導語：如何才能寫好一篇七夕表達愛，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

【關鍵詞】 黑色素瘤抗原；MAGE-A9；RT-PCR；基因克隆；基因表達

Construction of MAGE-A9 gene prokaryotic expression system and its expression in hepatocellular carcinoma

XU Lu，ZHU Jin，QIU Zhen-ning, et al. Department of Pathology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China

【Abstract】

Objective Its to clone human MAGE-A9 cDNA ，to express its recombinant protein in E. coli and to examine the expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens.Methods The cDNA encoding human MAGE-A9 gene was amplified by RT-PCR from human hepatocelluar carcinoma tissue before the MAGE-A9 gene was inserted into plasmids pMD18-T. After sequencing, the MAGE-A9 was cloned into the prokaryotic expression vector pBAD/gIII to construct the recombinant expression vector pBAD/gIII-MAGE-A9 and was transformed into E. coli TOP10．The recombinant MAGE-A9 protein was expressed under induction of L-Arabinose and was purified through Hitrap column. The anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was generated. The expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens was examined through ABC assay.Results The sequence of MAGE-A9 was identical to the sequence from GenBank. By affinity column and SDS-PAGE , the purified MAGE-A9 fusion protein displayed a band of Mr 35 000． Anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was procuced. We found that MAGE-A9 expressed in the cytoplast of positive cells and MAGE-A9 antigen was detected on 8 cases out of 39 (21%) hepatocellular carcinoma specimens.Conclusion MAGE-A9 antigen was expressed in a fair proportion of hepatocellular carcinoma specimens , these patients might be suitable candidates for immune involving antigen encoded by MAGE-A9 gene.

【Key words】 Melanoma antigen ; MAGE-A9; RT-PCR; Gene cloning; Gene expression

MAGE-A（melanoma antigen A）基因是首先從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤相關抗原，這類抗原在正常組織中除和胎盤組織外均不表達,但在某些惡性腫瘤組織高度特異性表達,同時它們經(jīng)MHC-Ⅰ類分子遞呈到細胞表面后,可為自體細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 識別［1］,因

而是一種CTL介導的特異性免疫治療的理想靶分

子［2］。迄今已知MAGE-A基因家族成員達12個，各成員間的同源性較高。而肝細胞癌在我國發(fā)病率高，臨床療效及預后均很不理想，近來針對肝細胞癌的免疫治療成為研究熱點。

MAGE-1A9 cDNA 全長945 bp,編碼分子量約35 Kd的蛋白產(chǎn)物。本文通過克隆、表達肝細胞癌MAGE-A9基因，制備抗MAGE-A9的單克隆抗體，觀察MAGE-A9基因在肝細胞癌中的表達及定位，為進一步進行MAGE-A9基因的功能研究及肝細胞癌的免疫治療奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 材料 6～8周齡雌性BALB/c小鼠，購自南京醫(yī)科大學動物中心。肝細胞癌手術切除新鮮標本1例，取自江蘇省腫瘤醫(yī)院住院患者，液氮保存。肝細胞癌蠟塊標本39例，其中38例取自南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科，1例取自江蘇省腫瘤醫(yī)院病理科，男性共36例，女性3例，年齡31～74歲。大腸桿菌菌株TG1及Top10由本實驗室保存。質(zhì)粒pMD18-T購自大連寶生物公司，pBAD/gIII 載體購自美國Invitrogen公司。PCR試劑，ExTaq酶，限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III, T4 DNA連接酶,等購自大連寶生物公司； Hitrap鎳親合柱購自美國Amersham公司； ABC免疫組化試劑盒購自美國Vector公司。

1．2 方法

1．2．1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中MAGE-A9基因序列設計引物P1：5CACAAGCTTCGGACTCC CTCTTCCTCCTCTCT 3；P2：5CCGGAATTCGAATGT CTCTTGAGCAGAGGAGT 3，分別引入Hind III 和EcoR I酶切位點,由北京賽百盛公司合成。

