生物傳感器技術因其分析速度快、檢樣微量等特點，可用于許多物質的檢測，但在國內的使用情況來看，由于成本高而不能被廣泛采用。懸浮芯片技術由于操作簡便、靈敏度高以及線性范圍寬等優(yōu)點，未來的應用前景將十分廣闊。利用氣色譜法-質譜聯(lián)用儀檢測脂多糖內毒素的技術相對比較成熟，而免疫學方法在我國還處于理論階段，未來還需要大量的實踐驗證及優(yōu)化。檢測霉菌毒素較常用的檢測方法是酶聯(lián)免疫檢測技術法和免疫親和柱法。酶聯(lián)免疫檢測技術法法操作簡便，成本比較低，適合大量樣品的快速篩選，且設備費用較低，因此在我國已廣泛應用。免疫親和柱法快速簡便、靈敏度極高，分離效率和回收率高。另外，國外一些新技術的發(fā)現(xiàn)和使用，在我國是值得引進且具有推廣價值的。

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篇4

摘 要：隨著國民經(jīng)濟的不斷發(fā)展，各行業(yè)排放的工業(yè)廢水的量也與日俱增。其中，對水環(huán)境污染尤為嚴重當屬造紙工業(yè)了。統(tǒng)計顯示，我國現(xiàn)有的10000多家大中小型的造紙企業(yè)，就能到達40多億t的年廢水量，是全國廢水排放總量的十分之一。廢水對生態(tài)環(huán)境造成了一定的影響。該文綜合闡述了目前造紙廢水生物治理中好氧技術、厭氧-好氧組合處理技術以及厭氧技術的應用和進展；對國內外生物處理造紙廢水技術的研究進展進行了總結和分析，包括應用白腐真菌降解造紙廢水、生物酶技術和生物固定化技術。

關鍵詞：造紙廢水 好氧 厭氧 白腐真菌 生物酶 生物固定化

中圖分類號：X793 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2015）04（a）-0000-00

隨著國民經(jīng)濟的不斷發(fā)展，各行業(yè)工業(yè)廢水的排放量也在逐漸增加。其中，造紙工業(yè)排放的廢水對水環(huán)境造成了嚴重的污染。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國10000多家的大中小型造紙企業(yè)，每年就會排出40多億t的污水，占到了全國廢水排放總量的十分之一[1]。2010年，造紙廢水CODCr排放95.2萬t約占輕工行業(yè)CODCr排放總量47%[2]，對生態(tài)環(huán)境造成難以想象的破壞后果。對此，對新型的有效治理造紙廢水污染的方法以及途徑進行探索和研究，是非常具有研究意義和現(xiàn)實意義的。

1 造紙廢水的來源和特點

其生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)都會產(chǎn)生廢水，但主要來自于中段水、紙機白水以及蒸煮液[3]。提取黑液后漿料在洗滌、篩選、漂白的過程中排出來的廢水，就是中段水，這種廢水成分復雜，且富含對環(huán)境危害較大的有機氯化物。紙機白水中主要有細小纖維、填料和膠料（松香等）。酸法制漿的紅液或堿法制漿的黑液叫蒸煮液，在整個造紙工業(yè)污染中占90%。堿法制漿是我國造紙業(yè)普遍采用的，其主要成分是纖維素、木質素、半纖維素、單糖、有機酸和碳水化合物的降解產(chǎn)物等。

2.造紙廢水生物處理技術

化學方法、物理方法、生物法、物化方法等，是目前國內外造紙污水處理的主要方法。近幾年，得到人們重視的膜分離、超臨界分離、磁分離、超聲波分離等物化處理法因比較昂貴，處理效率不高，應用比較有限。而操作方便、運行費用相對較低、沒有二次污染等優(yōu)點的生物處理法，則越來越受重視。

2.1好氧處理技術

指借助于好氧或兼性厭氧微生物在有溶解氧的情況下來分解、吸收有機物，使之被氧化成簡單的無機物，污水得到凈化。當前，活性污泥法和生物膜法等好氧生物法是國內外用來處理造紙廢水的方法。

處理效果較好且成本低的活性污泥法既能去除部分色度，還能分解大量有機物質，易于管理是我國最常用的好氧處理方法。崔延瑞等[4]采用序批式活性污泥法處理堿法草漿造紙廢水，COD的去除率高達80%。張述林[5]等采用混凝與低氧―好氧兩段活性污泥法來處理某造紙廠COD為6230mg/L的綜合廢水，可達93.8%的COD去除率。

生物膜法是指微生物附著在介質表面上形成生物膜，且在不斷繁殖生長的同時，還能對污水中的有機污染物進行降解吸收，將其轉化為穩(wěn)定的無機物和原生質，從而達到凈化污水的作用。此方法剩余污泥量少且不會產(chǎn)生污泥膨脹，占地少，運行管理方便。Chandler等[6]通過塑料填料，利用兩級生物膜反應器中試處理造紙廠廢水。結果顯示，水力有3h的停留時間，可減少93%的BOD5，出水BOD5達到7.83mg/L的平均濃度。張苗等[7]采用混凝沉淀協(xié)同好氧生物膜技術深度處理造紙廢水，結果顯示，效果最為顯著的就是以FeCl3為混凝劑的協(xié)同好氧生物膜技術，最高可達69.30%的色度去除率，比單獨的混凝沉淀高了3.72 %的去除率。

2.2厭氧處理技術

在專性與兼性厭氧菌的條件下，通過發(fā)酵和分解對有機物進行降解的處理技術稱為厭氧處理技術。與好氧處理技術相比，其污泥產(chǎn)量小、節(jié)省動力能耗、對營養(yǎng)物質需求不高，且能更好地降解某些難降解有機物。殷承啟等[8]采用上流式厭氧污泥床（ UASB）處理二次纖維造紙廢水。UASB 穩(wěn)定運行時對COD的去除率可達90%以上，總硬度在50%以上以及硫酸根離子80% 以上。劉峰等[9]研究了預酸析―多孔高分子載體固定化微生物厭氧流化床（AFB）處理堿法草漿黑液的效能，結果證明，AFB對黑液進行直接處理時，發(fā)揮了其活性生物量濃度大、傳質能力強的特點，可有效地去除COD，色度亦有所下降。采用酸析預處理利用AFB的厭氧消化功能，可去除黑液中大部分難生化降解的高分子物質。

2.3 厭氧-好氧處理技術

造紙廢水因難降解有機物成分多、污染物濃度高、廢水流量和負荷波動大、有較差的可生化性能等，用好氧處理效果不好且能耗大。因此，利用厭氧-好氧組合處理工藝進行處理。首先，能使厭氧處理技術的優(yōu)勢充分發(fā)揮，水解、酸化廢水中生化性很差的高分子物質，成為易于進行好氧處理的較小分子或分子結構。同時，也可對回流到厭氧池的好氧階段污泥進行較為徹底的厭氧消化，減少整個系統(tǒng)的污泥排放。該工藝結合了厭氧與好氧處理技術的優(yōu)點，具有占地面積少、處理效果好、能耗低、節(jié)省藥劑以及運轉、管理方便等優(yōu)點。

丁志芬[10]對某造紙廠應用厭氧-好氧組合技術處理廢水的情況進行了介紹，且和好氧工藝作了比較。結果證明，厭氧-氧工藝運行電費可降低50%，且運行穩(wěn)定，其COD有機物85%都轉化為甲烷氣體了，剩余污泥量也減少了60%以上。李巡案等[11]分析了萬隆造紙廠廢水處理工程改建為厭氧-好氧工藝以及實行清潔生產(chǎn)后，污染物質排放總量明顯減少，水質可達到GB18918- 2002一級A標準，與原有的好氧生物處理工藝相比可節(jié)省動力約55%。

3 生物處理造紙廢水技術的研究進展

3.1 應用白腐真菌對造紙廢水進行降解

造紙工業(yè)排放黑液COD和色度形成主要是因為木質素，其異質多晶三維多聚體結構是由甲氧基取代的對-羥基肉桂酸聚合而成，分子間的醚鍵、C-C鍵很穩(wěn)定，是當前公認的微生物難降解芳香化合物之一[12]。目前，國內大部分工廠處理造紙廢水采用傳統(tǒng)生物法應用的微生物主要以細菌為主，并不能有效去除造紙廢水中的木素衍生物以及漂白過程中產(chǎn)生的氯酚類物質，這便成為造紙廢水達標排放的主要障礙。