1．2．2 肝癌組織總RNA制備及RT-PCR擴增 Trizol一步法提取肝癌組織總RNA，將抽提產(chǎn)物溶于DEPC處理的雙蒸水中，以P1和P2為引物作RT-PCR擴增:94 ℃ 4 min預變性，94 ℃ 50 s變性，58 ℃ 50 s退火，72 ℃ 60 s延伸，共30個循環(huán)，72 ℃終末延伸7 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1．2．3 MAGE-A9基因的克隆 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化, 將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行T-A克隆重組, 連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌TG1,藍白斑篩選陽性克隆, PCR初步鑒定陽性克隆后,進行DNA 序列分析。堿裂解法提取陽性重組體pMD18-T- MAGE-A9質(zhì)粒, 用EcoR I、 Hind III 酶切, 酶切產(chǎn)物與同樣酶切的表達載體pBAD/gIII用T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌TG1,氨芐平板篩選陽性克隆。提取陽性克隆菌質(zhì)粒,以EcoR I、Hind III 酶切, 1％瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定陽性克隆,所得重組質(zhì)粒命名為pBAD/gIII-MAGE-A9。

1．2．4 MAGE-A9基因的誘導表達及純化 取1μl質(zhì)粒pBAD/gIII-M9轉化感受態(tài)大腸桿菌Top10, 氨芐平板篩選. 挑取單個陽性克隆培養(yǎng)至A600 nm=0．5,加入左旋阿拉伯糖(終濃度為0．002%)，于37 ℃

劇烈震蕩誘導表達4 h后收菌,PBS 重懸,超聲裂解,低溫離心,取上清。表達產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎,離心，上清經(jīng)Hitrap鎳親和柱吸附, 樣品過柱, 以含有0．2、0．3、0．4和0．5 M咪唑的洗脫液依次洗柱，收集純化液, 行12％SDS-PAGE電泳，分析最佳的咪唑洗脫濃度。

1．2．5 單抗制備 常規(guī)雜交瘤法制備單抗。腹腔注射100 μg MAGE-A9蛋白純化產(chǎn)物免疫BALB/c小鼠，對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤SP2/0細胞和免疫小鼠的脾細胞按常規(guī)PEG方法融合,有限稀釋法克隆細胞。ELISA法檢測雜交瘤培養(yǎng)上清,陽性細胞連續(xù)亞克隆,直至陽性率達到100%，確定為穩(wěn)定的細胞株。

1．2．6 免疫組化 肝細胞癌石蠟切片4～5 μm，常規(guī)乙醇脫蠟至水，0．01%檸檬酸鹽緩沖液微波修復，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，2%二抗動物（馬）血清封閉,以本實驗制備的抗MAGE-A9雜交瘤細胞培養(yǎng)上清為一抗，常規(guī)ABC法染色，DAB顯色。以PBS代替一抗作為空白對照。

2 結果

2．1 RT-PCR擴增MAGE-A9基因 采用RT-PCR從人肝細胞癌組織中擴增目的基因,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,可見大小約945 bp 的條帶，見圖1,與945 bp的MAGE-A9基因目的片段大小一致。

注：1:MAGE-A9;2:DL2 000 Marker

圖1

MAGE-A9基因RT-PCR擴增結果

2．2 MAGE-A9基因克隆載體的構建 將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行T-A克隆，獲得pMD18-T-MAGE-A9重組體，見圖2，經(jīng)藍／白斑篩選和菌液PCR初步鑒定結果正確。DNA 序列分析表明質(zhì)粒為MAGE-A9基因的克隆,序列與GenBank 報道序列完全一致。MAGE-A9基因與原核分泌型表達載體pBAD/gIII經(jīng)EcoR I＋Hind III雙酶切后連接，構建MAGE-A9基因的原核分泌型表達系統(tǒng)pBAD/gIII-MAGE-A9。

注：1: DL15 000 Marker; 2: DL2 000 Marker;3: pMD18-T-MAGE-A9;4: pBAD/gIII-MAGE-A9

圖2

pMD18-T-MAGE-A9及pBAD/gIII-MAGE-A9重組質(zhì)粒酶切鑒定圖譜

2．3 MAGE-A9 蛋白的誘導表達和純化 菌體經(jīng)左旋阿拉伯糖誘導，冰凍超聲裂解離心后，取上清行SDS-PAGE，結果見圖3，與空載菌對比，在分子量約35 Kd的位置有明顯表達條帶，符合MAGE-A9基因945 bp片段編碼315個氨基酸的蛋白分子質(zhì)量。用HiTrap鎳親和柱純化帶有(His)6尾的重組蛋白，洗脫液咪唑濃度從0．2～0．5 M，純化液行12％SDS-PAGE電泳。洗脫最佳咪唑濃度為0．4 M。