白腐真菌是目前所發(fā)現(xiàn)的對木質素及其衍生物降解最有效的微生物。多數(shù)白腐真菌屬于擔子菌綱，少數(shù)為子囊菌綱。其中，黃飽原毛平革菌（Phanerochaete Chrysosporium）是已被廣泛研究的典型白腐真菌。

3.1.1 白腐真菌的降解機制及優(yōu)勢

白腐菌降解木質素通常分兩步進行[13]：第一，菌體利用菌絲吸附木質素；第二，白腐菌分泌出的酶催化氧化木質素等污染物，主要分為細胞內和細胞外兩過程，整個降解系統(tǒng)在主要營養(yǎng)物質（ 碳、氮、硫） 限制條件下才得以啟動形成[14～16]。錳過氧化物酶（ Mnp）、漆酶（La）、木質素過氧化物酶（ Lip） 均合成于細胞內，通過分泌到細胞外對污染物進行降解。前兩者均須以H2O2為底物，漆酶以氧氣作電子受體催化形成醌及自由基。故降解污染物時，白腐菌需借助H2O2激活，由酶觸發(fā)啟動自由基鏈反應，產(chǎn)生具有超常的氧化能力的細胞外?OH，對芳香化合物有很好的降解作用。

故白腐菌在降解污染物上所有具有的優(yōu)點是其他生物系統(tǒng)尤其是細菌沒有的[14]：（1）特定污染物不需要預條件化：處理系統(tǒng)以細菌為主的，誘導合成所需的降解酶須預先置于一定有效濃度的污染物。白腐真菌降解酶的誘導與降解底物的有無多少無關。（2）動力學優(yōu)勢：細菌對化學物的降解多為酶促轉化，遵循米氏動力學。初始氧化反應的酶經(jīng)白腐真菌催化啟動對底物沒有真正意義上的Km值，對氧化產(chǎn)物的形成有利。（3）產(chǎn)生氧化能力極強的?OH （4）有毒污染物不必進入細胞內代謝而在其細胞外即可有效降解。可忍受高濃度有毒污染物的同時，避免有毒污染物對細胞的毒害。（5）非專一性降解的特性：能降解大量結構不同的化學物質。（6）對營養(yǎng)物的要求低。

3.1.2 白腐菌在造紙廢水中的應用

從上述可知白腐真菌在治理造紙廢水方面有極大的研究價值。吳涓等[17]比較了幾株白腐真菌在造紙黑液廢水中的掛膜生長狀況及其對黑液廢水的處理效果。黃孢原毛平革菌、側耳菌和S22菌都可以在較強堿性的廢水中生長掛膜，且對木質素有顯著的降解作用，有很強的適應廢水的能力。李雪芝等[18]用8株不同的白腐菌對造紙廢水進行處理，選出的白腐菌L02處理效果是最好的。該菌株可直接應用于造紙廢水的處理，大幅度降低廢水CODCr含量（降低84%以上）、廢水的色度（降低93%以上）以及廢水的pH值。路忻[19]采用序列間歇式活性污泥法（SBR）法利用白腐菌共代謝理論分析及處理試驗研究含木質素的造紙廢水。結果表明，相同進水COD濃度和水力停留時間，與單純好氧生物處理相比，共代謝作用下好氧處理的COD去除率要高得多，有約30%的提高率。

3.2 生物酶技術

白腐菌降解木質素，是通過其分泌的酶的作用來實現(xiàn)。相較于錳過氧化物酶、木質素過氧化酶，在白腐菌木質素降解酶系統(tǒng)中，漆酶的實際應用價值更大一些。首先，木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶產(chǎn)生的條件是限碳和氮的。而漆酶可在碳和/或氮存在條件下由菌體分泌[20]。其次，木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶只在系統(tǒng)存在H2O2時，才可降解有機污染物，這在現(xiàn)實情況下很難實現(xiàn)的。最后，重要的還在于漆酶具有780 mV氧化還原電位，在不存在H2O2和其它次級代謝產(chǎn)物時，有機污染物的氧化也能夠被催化。所以，在環(huán)境保護和生物技術方面，漆酶的應用潛力是非常巨大的。

據(jù)林鹿等人[21]研究通過漆酶進行去除桉木硫酸鹽漿CEH漂白廢水時發(fā)現(xiàn)，它可以把廢水中有毒物質去除掉40%以上。造紙廢液中有機氯化物用漆酶處理，具有高效能的催化作用，反應條件溫和，對反應設備和反應條件要求也不高。謝益民等[22]采用雜色云芝發(fā)酵產(chǎn)生的漆酶液深度處理造紙廠二沉池出水，結果表明，經(jīng)催化氧化作用，漆酶及其介體體系可氧化聚合廢水中的大部分殘余木素。在最佳實驗處理條件下，木素、CODCr和色度的去除率分別達到82. 0%、76. 9% 和84. 9%。同時，紙漿生物漂白上的研究熱點也包括漆酶。通過酶法漂白紙漿，脫氯效果更好[23]，相對于傳統(tǒng)的氯氣漂白法所產(chǎn)生的有毒的氯酚類化合物而言，其避免了對環(huán)境的污染。

3.3 生物固定化技術

微生物固定化技術是通過化學或物理的方法，把游離酶或細胞限定在一定的空間區(qū)域內，使其能反復利用且保持活性，利于除去高濃度有機物或某些難降解物質。Messner等[24]利用生物滴濾器原理而開發(fā)的MYCOPOR反應器，在多孔的載體填料上把白腐菌固定好，廢水由從頂部到載體的這個過程就能夠得到凈化了。處理6～12h，87%、80%和40%的色度、AOX和COD可去除。李朝霞等[25]采用一種新型海藻酸鈉/殼聚糖/活性炭生物微膠囊固定化白腐菌和懸浮態(tài)白腐菌，在不同接種量下降解造紙廢水。結果顯示，白腐菌在不同的兩種狀態(tài)下均能對造紙廢水進行降解，不過在代謝穩(wěn)定性和降解木質素能力等方面，固定化白腐菌比懸浮態(tài)白腐菌明顯要強。劉帥等[26] 用固定漆酶和游離漆酶對造紙廢水進行深度處理。通過對廢水處理的效果對比，固定漆酶的優(yōu)點在于達到最佳效果的反應時間短， 酶的穩(wěn)定性高， 溫度耐受性強，pH適應性顯著增強。

4 結語

作為一種處理難、成分復雜的工業(yè)廢水，通過傳統(tǒng)的處理技術造紙廢水已很難滿足如今的排放要求。因此，要實現(xiàn)極大減少造紙廢水的排放或者實現(xiàn)零排放，需大力發(fā)展微生物處理技術。使微生物與處理技術相結合，為造紙業(yè)的綠色發(fā)展鋪平道路。

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篇5

關鍵詞：生物質；燃料；液化；進展；

中圖分類號：TK6 文獻標識碼：A 文章編號：1674-3520（2015）-01-00-02

液體燃料的不足已嚴重威脅到我國的能源與經(jīng)濟安全。我國一次能源消費量僅次于美國成為世界第二大能源消費國， 2006年進口原油已達5000萬t，占總量40%。因此，國家提出了大力開發(fā)新能源和可再生能源，優(yōu)化能源結構的戰(zhàn)略發(fā)展規(guī)劃[1-2]。生物質燃料是惟一可以轉化為液體燃料的可再生能源，將生物質轉化為液體燃料不僅能夠彌補化石燃料的不足，而且有助于保護生態(tài)環(huán)境。生物質燃料包括各種農業(yè)廢棄物、林業(yè)廢棄物以及各種有機垃圾等。我國生物質資源豐富，理論年產(chǎn)量為50億t左右，發(fā)展生物質液化替代化石燃料有巨大的資源潛力。

目前生物質液化還處于研究、開發(fā)及示范階段。從工藝上，生物質液化又可分為生化法和熱化學法。生化法主要是指采用水解、發(fā)酵等手段將生物質轉化為燃料乙醇。熱化學法主要包括快速熱解液化和加壓催化液化等[3-8] 。本文主要介紹生物質燃料液化制取液體燃料的技術與研究進展。