注：1-4:純化的MAGE-A9（純化咪唑濃度從0．2~0．5 M）；5:Marker；6:空載細菌；7:誘導表達的菌體蛋白

圖3

SDS-PAGE 鑒定MAGE-A9蛋白的表達和純化

2．4 抗MAGE-A9單克隆抗體的制備和鑒定 間接ELISA法檢測雜交瘤培養(yǎng)上清，經(jīng)3次亞克隆，陽性率達100%。Western blot法檢測單抗與MAGE-A9的結合，結果 見圖4。

注：1：細菌空載； 2:MAGE-A9 protein;3: Marker

圖4

Western blotting 鑒定MAGE-A9 單抗

2．5 MAGE-A9在肝癌組織的定位觀察 陽性表達表現(xiàn)為癌細胞胞漿被染成棕紅色 見圖5，非癌肝細胞未著色。39例肝細胞癌，陽性表達8例，陰性31例，陽性表達率為21%。MAGE-A9基因的表達與部分臨床指標的關系見表1。

注：左圖為陽性癌細胞胞漿染成棕褐色，右圖為非肝癌細胞未著色

圖5

肝細胞癌MAGE-A9基因表達產(chǎn)物定位觀察。（DAB顯色， 400×）

注：采用u檢驗進行統(tǒng)計學分析,P>0．05;MAGE-A9的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度無相關性

3 討論

尋找合適的腫瘤抗原一直是腫瘤免疫治療的難題。自20世紀50年代以來，科研工作者陸續(xù)在以黑色素瘤為主的多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了一些腫瘤相關抗原，從而成為腫瘤免疫治療的基礎。應用MAGE-A1基因作為疫苗應用于腫瘤治療的探索性研究較多:

①用MAGE-A1抗原肽疫苗誘導擴增特異性CTL進行過繼免疫治療［2］；②用人工合成的MAGE-A1抗原肽脈沖處理樹突狀細胞(DC)或用MAGE-A1基因修飾的DC制成DC疫苗,對腫瘤患者進行免疫治療［3］。而繼MAGE-A1基因第一個從黑色素瘤細胞克隆后,目前已發(fā)現(xiàn)12個MAGE-A成員并形成一個家族。由于MAGE-A抗原為許多腫瘤所共有,并具有嚴格的腫瘤表達特異性,因此MAGE-A

家族分子被視為腫瘤免疫治療的理想靶點［1］。

MAGE-A9是MAGE-A亞家族成員, 由于MAGE-A家族中的部分基因已成為良好的腫瘤靶基因，同時MAGE-A家族基因之間有較高的同源性，故MAGE-A9有可能成為腫瘤治療的潛在靶點。因此, 對MAGE-A9基因進行克隆、表達,制備特異性單抗，明確其在肝癌中表達及定位，這不但有助于對MAGE-A9基因功能的研究，對肝癌的免疫治療也具有重要意義。

本研究利用RT-PCR 方法,從人肝癌組織中克隆出目的基因全長片段,構建了原核表達載體pBAD/gIII-MAGE-A9，通過細胞融合技術，制備了一株抗MAGE-A9分子的單克隆抗體，證實可與MAGE-A9分子特異性結合。在以往研究中，由于缺乏特異性單抗，很多腫瘤因子的表達都是基因水平的研究，關于MAGE-A9在腫瘤中的表達研究也不例外［4］，包括MAGE-A9在食管腺癌相關的Barrett食道中過表達［5］，在皮膚T細胞淋巴瘤陽性表達率27%［6］。但基因與蛋白水平的表達并不完全一致，更重要的是，腫瘤免疫治療是以抗原的確切定位為基礎的。本文在制備了抗MAGE-A9單克隆抗體的基礎上，應用免疫組化技術，首次證實MAGE-A9抗原在肝癌癌細胞中主要表達在胞漿，未見同一標本中部分腫瘤細胞MAGE-A9抗原陽性而另一部分腫瘤細胞MAGE-A9 抗原陰性的情況,只是見標本中全部腫瘤細胞MAGE-A9 抗原陽性或全部陰性，這提示,選用MAGE-A9 基因產(chǎn)物作為靶分子對陽性患者進行免疫治療有可能對全部的腫瘤細胞都產(chǎn)生殺傷效應。本實驗結果經(jīng)統(tǒng)計學分析，認為MAGE-A9在肝癌中的表達于患者年齡、性別、腫瘤大小和分化程度沒有相關性，與趙海濤等檢測MAGE-A10在肝癌中的表達與臨床病理未見相關性的結果相一致［8］。本實驗陽性表達率為21%（8/39），相比MAGE-A1、MAGE-A10等其他MAGE-A家族抗原在肝癌中超過50%［7，8］的表達偏低，可能與以下幾方面原因有關：①以往研究以RT-PCR法檢測基因表達居多，而本實驗采用的是免疫組化法，在方法上可能會存在差異；②肝癌標本代表性不足，本實驗標本數(shù)量不多，均為肝癌原發(fā)灶標本，未涉及肝癌轉移灶，且多為中等分化程度的，分化程度較高和較低的肝癌標本基本未包括，亦未收集到不伴慢性肝炎的肝細胞癌標本。今后的研究需擴大樣本，同時檢測MAGE-A9在常用的人肝癌細胞株（如SMMC-7721、BEL-7402、HepG2等）中的表達情況。

參考文獻

1 Zendman AJ , Ruiter DJ , VanMuijen GN. Cancer/ testis-1associatedgenes : identification , expression profile , and putative function. Cell Physiol，2003，194(3):272 -288．

2 Toso JF , Oei C , Oshidari F , et al . MAGE-1- specific precursor cytotoxic T-lymphocytes from a patient with breast cancer : characterization and antigen-specific activation .Cancer Res，1996，56(1)：16.

3 Gillespie AM, Coleman RE. The potential of melanoma antigen expression in cancer therapy .Cancer Treat Rev，1999，25(4)：219-227．

4 王道榮，陳國玉，等.胃癌患者外周血和骨髓血中CD44v6基因表達與胃癌微轉移的研究.南京醫(yī)科大學學報（自然科學版），2004，24（6）：638-640，653．

5 Lin J, Lin L, Thomas DG, et al . Melanoma-associated antigens in esophageal adenocarcinoma: identification of novel MAGE-A10 splice variants． ClinCancer Res，2004，10(17):5708-5716．

6 Eichmuller S, Usener D, Thiel D, et al .Tumor-specific antigens in cutaneous T-cell lymphoma: expression and sero-reactivity.Int J Cancer，2003，104(4):482-487．

7 蔡勝利,陳紅松,等.惡性黑色素瘤抗原編碼基因MAGE-1在肝細胞肝癌中表達的研究. 中華普通外科雜志，1999，14（3）229-230．

篇2

【關鍵詞】皮膚鱗狀細胞癌;細胞周期蛋白;cyclin E;表達

【中圖分類號】R739.5 【文獻標識碼】A 【文章編號】1006-1959(2009)09-0007-01

2005年2月到2009年4月采用免疫組織化學法觀察32例皮膚鱗狀細胞癌中Cyclin E的表達,并進行相關性分析,探討其在皮膚鱗狀細胞癌是表達異常的意義及其與皮膚生物學行為的關系。

1 臨床資料

1.1 一般資料:皮膚鱗狀細胞癌標本為我院2005年2月到2009年4月經(jīng)病理確診存檔的32例石蠟包埋組織(觀察組),其中男26例,女6例,年齡40-90歲,平均年齡(54.5±12.5)歲。皮損部位:頭面部10例,下唇部1例,軀干部5例,下肢5例,會10例,足部1例。病理分級按WHO標準,I級7例,Ⅱ級15例,Ⅲ級10例。對照組為外科手術中剔除的32例正常皮膚組織。

1.2 免疫組織化學染色

1.2.1 試劑及儀器。一抗:鼠抗人Cyclin E單克隆抗體,免疫組織化學SP試劑盒(生工生物工程公司,武漢)。

1.2.2 染色方法:石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后,經(jīng)高壓鍋熱處理修復抗原,4% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水洗,10%正常羊血清封閉20min,滴加PBS稀釋的Cyciin E工作液,室溫2h,PBS洗3次,再分別加鼠抗人Cyclin E單克隆抗體及SABC復合物室溫各孵育30min,兩次孵育后均用PBS洗3次;DAB顯色,蘇木素復染,中性樹膠封片。

1.3 結果觀察及判定標準:Cyclin E蛋白陽性表達表現(xiàn)為細胞核出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒。在高倍鏡下取5-8個視野觀察,計數(shù)500個以上細胞并計算Cyclin E陽性細胞百分率,以Cyclin E陽性表達細胞數(shù)>5%為Cyclin E蛋白過表達。Cyclin E蛋白免疫組織化學結果均經(jīng)重復染色一次印證,兩位獨立觀察者分別觀察計數(shù)并取均值。

1.4 統(tǒng)計方法:實驗數(shù)據(jù)用SPSS15.0程序進行統(tǒng)計學處理。計量資料用均數(shù)±標準誤(x±S>x),若是正態(tài)分布,用方差分析,組間、組內(nèi)比較;若是非正態(tài)分布,用秩和檢驗。以P