一、生化法生產(chǎn)燃料乙醇

生物質生產(chǎn)燃料乙醇的原料主要有能源農作物、剩余糧食和農作物秸稈等。美國和巴西分別用本國生產(chǎn)的玉米和甘蔗大量生產(chǎn)乙醇作為車用燃料。從1975年以來，巴西為擺脫對石油的依賴，開展了世界最大規(guī)模的燃料乙醇開發(fā)計劃，到1991年燃料乙醇產(chǎn)量已達130億L。美國自1991年以來，為維持每年50億L的玉米制乙醇產(chǎn)量，政府每年要付出7億美元的巨額補貼[2，3，8]。利用糧食等淀粉質原料生產(chǎn)乙醇是工藝很成熟的傳統(tǒng)技術。用糧食生產(chǎn)燃料乙醇雖然成本高，價格上對石油燃料沒有競爭力。雖然我國政府于2002年制定了以陳化糧生產(chǎn)燃料乙醇的政策，將燃料乙醇按一定比例加到汽油中作為汽車燃料，已在河南和吉林兩省示范。然而我國剩余糧食即使按大豐收時的3000萬t全部轉化為乙醇來算，可生產(chǎn)1000萬t乙醇，也只有2000年原油缺口的1/10；而且隨著中國人口的持續(xù)增長，糧食很難出現(xiàn)大量剩余。2007年以來，糧食價格高漲，給國家的安定帶來威脅，因此，在我國非糧生物質燃料才是唯一可靠的生物質能源。

從原料供給及社會經(jīng)濟環(huán)境效益來看，用含纖維素較高的農林廢棄物生產(chǎn)乙醇是比較理想的工藝路線。生物質制燃料乙醇即把木質纖維素水解制取葡萄糖，然后將葡萄糖發(fā)酵生成燃料乙醇的技術。我國在這方面開展了許多研究工作，比如武漢理工大學開展了農林廢棄物真菌分解-堿溶熱解-厭氧發(fā)酵工藝的研究，轉化率在70%以上[9]。中國科學院過程工程研究所在國家攻關項目的支持下，開展了纖維素生物酶分解固態(tài)發(fā)酵糖化乙醇的研究，為纖維素乙醇技術的開發(fā)奠定了基礎[10]。以美國國家可再生能源實驗室（NREL）為代表的研究者，近年來也進行了大量的研究工作，如通過轉基因技術得到了能發(fā)酵五碳糖的酵母菌種，開發(fā)了同時糖化發(fā)酵工藝，并建成了幾個具有一定規(guī)模的中試工廠，但由于關鍵技術未有突破，生產(chǎn)成本一直居高不下[11-13]。纖維素制乙醇技術如果能夠取得技術突破，在未來幾十年將有很好的發(fā)展前景。

二、生物質燃料熱化學法生產(chǎn)生物質油

生物質燃料熱化學法生產(chǎn)生物質油技術根據(jù)其原理主要可分為加壓液化和快速熱解液化。

（一）生物質燃料快速熱解液化

生物質燃料快速熱解液化是在傳統(tǒng)裂解基礎上發(fā)展起來的一種技術，相對與傳統(tǒng)裂解，它采用超高加熱速率（102-104K/s），超短產(chǎn)物停留時間（0.2-3s）及適中的裂解溫度，使生物質中的有機高聚物分子在隔絕空氣的條件下迅速斷裂為短鏈分子，使焦炭和產(chǎn)物氣降到最低限度，從而最大限度獲得液體產(chǎn)品。這種液體產(chǎn)品被稱為生物質油（bio-oil），為棕黑色黏性液體，熱值達20-22MJ/kg，可直接作為燃料使用，也可經(jīng)精制成為化石燃料的替代物。因此，隨著化石燃料資源的逐漸減少，生物質快速熱解液化的研究在國際上引起了廣泛的興趣。自1980年以來，生物質快速熱解技術取得了很大進展，成為最有開發(fā)潛力的生物質液化技術之一。國際能源署組織了美國、加拿大、芬蘭、意大利、瑞典、英國等國的10多個研究小組進行了10余年的研究與開發(fā)工作，重點對該過程的發(fā)展?jié)摿Α⒓夹g經(jīng)濟可行性以及參與國之間的技術交流進行了調研，認為生物質快速熱解技術比其他技術可獲得更多的能源和更大的效益[14]。

世界各國通過反應器的設計、制造及工藝條件的控制，開發(fā)了各種類型的快速熱解工藝。幾種有代表性的工藝、各裝置的規(guī)模、液體產(chǎn)率等參數(shù)見文獻 [14]。

（1）旋轉錐式反應工藝（Twente rotating cone process），荷蘭Twente大學開發(fā)。生物質顆粒與惰性熱載體一起加入旋轉錐底部，沿著錐壁螺旋上升過程中發(fā)生快速熱解反應，但其最大的缺點是生產(chǎn)規(guī)模小，能耗較高。以德國松木粉為原料，反應溫度600℃，進料速率34.8kg/h的條件下，液體產(chǎn)率為58.6%。

（2）攜帶床反應器（Entrained flow reactor），美國Georgia 工學院（GIT）開發(fā)。以丙烷和空氣按照化學計量比引入反應管下部的燃燒區(qū)，高溫燃燒氣將生物質快速加熱分解，當進料量為15kg/h，反應溫度745℃時，可得到58%的液體產(chǎn)物，但需要大量高溫燃燒氣并產(chǎn)生大量低熱值的不凝氣是該裝置的缺點。

（3）循環(huán)流化床工藝（Circulating fluid bed reactor），加拿大Ensyn工程師協(xié)會開發(fā)研制。在意大利的Bastardo建成了650kg/h規(guī)模的示范裝置，在反應溫度550℃時，以楊木粉作為原料可產(chǎn)生65%的液體產(chǎn)品。該裝置的優(yōu)點是設備小巧，氣相停留時間短，防止熱解蒸汽的二次裂解，從而獲得較高的液體產(chǎn)率。但其主要缺點是需要載氣對設備內的熱載體及生物質進行流化，最高液體產(chǎn)率可達75%。

（4）渦旋反應器（Vortex reactor），美國國家可再生能源實驗室（NREL）開發(fā)。反應管長0.7m，管徑0.13 m，生物質顆粒由氮氣加速到1 200m/s，由切線進入反應管，在管壁產(chǎn)生一層生物油并被迅速蒸發(fā)。目前建成的最大規(guī)模的裝置為20kg/h，在管壁溫度625℃時，液體產(chǎn)率可達55%。

總之，生物質快速裂解技術具有很高的加熱和傳熱速率，且處理量可以達到較高的規(guī)模，目前來看，該工藝取得的液體產(chǎn)率最高。熱等離子體快速熱解液化是最近出現(xiàn)的生物質液化新方法，它采用熱等離子體加熱生物質顆粒，使其快速升溫，然后迅速分離、冷凝，得到液體產(chǎn)物，我國的開展了這方面的試驗研究。

（二）加壓液化

生物質加壓液化是在較高壓力下的熱轉化過程，溫度一般低于快速熱解。最著名是PERC法。該法始于20世紀60年代，當時美國的Appell等人將木片、木屑放入Na2CO3溶液中，用CO加壓至28MPa，使原料在350℃下反應，結果得到40%-50%的液體產(chǎn)物。近年來，人們不斷嘗試采用H2加壓，使用溶劑及催化劑（如Co-Mo、Ni-Mo系加氫催化劑）等手段，使液體產(chǎn)率大幅度提高，甚至可以達80%以上，液體產(chǎn)物的高位熱值可達25-30MJ/kg，明顯高于快速熱解液化。超臨界液化是利用超臨界流體良好的滲透能力、溶解能力和傳遞特性而進行的生物質液化，最近歐美等國正積極開展這方面的研究工作[15-17]。和快速熱解液化相比，目前加壓液化還處在實驗室階段，但由于其反應條件相對溫和，對設備要求不很苛刻，在規(guī)?；_發(fā)上有很大潛力。

生物質燃料轉化為液體后，能量密度大大提高，可直接作為燃料用于內燃機，熱效率是直接燃燒的4倍以上。但是，由于生物油含氧量高（約35wt%），精煉成本較高，因而降低了生物質裂解油與化石燃料的競爭力。這也是長期以來沒有很好解決的技術難題。

三、結論與建議

隨著化石燃料資源的逐漸減少，生物質燃料液化技術的研究在國際上引起了廣泛的興趣。經(jīng)過近30年的研究與開發(fā)，車用燃料乙醇的生產(chǎn)已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，快速熱解液化已達到工業(yè)示范階段，加壓液化還處于實驗研究階段。我國生物質資源豐富，每年可利用的資源量達50億t，僅農作物秸稈就有7億t，但目前大部分作為廢棄物沒有合理利用，造成資源浪費和環(huán)境污染。如果將其中的50%采用生物質液化技術轉化為燃料乙醇和生物質油，可以得到5億-10億t油當量的液體燃料，基本能夠滿足我國的能源需求。因此，發(fā)展生物質液化在我國有著廣闊的前景。