2 結果

在對照組皮膚細胞核內(nèi)未見陽性表達;在觀察組鱗癌組織中表達定位于細胞核,呈棕黃色,陽性染色細胞散在分布于表皮組織中。Cyclin E在鱗癌組織中陽性表達較正常人對照組高,兩者差異有統(tǒng)計學意義(P

3 討論

當前細胞周期中存在幾個重要關卡(checkpoint),并受一些細胞周期蛋白調(diào)控,當控制這些關卡的基因異常表達細胞周期調(diào)控蛋白時,可造成基因組不穩(wěn)或靜止的細胞越過這些關卡,引起細胞周期失控,導致細胞過度增殖。 G1向S轉變是細胞周期主要調(diào)控點之一,目前發(fā)現(xiàn)G1期的調(diào)節(jié)因子與癌變關系最密切。細胞周期調(diào)控涉及細胞周期蛋白(Cyclin)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKI),以CDK的活性表達與調(diào)控為主。已證實,作為一種細胞周期正向調(diào)節(jié)因子的細胞周期蛋白E(Cyclin E)是一種癌基因, Cyclin E的正調(diào)控在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用。Cyclin E表達在G1晚期達高峰,是G1/S期轉換的限速因子,其過度表達可加速細胞進入S期,導致細胞無限制增殖,并進一步引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CyclinE是1991年美國的研究小組在篩選人cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。由4個外顯子3個內(nèi)含子組成,轉錄2.2 kb的mRNA,編碼395個氨基酸的蛋白質(zhì),分子質(zhì)量50ku。Cyclin E的合成在G1晚期達高峰,繼CyclinD后被活化,然后經(jīng)與PEST序列有關的蛋白水解或泛素路徑降解而迅速下降。因此,CyclinE主要在G1晚期發(fā)揮正性調(diào)控細胞周期的作用。

Mullerw等研究表明在一大部分早期NSCLC患者中Cyclin E的mRNA水平升高。Geng等研究了87例乳腺癌患者,其中21例有Cyclin E mRNA的高表達,約占24%,雌激素受體陽性及陰性的頻率大致相當。一大部分Cyclin E過表達的人乳腺癌同時過表達周期蛋白E mRNA。Payton等發(fā)現(xiàn)肺癌和乳腺癌患者原發(fā)腫瘤Cyclin E的表達升高。肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌Cyclin E2信號最強,其次是乳腺浸潤性導管癌。雌激素受體缺乏的乳腺腫瘤更容易引起Cyclin E升高,提示Cyclin E可能導致乳腺腫瘤發(fā)病機理的解偶聯(lián)。本組正常皮膚組織cyclin E無表達,皮膚鱗狀細胞癌組織cyclin E陽性表達,且在復發(fā)腫瘤中及隨病理分級升高而升高。表明在皮膚鱗狀細胞癌發(fā)生的早期,cyclin E陽性表達逐漸增高,但僅為量變,故其陽性表達與病理分型、臨床分期、淋巴結轉移、顱神經(jīng)侵犯無關;當其陽性表達增至最高點,由量變發(fā)生質(zhì)變,細胞進入S期,瘤細胞進入無限增殖期。cyclin E陽性表達在鼻咽癌患者中的3年生存率差異有顯著性,表明其在判斷鼻咽癌預后中有參考價值。

總之,細胞周期調(diào)節(jié)失控是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制,其中Cyclin E的正調(diào)控在此過程中起關鍵作用。隨著對Cyclin E作用機理的深入研究,將為進一步闡明皮膚鱗狀細胞癌的發(fā)病機制帶來曙光,并為皮膚鱗狀細胞癌的治療和預防提供新的靶點。