我國在生物質快速熱解液化及加壓液化方面的研究工作還很少，與國際先進水平有較大差距，需要加強此項研究。開發(fā)生物質油精制與品位提升新工藝，降低生產(chǎn)成本是生物質熱化學法液化進一步發(fā)展，提高與化石燃料競爭力的關鍵。

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篇6

關鍵詞：生物發(fā)酵；在線檢測技術；控制技術；進展

生物發(fā)酵技術和我們的日常生活緊密相關，生活中隨處可見發(fā)酵技術，如味精、啤酒、洗滌劑等。隨著生物技術的快速發(fā)展，為人類利用與改造生命活動提供了更多的新手段，為解決資源與安全、糧食安全、能源安全等問題提供了新的選擇。近年來，生化工業(yè)進入蓬勃發(fā)展時期，這使得藥物生產(chǎn)、污水處理、酶制劑等行業(yè)也取得了較快發(fā)展，進而又對發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生影響，如生化工程在線檢測、監(jiān)督檢測、自動化控制等問題，是當前發(fā)酵工程必須面臨的問題。以下主要對生物發(fā)酵過程的相關事項進行分析。

1 生物發(fā)酵工程概述

生物發(fā)酵工程的概念較多，現(xiàn)代意義上關于生物發(fā)酵工程的理解為：在合適的pH酸堿度值、陽光照射度、培養(yǎng)基等條件上，利用微生物的一些特點，并借助一些現(xiàn)代工程技術對微生物進行生產(chǎn)，從而培育出一些能夠滿足人類進行生產(chǎn)活動的物質，或是將微生物用于現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)的一種技術體系[1]。

現(xiàn)階段，微生物發(fā)酵工程面臨的一大問題是自動化控制問題。為了順利解決該難題，首先應對微生物的不同特點有充足的了解。在科學技術快速發(fā)展的背景下，人們了解微生物的方式已經(jīng)發(fā)生了改變，已經(jīng)由原來的借助微生物形態(tài)進行表面認識，轉變?yōu)閷碗s生物學與細胞調節(jié)等方面。然而，微生物細胞較復雜，這使得生物發(fā)酵工程也變成了一類重復性差、高度非線性、慢性變、復雜的生化過程。因此，在研究過程中，不可僅從表面對生物發(fā)酵過程進行分析，而根據(jù)檢測得到的過程參數(shù)對生化發(fā)酵過程進行詳細分析。一般來說，檢測的過程參數(shù)主要包括物理參數(shù)、生物參數(shù)與化學參數(shù)這幾類。

2 發(fā)酵過程在線檢測的重要指標

生物發(fā)酵過程的在線檢測，往往涉及一些重要指標，常見的主要包括以下這幾個重要指標：溫度，可用于判斷微生物維持生長時間，多采用PT100方法測試；空氣流量，用于排泄廢氣或供氧，采用渦街流量計測試；罐壓，用于增加DO或維持正壓，使用數(shù)顯壓力表測試；pH，用于范穎細胞的代謝途徑，使用pH電極測試；體積，用于反映操作的穩(wěn)定性，使用差壓變送器測試；溶氧，用于反映供氧情況，使用溶氧電極測試[2]。

在對發(fā)酵過程進行在線檢測時，一般是用專門的傳感器放到發(fā)酵系統(tǒng)中，然后傳遞出發(fā)酵的相關信息，為開展發(fā)酵控制工作提供有用的依據(jù)。因為微生物培養(yǎng)過程屬于一個純培養(yǎng)的過程，要求有很好的無菌環(huán)境，故要求傳感器應滿足以下幾種情況：（1）如果是插入罐內的傳感器，應具備經(jīng)受高壓蒸汽滅菌的能力；（2）具有穩(wěn)定的性能，受氣泡的影響較??；（3）結構不可有滅菌不透的死角，以免被細菌污染；（4）在測量參數(shù)方面，應具有較高的敏感性，且可轉換為電信號。

3 生物發(fā)酵過程的在線檢測與控制技術進展分析

微生物發(fā)酵過程屬于一種生化反應過程，主要是為了促進最終產(chǎn)物利用率的提升，確保微生物生長環(huán)境的舒適度。在舒適、適宜的環(huán)境中，有利于微生物進行有效的生長代謝，并能實現(xiàn)對微生物發(fā)酵過程的在線檢測與控制，從而提升微生物發(fā)酵產(chǎn)品的利用率，發(fā)揮其最大作用[3]。具體來說，主要包括以下幾個方面。

（1）電機攪拌熱、冷卻水溫度、微生物發(fā)酵熱等因素，均可能影響發(fā)酵的溫度。此外，發(fā)酵罐體積大小，也會在一定程度上影響發(fā)酵溫度的控制。如果發(fā)酵罐的體積較大，往往會采用冷卻水或發(fā)酵溫度為主回路的串級控制方式；如果是體積較小的發(fā)酵罐，多采用冷卻水流量、發(fā)酵溫度為主的簡單回路控制方式。

（2）在微生物發(fā)酵過程中，生物發(fā)酵也會受溶解氧濃度的控制情況影響。然而，現(xiàn)階段國內對該方面的研究較少，僅限于了解到哪些因素會對溶解氧濃度產(chǎn)生影響。目前，影響溶解氧濃度的因素主要有：供給的空氣量、發(fā)酵罐本身的壓力、攪拌槳的轉速及形狀。

（3）在微生物發(fā)酵過程，pH酸堿度值也是影響在線檢測與控制的一個重要因素[4]。若pH酸堿度值過高或過低，微生物的生成及代謝過程都會發(fā)生變化，故必須保證酸堿度值得合適。若發(fā)酵液的酸堿度為強酸性，可通過加氧水的方法弱化其酸性；若發(fā)酵液濃度為強堿性，可通過加糖的方式弱化其堿性，調節(jié)發(fā)酵液的酸堿度，直至合適。

（4）消泡控制也是影響生物發(fā)酵工程的一個重要因素。發(fā)酵前，微生物的生長往往較旺盛，而此時若加滿液料，并將攪拌槳馬達最大速度啟動，空氣通入量也加到最大，很容易導致發(fā)酵液上浮的現(xiàn)象，最終發(fā)生逃液現(xiàn)象。若發(fā)生該類情況，一般會采用雙位式控制方法進行處理，可取得較好的效果。

（5）在生物發(fā)酵過程中，補料控制也是影響發(fā)酵的一個重要因素。在發(fā)酵的進行狀態(tài)中，微生物生成代謝也會在半連續(xù)式發(fā)酵過程的變化情況下發(fā)生相應的改變。所以，在這過程中，應該連續(xù)不斷地為生物補充營養(yǎng)成分，保證微生物能夠按優(yōu)生物軌跡生長，才能促進微生物代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提升。

4 發(fā)酵過程中對參數(shù)進行在線檢測的意義

在生物發(fā)酵過程進行檢測與控制，最終目的是用最少的原料，獲得最大化的所需產(chǎn)物。在生物的發(fā)酵過程中，在線檢測與控制技術的水平如何，不但會對菌種的最大生產(chǎn)能力產(chǎn)生直接影響，還會對下游處理難易程度也產(chǎn)生影響，是一項承上啟下的技術。

不同于物理、化學反應，生物過程反應速度相對較慢，反應物質、產(chǎn)物濃度等的轉化率也不高。若要解決上述問題，工業(yè)微生物學通常是從兩個方面入手：（1）正確選育或改良菌種，提高發(fā)酵菌種的優(yōu)良性；（2）對培養(yǎng)條件進行合理控制，為生產(chǎn)出更好的目標產(chǎn)物創(chuàng)造條件。從某種程度上看，通過控制與優(yōu)化發(fā)酵過程，能夠將生物過程較好地控制在一種優(yōu)化的操作環(huán)境或條件下，被認為是促進生產(chǎn)力提升的有效措施或捷徑之一，具有非常重要的意義。因此，在發(fā)酵過程中，相關人員必須重視對發(fā)酵過程的線檢測與控制，力將發(fā)酵環(huán)境或操作條件控制在一個較理想的狀態(tài)下，為進一步提升生產(chǎn)水平提供強大的技術支持。

5 結束語

總而言之，生物發(fā)酵工程是一個復雜、技術要求高的反應過程，與我們日常生活息息相關。在生物發(fā)酵過程中，會受多種因素影響，進而影響到產(chǎn)品的質量及使用率，無法發(fā)揮產(chǎn)品的最大作用。因此，對在生物發(fā)酵過程中，采用在線檢測與控制技術進一步提升微生物的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量具有積極的意義。

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篇7

【關鍵詞】含油廢水；生物技術；過程；深度處理

一、生物處理技術的概況介紹與應用實例

（一）概述

生物處理技術處理含油廢水指的是利用在微生物代謝作用下，將分散到水中的原油、有機污染物進行降解處理，使有機污染物質轉化為穩(wěn)定的無害物質，最終完全無機化。近來較普遍應用且相對成熟的生物處理工藝包括好氧生物處理技術和厭氧生物處理技術兩大類。顧名思義，所謂好氧生物處理技術，是指利用好氧微生物代謝作用處理含油廢水的技術，按所選材料，分為活性污泥法、SBR法、生物膜法、氧化塘法、AB處理法等形式；而厭氧生物處理技術，則是利用厭氧微生物作用進行含油廢水處理的技術，按處理設備，分為厭氧接觸法、厭氧生物濾池、升流式厭氧污泥床（UASB）、厭氧生物轉盤等處理方法。這兩類生物處理技術在有機物負荷、污泥產(chǎn)率，能耗、營養(yǎng)物需要量、應用范圍，對水溫適應性、啟動時間以及處理效果各方面作用不同，相對來說，好氧生物技術在處理效果上較厭氧處理技術好，但兩者各有其優(yōu)缺點，單純采用一種技術難以達到理想效果。因此，結合使用兩種處理技術進行含有廢水處理變得較為普遍，遵照分級處理程序，先采用厭氧技術進行初步處理，利用好氧工藝進行處理檢驗和再處理，以確定合理的技術過程。

（二）實例

學者對含油廢水處理技術的綜合研究表明，油田污水的處理方法很多，如物理法、化學法等，這兩種方法都能夠獲得一定的處理效果，但存在較多劣勢，前者成本高，后者由于投入了化學藥劑極易產(chǎn)生二次污染。相比之下，生物處理技術的經(jīng)濟性、適用性最強，對于大規(guī)模污水處理收到較好效果。在國內許多油田得到應用，以下對應用該技術的油田及其廢水處理工藝作基本介紹：1.勝利油田王家崗廢水處理站，該站點建成投產(chǎn)于2002年，利用美國公司菌種，由油田自行設計完成占廢水總量約為70%的含油廢水處理工程。其技術處理過程為：含油廢水—接收罐—兩級大罐沉降—溶氣浮選—混合池—接觸氧化池—沉淀池—計量排放。該站經(jīng)過生物處理技術的廢水指標滿足國家廢水排放標準。2.大港油田東二廢水處理站，該站用美國公司RBC菌種，借助容積為2700m3的接觸氧化池每天處理上萬立方的廢水。其廢水處理技術過程為：兩級沉降—過濾—隔油—接觸氧化池—緩沖池—氧化塘—排放。經(jīng)處理后的廢水符合國家要求排放標準。3.冀東油田高一聯(lián)廢水處理站；該站同樣建成并投產(chǎn)于2002年，該工程采用石油大學技術每天實際處理的廢水量約3600m3，僅小于設計處理能力400m3，其廢水處理技術過程為：兩級大罐沉降—過濾—緩沖罐—泵提升—冷卻塔—均質池—厭氧池—中沉池—接觸氧化池—二沉池—緩沖池—提升—排放。對外排水質的驗收報告平均數(shù)據(jù)進行處理，表明廢水排放符合國家標準。

二、含油廢水生物處理技術方法

隨著油田開采力度加大，采油技術也在不斷發(fā)展，前后經(jīng)歷了天然能量動力、人工注水方式、改變注入水特性這三次采油變化。目前較普遍采用以人工注水方式保持地層壓力，以及通過改變注入水的特性提高采油率的后兩種采油方式。由于經(jīng)電脫水、分離出來的“油田污水”成分復雜，除含原油以外，還溶有各種有害雜質，因此，選取生物處理技術對廢水進行處理，方法有：1.曝氣生物濾池組合工藝法，該方法是在微生物氧化分解作用，填料及生物膜的吸附阻留作用和食物鏈分級捕食作用以及反硝化作用下共同完成的。相比傳統(tǒng)的活性污泥法，具有生物濃度、有機負荷高，占地面積小，過程簡單，成本投入低，抗溫性好，菌群組成合理，耐沖擊性等優(yōu)點。包括：1）膜生物反應器—曝氣生物濾池法，它能夠高效快速過濾超濾膜，同時有效降解高濃度活性污泥生物，且不借助二沉池和污泥回流系統(tǒng)，具有成本小、能耗低以及處理效果好等優(yōu)點。2）超聲氣浮—BAF法，在羥基自由基氧化、氣泡內高溫熱解和超臨界水氧化三種因素作用下，利用聲化學這一邊緣科學，在大于20Hz的超聲波條件下，提高化學反應速率，超聲波有促進有機污染物降解和提高廢水的可生化性的功能，但單獨應用時去除廢水中有毒物質的能力不高。3）A/O—BAF法，此方法模式是“隔油/氣浮/二級生化”，處理效果不甚理想。2.氧化溝，氧化溝是在20世紀中期由荷蘭開發(fā)的一種污水處理工藝，它是在傳統(tǒng)活性污泥法的基礎上進行改造生成的，污水和活性污泥的混合液可在溝渠形的曝氣池中循環(huán)流動。其技術過程簡單，處理效果良好，排放水達標。3.人工濕地，該方法處理污水最初是借助蘆葦之類的人工濕地凈化污水，去除其中大量有機和無機物。經(jīng)過發(fā)展，演變?yōu)槔没|、微生物和植物，在生態(tài)系統(tǒng)的物理、化學和生物協(xié)調作用下，通過過濾、吸附、吸收和分解等一些列過程來凈化廢水，實現(xiàn)廢水無害化處理目標。同時通過生物地球化學循環(huán)，有利于綠色植物生長。它在出水水質、營養(yǎng)物質去除能力、成本費用、技術含量、綜合管理方便等方面具有明顯優(yōu)勢。4.氧化塘，將各類微生物和藻類置于氧化塘中，發(fā)生氧化反應后，去除有機污染物，使其轉變?yōu)闊o機物。研究表明，它對油、酚類有機物、硫化物等的去除效果都較好。5.特種菌類處理，在污水生物處理中，很多細菌具有特殊功能，這些菌類經(jīng)過分離、培養(yǎng)后，對有機物處理有良好效果。

三、生物處理技術的主要問題及趨勢

目前采用高效降解菌的生物深度處理技術在含油廢水深度處理領域的研究已取得很大進展，但未來發(fā)展中仍存在以下問題，需要重視。體現(xiàn)在：1.由于含油廢水所含有機物復雜、繁多的特性，需要結合各種方法，優(yōu)化各步處理技術，再找出一套綜合工藝，滿足深度處理技術高效處理廢水的要求。2.提高含油廢水深度處理器殊菌的濃度與活性。在了解含油廢水成分組成的基礎上，分離、培養(yǎng)各篩選優(yōu)勢菌種，監(jiān)測該菌的最佳降解條件。根據(jù)反饋信息，提高凈化效率。3.基于生物工程技術的處理效果，創(chuàng)新技術。提高更有效處理含油廢水的可能性。

國外處理采油廢水的技術已經(jīng)由單一利用一種方法轉變?yōu)槎喾N方法結合使用，出現(xiàn)了物理化學方法與生物技術綜合運用，提高了廢水處理效率和達標度。而國內多利用二次、三次采油工藝處理廢水，相對較落后，不能達到理想的處理效果，為對油田中這種難降解含油廢水進行處理，生物深度處理技術成為國內油田采油廢水處理技術的發(fā)展趨勢。

參考文獻

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論文關鍵詞：固定化微生物技術,污水處理,方法分類,載體

由于固定化微生物技術可固定經(jīng)篩選出的能降解特定物質的優(yōu)勢菌屬，因此該技術的應用能使污水處理系統(tǒng)專一性、耐受性增強，處理效果穩(wěn)定，運行管理簡單，降解效率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)。因此，近年來固定化微生物技術已成為各國學者研究的熱點課題，并且已有部分研究成果由實驗室走向實際應用階段。本文就現(xiàn)有的固定化微生物技術進行了分類，介紹了各種固定化微生物技術所常用的載體在污水處理中的研究與應用，對各種固定化微生物技術的優(yōu)劣性和適用范圍進行了比較與總結，最后對該方法在污水處理中的實際應用進行了展望。

1 固定化微生物技術及分類

作者簡介：夏冰，(1985-)，男，江西南豐，青島大學在讀碩士研究生,主要研究方向為環(huán)境生物技術。E-mail:meilisanzhu@yahoo.com.cn

固定化微生物技術是從60年代開始發(fā)展起來的新型技術。固定化微生物技術是指用物理或化學方法將游離微生物細胞、動植物細胞、細胞器或酶限制或定位在某一特定空間范圍內，保留其固有的催化活性，并能被重復和連續(xù)使用技術。采用固定化微生物技術有以下優(yōu)點：有利于提高生物反應器內微生物濃度和純度，縮短反應所需的時間，降低處理設施的工程投資和造價；有利于反應器的固液分離，反應易于控制，污泥產(chǎn)生量少；有利于除氮和除去高濃度有機物或其他難降解的有毒有害物質，可免除污泥處理的二次污染等。由于其在廢水處理方面的獨特優(yōu)勢，在近十幾年獲得了迅速的發(fā)展。它已由原來的單一固定化酶、固定化微生物細胞發(fā)展到固定化動植物細胞、固定化細胞器、固定化原生質體、固定化微生物分生孢子以及酶與微生物細胞、好氧微生物與厭氧微生物的聯(lián)合固定化[1]等。

目前固定化微生物技術的方法分類多種多樣，根據(jù)微生物細胞與載體的作用力及作用形式、微生物細胞被固定的狀態(tài)以及載體的性質將固定化微生物技術分為以下五類：吸附法、包埋法、交聯(lián)法、自固定化法和介質截留法。

1.1吸附法

吸附法在固定化微生物技術處理污水中是研究最早、應用較廣泛、技術也較成熟的方法。在大多數(shù)生物膜反應器啟動的早期，所應用的都是吸附法的原理。吸附法包括物理吸附和離子吸附兩類。物理吸附是使用高度吸附能力的硅膠、活性炭等吸附劑將微生物吸附到表面使之固定化；離子吸附則是根據(jù)微生物在解離狀態(tài)下因靜電引力的作用而固著于帶有相異電荷的離子交換劑上。該方法操作簡單,微生物固定過程對細胞活性的影響小,條件溫和。但這種方法結合的細胞數(shù)量有限,反應穩(wěn)定性和重復性差,所固定的微生物數(shù)目受所用載體的種類及其表面積的限制[2]，所以需要進行改進。同時微生物與載體間的吸附強度也不夠牢固,故載體的選擇是關鍵。

1.2包埋法

包埋法是將微生物細胞截留在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網(wǎng)絡空間中,通過聚合作用,或通過離子網(wǎng)絡形成,或通過沉淀作用,或改變溶劑、溫度、pH值使細胞截留。凝膠聚合物的網(wǎng)絡可以阻止細胞的泄漏,同時能讓底物滲入和產(chǎn)物擴散出來。包埋法又可分為高分子合成包埋、離子網(wǎng)絡包埋及沉淀包埋。該法操作簡單，對微生物活性影響小，可將微生物鎖定在特定的高分子網(wǎng)絡中，因此制作的固定化微生物小球的強度高。包埋法是目前制備固定化微生物最常用、研究最廣泛的方法。

1.3交聯(lián)法

交聯(lián)法是利用兩個或兩個以上的功能基團，使微生物菌體相互連接成網(wǎng)狀結構，即使功能基團直接與微生物細胞表面的反應基團如氨基、羥基等進行互聯(lián)，形成共價鍵而達到固定化的目的。使用該方法,微生物細胞間的結合強度高,穩(wěn)定性好,經(jīng)得起溫度和pH 值等的劇烈變化。但是由于在形成共價鍵的過程中反應條件過于劇烈，往往會對微生物細胞的活性造成較大的影響，而且適用于此類固定化的交聯(lián)劑大多比較昂貴，因而其在實際應用中受到一定的限制。

1.4自固定化法

自固定化法又稱為無載體固定化法，這種方法是一種全新的概念:在自絮凝顆粒形成過程中,同時形成了微生物的適宜生態(tài)環(huán)境,使之有利于微生物代謝之間的協(xié)調或者說有利于微生物之間生物信息的傳遞[3]。這種方法與其他的固定化方法相比，具有傳質擴散阻力小，細胞顆粒整體活性高，固定化方法簡單等優(yōu)勢，將在環(huán)境工程中的污水處理領域得到廣泛的應用[4]。

1.5 介質截留法

介質截留法是通過特殊的孔網(wǎng)狀結構將酶、微生物或動植物細胞等固定截留在具有特定功能的載體內，或將酶、微生物或動植物細胞限制在一定的空間范圍內，微生物細胞不能透過此孔網(wǎng)結構，但底物和產(chǎn)物可以通過，從而實現(xiàn)廢水的生化反應和分離同時進行。介質截留法可以通過控制介質的孔徑選擇性的控制底物和產(chǎn)物的擴散，防止微生物細胞的泄露，可以使基質與微生物細胞充分接觸，從而有效的反應。所以介質截留法是一項很有發(fā)展前景的工藝。

2 載體的特點

要完成微生物的固定化，關鍵是要選擇一種合適的微生物載體。不同的固定化微生物技術方法需要不同種類的載體。雖然隨著材料學與生物學的不斷發(fā)展與結合，關于各種固定化微生物方法的最適載體有待進一步的研究與討論，但所有載體都應具備如下特點：（1）具有抗物理降解、抗化學降解、抗生物降解的穩(wěn)定性，具有一定的機械強度和結構穩(wěn)定性。在一定PH值和溫度下，不容易被破壞。（2）固定化方法簡單、易行，固定化條件盡可能溫和。（3）能夠控制固定化微生物顆粒的大小和孔隙度。（4）載體所使用的材料價廉易得，固定化成本低。（5)固定化系統(tǒng)使底物、產(chǎn)物和其他代謝產(chǎn)物能夠自由擴散。（6)載體對微生物來說是惰性的，不會損傷細胞。（7)單位體積的固定化系統(tǒng)擁有盡可能多的微生物，以便更好地起到生物催化作用。

3 固定化微生物技術的展望

各種固定化方面都有自身的優(yōu)缺點，沒有一種在所有污水處理中都適用的方法，在實際應用中要根據(jù)污水水質、水力負荷、操作條件等情況選擇合適的方法。表一列舉了各種固定化方法的比較。

表1 各種固定化方法的比較

Table 1 the comparison of immobilized microorganisms manner

 

性能        吸附法       包埋法       交聯(lián)法     自固定化法      介質截留法  

固化成本         低          低         適中       低             適中             

制備難度         易          適中       適中       易             適中             

穩(wěn)定性能         低          高         高         低             高               

結合能力         弱          適中       強         適中           高               

存活能力         高          高         低         適中           高               

活性保留         高          適中       低         高             高               

適用性能         適中        大         小         大             適中             

篇9

脊柱椎體的壓縮性骨折是骨質疏松患者最常見的并發(fā)癥，嚴重的椎體壓縮性骨折保守治療5 a內死亡率可達23％～34％，目前常用的手術治療包括椎體撐開后單純植骨固定和（或）同時進行堅強內固定材料進行固定等，手術創(chuàng)傷大，并發(fā)癥也多。經(jīng)皮椎體成形術（percutaneous vertebroplasty，PVP）與后凸成形術（percutaneous kyphoplasty，PKP）是脊柱外科近來發(fā)展迅速的一項新型微創(chuàng)外科技術，通過經(jīng)皮向壓縮骨折椎體內直接注入（PVP）或者先通過球囊擴張再注入（PKP）骨水泥等填充物，從而增強病變椎體的力學穩(wěn)定性，臨床應用證實其有穩(wěn)定可靠、迅速有效的治療效果，且并發(fā)癥少，但到目前為止長期臨床隨訪資料還不足，椎體成形術后脊柱生物力學的研究也發(fā)現(xiàn)了一些問題，椎體成形技術還需要不斷的改進和探索，特別是材料的發(fā)展對減小椎體成形術的并發(fā)癥發(fā)生率和改善術后脊柱的生物力學特性起著關鍵的作用。

1 PVP和PKP的充填材料研究進展

應用于椎體成形的充填材料主要包括注射型聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）、復合骨水泥如玻璃陶瓷強化復合骨水泥（Orthocomp）、Cortoss（Orthovia）、Hydroxyapatite composite resin（Kuraray）以及可生物降解的骨水泥如天然珊瑚骨替代物和磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）等。

11 PMMA

具有粘稠度低，容易灌注，能快速提供需要的椎體強度和剛度，價格較便宜等優(yōu)點，現(xiàn)在仍是目前臨床上椎體成形術較常用的材料，但其有一定的局限性：（1）粘滯性較低，滲漏是最常見的并發(fā)癥，向后方滲漏入椎管可壓迫脊髓，嚴重時可滲漏入血管沿靜脈回流引起肺栓塞，甚至導致患者死亡；（2）放熱反應：PMMA聚合時產(chǎn)熱可對周圍組織造成熱燒傷，有研究顯示骨水泥聚合時的溫度在椎體前部達44～113 ℃，在椎體中心達49～112 ℃，椎管內達39～57 ℃，而溫度超過50 ℃的滯留時間分別可達55、8min和25 min〔1〕；（3）缺乏骨傳導性和生物活性，無法生物降解，后期可出現(xiàn)骨水泥與骨質界面的松動；（4）PMMA注射后的椎體與臨近椎體的力學強度差異大，易導致臨近椎體的骨折;（5）有毒單體的釋放和PMMA碎屑的作用使細胞的生長、DNA的合成和糖代謝受到抑制而具有細胞毒性，其單體毒性可引起患者血壓驟降，從而引起患者猝死的可能。另外，還有致敏、局部組織抗感染能力降低、致腫瘤等不良反應。為了提高其機械性能和生物相容性，近年已有將具有生物活性的無機顆?；蚶w維增強的高分子骨粘合劑加入PMMA來提高其生物相容性的報道，但仍然不滿意，其機械強度降低較快。

12 復合骨水泥

如Orthocomp、Cortoss、Hydroxyapatite composite resin（Kuraray）等與PMMA具有相似的基本性質，但較PMMA有更合適的粘稠度、X線的不透射性、硬化快、產(chǎn)熱低、具有更好的力學性能、生物活性及骨誘導性等優(yōu)點。Cortoss是一種新型合成骨腔填充物，容易彌散進入松質骨，彈性模量與骨相近。Orthocomp是一種玻璃陶瓷增強的多種基質復合物骨水泥，雖然為不可吸收材料，但其具有親水性的表面，使骨水泥可以通過化學鍵與松質骨連結。Jasper等研究發(fā)現(xiàn)Orthocomp的強度和剛度是PMMA骨水泥的2倍左右〔2〕。Belkoff等也研究表明Orthocomp對椎體的強度和剛度都有較好的恢復。Lu等介紹了一種含鍶羥基磷灰石粉末和BisGMA（bisphenol A diglycidylether dimethacrylate）的復合骨水泥，在動物實驗模型中進行30 000和20 000次的疲勞載荷測試后，骨水泥成形椎體的剛度與對照組相比分別下降75％和56％，平均抗壓極限載荷分別為5 056 N和5 301 N〔3〕。

13 磷酸鈣類骨水泥（CPC）

CPC具有任意塑形、自行固化、生物相容、逐步降解等特性，較PMMA有更好的生物相容性、骨傳導性和粘滯度。新骨的替代方式由CPC的表面向深層逐漸推進，6個月時平均長入深度為6 mm，12個月時為114 mm。CPC可能是椎體成形術更好的注入材料，但在體內的應用及長期生物力學和生物效應還需要進一步的研究〔4、5〕。Heini和Lim等〔6、7〕研究認為CPC及改良的CPC在體內成形過程中產(chǎn)熱明顯減少，并且具有良好的彌散能力，可以明顯增強骨質疏松椎體的抗壓強度和剛度。其本身的強度低于正常椎體，但高于骨質疏松椎體，在成形術后可以減小因椎體的剛度變化而導致上下緣椎體骨折的幾率〔8〕。CPC固化后的微孔結構具有引導新骨形成能力，但無誘導成骨活性，生物活性CPC利用其固化過程溫和的特性，將骨形態(tài)生長蛋白BMP與CPC均相負荷，使材料在充填修復的同時加速CPC的降解和促進成骨作用。然而，Heini等認為CPC的生物降解也會導致相應的問題，治療骨質疏松椎體壓縮骨折時，骨水泥快速吸收會削弱椎體并導致其進一步塌陷〔9〕。

Cunin應用一種具有多孔狀結構的天然珊瑚加入骨誘導因子BMP進行研究，認為顆粒狀的天然珊瑚具有可注射性、生物相容性和骨誘導性，但其生物力學特性還需進一步研究〔7〕。最近有報道用MMA（methyl methacrylate）處理的SrHAC（strontiumcontaining hydroxyapatite cement）對椎體剛度、壓縮強度、彎曲強度和楊氏系數(shù)的恢復都具有很好的效果〔10〕。

2 PVP和PKP的生物力學研究

椎體成形術的短期療效十分令人鼓舞，也推動了PVP和PKP在臨床的發(fā)展，Garfin等報道了從1998年10月～2000年5月由多家醫(yī)院參與的臨床研究結果，共340例，603個椎體，隨訪最長18個月，超過90％的患者癥狀改善。有人對13例經(jīng)過經(jīng)皮椎體成形術的患者進行了長達5 a的隨訪觀察，結果臨床療效顯著，5 a的長期隨訪發(fā)現(xiàn)VAS（visual analogue scale）評分略升高，但仍然明顯低于術前水平，未發(fā)現(xiàn)成形椎體的進一步壓縮〔11〕。近年來對于椎體成形術后脊柱的生物力學研究顯示椎體成形術后對于脊柱整體特別是臨近椎體的影響還是顯著的。對椎體成形術后脊柱的生物力學研究對于正確應用椎體成形術十分有幫助，并對臨床應用進行正確的指導。

21 術后骨折椎體的生物力學性質

PMMA或磷酸鈣椎體成形后的生物力學研究證實骨折椎體成形后的穩(wěn)定性參數(shù)顯著提高〔12〕，可防止椎體的進一步塌陷和變形。椎體壓縮骨折后降低了運動節(jié)段的椎體壓縮強度，增加后柱的負荷而引起疼痛，通過對尸體模型的測量發(fā)現(xiàn)病變椎體后柱的壓力負荷在屈曲時增高21％、42％，后伸時增加39％~68％，椎體成形術后則使脊柱屈曲時后柱的壓力負荷減小26％，后伸時減小61％，結果示椎體骨折前和成形術后的神經(jīng)弓壓力無明顯差異，全部或部分的逆轉了后部結構的壓力負荷，從而使疼痛癥狀立即緩解〔13〕。

22 充填材料與骨折椎體生物力學的關系

基于骨水泥注入越多椎體可以得到更好強化的觀念，有些臨床醫(yī)生在病變椎體內注入最大劑量的骨水泥來提高其椎體抗壓強度，有人報道在尸體標本中可以注入椎體容積70％的骨水泥〔14〕。椎體成形后的強度越大，對上下位椎體的應力也越強，使臨近椎體的骨折發(fā)生率增高，特別是在高齡骨質嚴重疏松患者。成形術后臨近椎體有抗壓縮力下降及椎體間移位等改變，并且臨近椎體抗壓力下降的程度與成形術時注入的骨水泥量相關〔15、16〕。是否注入的骨水泥量越大，椎體的抗壓強度和剛度就越高?Molloy，S等對120個椎體（T6~L5）注入2~8 ml不等量的骨水泥，研究發(fā)現(xiàn)注入量與椎體抗壓強度和剛度的恢復只有弱相關（r2分別為021和027），抗壓強度和剛度的恢復平均只需要注入椎體容積的162％和298％〔17〕。注入的骨水泥量越大，滲漏的幾率則越高。Belkog等〔18〕人對骨質疏松女性尸體的椎體建立壓縮性骨折模型，用Orthocomp或Simplex P作為充填材料，結果僅需2 ml即可恢復椎體的壓縮強度，而椎體剛度的恢復與水泥充填容量缺乏相關關系。減小骨水泥的注入量同時可縮短注入時間，明顯降低骨水泥滲漏的危險。也有人報道椎體成形術后椎體剛度的恢復與注入的骨水泥量相關，14％容積的骨水泥就可滿足剛度恢復的要求，30％容積的骨水泥注入則可使剛度明顯增加，使臨近椎體的骨折危險增加〔19〕。

不同的充填材料對椎體生物力學性質的影響也有不同。Belkoff等人先后對Simplex P，Cranoplastic，Osteobond，Orthocomp等不同材料進行椎體成形術后的椎體生物力學研究，結果顯示Simplex P、Osteobond及Orthocomp能有效恢復椎體的剛度和壓縮強度，而Cranoplastic則僅能增加壓縮強度，不能恢復椎體的剛度，且在剛度的恢復程度上Orthocomp優(yōu)于Simplex P〔20、21〕。新型材料CPC能明顯恢復骨質疏松椎體的抗壓強度，對剛度的恢復也較好，CPC的微孔結構可以使新骨長入，使其具有更好的生物相容性。對羥基磷灰石骨水泥（HA）充填椎體后的生物力學測試表明其對壓縮強度的恢復滿意，但對剛度的恢復作用小。MMA處理的SrHAC不僅有利于界面的融合，對椎體剛度、壓縮強度、彎曲強度和楊氏系數(shù)的恢復都具有很好的效果，而且明顯優(yōu)于單純的SrHAC〔10〕。

23 PVP和PKP兩種術式的生物力學比較

Belkoff等先后兩次進行了關于后凸成形術的體外生物力學檢測，發(fā)現(xiàn)無論在有無載荷的情況下后凸成形術均能部分恢復椎體的高度，恢復椎體的強度。它在無載荷的情況下可以恢復丟失高度的97％，而椎體成形術僅能恢復30％，兩種方法都能明顯增強椎體的強度。Belkoff對16個椎體隨機分為PVP和PKP治療組，結果顯示PKP組能恢復椎體的起始剛度，而PVP則不能，PKP與PVP相比，不僅能有效恢復椎體的高度，而且能恢復椎體的壓縮強度和剛度〔22〕。但也有不同觀點，Tomita等對30個骨質疏松椎體隨機分為4組：（1）PKP+CPC；（2）PKP+PMMA；（3）PVP+CPC；（4）PVP+PMMA，術前及術后對椎體強度和剛度的分析顯示各組對椎體強度的恢復都較好，但對椎體剛度的恢復PKP組不及PVP組〔23〕。對于PVP和PKP術后的生物力學差異還有待進一步研究。

24 預防性應用椎體成形術可行性研究

水平骨小梁的丟失和骨小梁間空隙的增大降低了椎體的壓縮強度，這與骨礦物質含量和密度高度相關，椎體成形術的確切療效也僅在骨折疏松性骨折中發(fā)現(xiàn)，術后椎體的抗壓能力能夠通過注入骨水泥而顯著增強，但在正常BMD（bone mineral density）的椎體，成形術前后則沒有明顯差別。Skos Pheumaticos等對4個新鮮脊柱共40個正常椎體進行椎體注入了PMMA與不注入PMMA的生物力學研究顯示未進行成形術的椎體最大負荷為（6 72402±3 29170）N，然而注入了PMMA的椎體最大負荷為（5 770504±2 13372）N，兩組間統(tǒng)計學上無明顯區(qū)別。這提醒對有椎體骨折高?；颊哌M行預防性的椎體成形術治療可能是不可取的〔24〕。在骨折椎體上下緣椎體注入適當?shù)墓撬鄟砭徑庾刁w間強度差異，是否可以減少因為椎體間應力不平衡導致的骨折以及是否能夠更有效的維持脊柱的生物力學穩(wěn)定性還有待進一步的研究。但對于有嚴重骨質疏松患者的椎體壓縮性骨折，也有在包括骨折椎體共4個椎體注入PMMA（其中骨折椎體為T6、7，注入骨水泥椎體T6~9）〔25〕。近來陸續(xù)有對骨質疏松患者預防性注入骨水泥來提高椎體強度可行性的研究。Sun，K等研究發(fā)現(xiàn)，對高?；颊咦⑷胫辽僮刁w容積20％的骨水泥才能有效減少其骨折風險，而對中等程度危險度患者則需要注入椎體容積5％～15％的骨水泥，而這種預防性治療和骨折后進行椎體成形術治療的并發(fā)癥發(fā)生率并無太大區(qū)別〔26〕。

25 椎體成形術后臨近椎體的生物力學改變

對椎體成形術后的生物力學研究同時發(fā)現(xiàn)其不足之處，特別是對上下緣椎體的影響較為明顯。椎體成形術的目的為最大程度上的恢復壓縮椎體的剛度和抗壓強度，但對椎體強度的恢復或增強，可能是臨近椎體骨折的重要原因，因其可使上下緣椎體所受壓力升高〔27〕。

Bertemann等對10例人體新鮮標本相鄰椎體共20對，隨機分成2組，一組下緣椎體注射PMMA，另一組設為對照，對上緣椎體負荷的生物力學研究顯示，2組上緣椎體在低于臨界負荷下與對照組無明顯差別，但在臨界負荷時實驗組壓力平均低于對照組19％，在實驗組中，骨折總發(fā)生在成形椎體的上緣椎體〔28〕。臨床上也有椎體成形術后上下臨近椎體骨折的報道〔15、29〕。在APerezHigueras等對13例經(jīng)過經(jīng)皮椎體成形術的患者進行5 a長期隨訪觀察得出臨床療效顯著的同時也發(fā)現(xiàn)有2例發(fā)生臨近椎體骨折〔11〕。對1組平均年齡74歲的椎體成形術后患者研究顯示，臨近椎體發(fā)生骨折概率每年遞增66％。其下緣椎體有一個或多個椎體骨折時，第1 a發(fā)生骨折的危險性提高了約5倍，在椎體骨折后的1 a里發(fā)生新的骨折的概率約192%〔30〕。

如前所述，椎體骨折可能與臨近椎體的強度增加有關。對L4、5椎體的研究發(fā)現(xiàn)椎體成形術后堅硬的骨水泥對椎體上緣的終板造成約7％的壓縮，使椎間盤內壓力較正常增高了19％，特別是在脊柱負荷增高時，椎間關節(jié)活動度下降11％，上緣椎體下終板內凸增加17％，這可能是導致成形術后臨近椎體骨折的原因〔31〕。由于患者術后疼痛的減輕，改變了生活方式，脊柱運動量和負荷增加，也使椎體骨折的幾率增加。同時與成形術后椎體臨近的椎間盤內壓力升高也使椎間盤突出的危險性增加。

不同材料的使用對臨近椎體生物力學影響不同。一般而言，松質骨彈性模量為168 MPa，PMMA則為2 700 MPa，CPC彈性模量在180 MPa左右，CPC較PMMA在避免應力遮擋效應和載荷傳遞異常以及減少相鄰椎體繼發(fā)骨折方面有優(yōu)越性。有研究顯示CPC椎體成形后，相鄰椎間盤應力沒有明顯變化，應力遮擋和異常載荷傳遞效應甚微，相比PMMA、CPC椎體成形術在降低相鄰椎體骨折發(fā)生率方面有潛在的優(yōu)勢。

到目前為止，對椎體成形術后與未進行椎體成形術時對臨近椎體發(fā)生骨折的危險性是否增高還未見完全隨機試驗的研究，然而臨近椎體的骨折也許是嚴重骨質疏松的自然進程，特別是臨近椎體有相似的機械和形態(tài)學特征。但近來相繼有報道椎體成形術后臨近椎體的力學性質下降，可能增加骨折的危險性。填充材料的發(fā)展可以有效增強骨折椎體的抗壓能力和維持良好的形態(tài)學特征，并可能使骨折椎體的生物力學性質恢復到最佳的狀態(tài)。

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篇10

英文名稱：Chinese Journal of Antibiotics

主管單位：中國醫(yī)藥集團

主辦單位：中國醫(yī)藥集團四川抗菌素工業(yè)研究所;中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所

出版周期：月刊

出版地址：四川省成都市

語

種：中文

開

本：大16開

國際刊號：1001-8689

國內刊號：51-1126/R

郵發(fā)代號：62-193

發(fā)行范圍：國內外統(tǒng)一發(fā)行

創(chuàng)刊時間：1976

期刊收錄：

CA 化學文摘(美)(2009)

CBST 科學技術文獻速報(日)(2009)

中國科學引文數(shù)據(jù)庫(CSCD―2008)

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