參考文獻

[1] 陳意生.腫瘤分子細胞生物學[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2002

[2] 曲才杰,史同新,林桂銘.p27和細胞周期蛋白E在Bowen病及皮膚鱗狀細胞癌中的表達[J].中華皮膚科雜志,2006,53(2):71-72

[3] 郭建華,李玲香.Cyclin E與惡性腫瘤[J].腫瘤研究與臨床,2003(1):68-71

[4] 黃劍飛,顧美珍,咸華,等.細胞周期素E、D1與增殖細胞核抗原在肝癌中的表達及臨床意義[J].江蘇醫(yī)藥,2006(3):212-213

篇3

【關鍵詞】 IgG； 肝癌； 臨床病理學指標； 原位雜交； 免疫組織化學

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and distribution of IgG in human liver cancer cells and its correlation with clinicopathological factors of hepatocellular carcinoma.Method：Fresh and paraffin-embedded tissues from 60 cases of HCC tumor with the matched normal liver specimens were detected by two-step immunohistochemistry and in situ hybridization for the expression of IgG protein and mRNA respectively. The relationship between cancer-derived IgG expression and 9 clinicopathological factors were analyzed statistically.Result：Signals of IgG protein in hepatocellular carcinoma cancer cells was significantly stronger than that in its corresponding normal tissues （P=0.001）； the over-expression of IgG was negatively correlated with several clinicopathological factors such as tumor differentiation grade and pTNM （r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）， and positively associated with AFP concentration in serum （r=0.336，P=0.009）. However， no correlationship with age， gender， capsular infiltration，tumor size， tumor quantity and recurrence or metastasis of the disease within 1 year was found （P>0.05）. Conclusion：Liver-cancer-derived IgG may has a profound impact on the differentiation and pTNM staging of liver cancer cell， and might be served as a tumour marker to help pathological diagnosis and evaluate the prognosis for patients.

【Key words】 IgG； Liver cancer； Clinical pathological factors； In situ hybridization； Immunohistochemistry

First-author’s address：Weifang Medicial University，Weifang 261053，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.008

近來多項研究證明，乳腺癌、大腸癌、胃癌和肺癌等源于上皮的惡性腫瘤細胞可以產(chǎn)生IgG[1-6]。邱曉彥等[4]最早發(fā)現(xiàn)Ig樣蛋白的表達與惡性腫瘤的分化有關；依據(jù)腫瘤的分化程度不同，Ig樣蛋白的表達水平也不同，即分化程度越高，表達強度越低，并證實該Ig樣蛋白為IgG；葉雪等[7]發(fā)現(xiàn)在惡性卵巢上皮性癌中IgG的表達強度明顯高于正常卵巢，IgG的表達水平與卵巢癌的臨床分期和病理分級無相關性；李浩勇等[6]對膀胱癌研究發(fā)現(xiàn)：膀胱癌細胞能夠表達IgG，其抗體體外對膀胱腫瘤細胞的生長具有一定的抑制作用，且具有促進癌細胞凋亡的效應；Niu等[8]研究了IgG的表達與結直腸癌的生物學指標和臨床病理學指標的關系，通過siRNA干擾下調(diào)IgG的表達，可以抑制結直腸癌細胞（LOVO細胞）的增殖、克隆形成和侵襲能力，提示腫瘤源性IgG具有促進腫瘤生長，轉移的作用。肝癌亦屬于上皮性惡性腫瘤，但是目前對于IgG在肝癌組織中的表達與分布情況及其與臨床病理學指標的關系的研究尚未有報道。本實驗采用免疫組化技術和原位雜交技術檢測肝癌組織中IgG的表達情況，進而分析其表達水平和肝細胞肝癌9項臨床病理學指標的關系，以期為肝細胞肝癌的診斷、治療和預后評估提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院和濰坊市民醫(yī)院2010-2012年手術切除的肝癌標本60例，其中男40例，女20例，平均年齡45歲，患者術前均未采取任何治療措施。所有肝癌病例隨訪12～18個月。本實驗經(jīng)濰坊醫(yī)學院倫理委員會批準，并獲得患者的書面許可。所有新鮮標本均經(jīng)4%多聚甲醛/PBS固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚度切片。

1.2 免疫組化方法 采用PV-9000兩步法（試劑盒購自美國Zymed公司）進行免疫組化檢測。切片常規(guī)脫蠟，入水，枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復，經(jīng)3%過氧化氫37 ℃孵育20 min后，滴加小鼠抗人IgG單克隆抗體（1：1000，購自美國sigma公司），4 ℃濕盒過夜，滴加試劑1（聚合物輔助劑），37 ℃孵育30 min，滴加試劑2（辣根過氧化素）標記二抗，37 ℃孵育30 min。各步驟之間均是PBS沖洗3次，每次5 min。AEC顯色，蘇木素復染，甘油明膠封片。以手術切除的扁桃體組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 原位雜交方法 切片二甲苯脫蠟，乙醇梯度透明至PBS反復沖洗，酶消化，經(jīng)預雜交，滴 50μL含探針的雜交液，45 ℃保溫，20 h。將切片浸泡于5×SSC（37 ℃）中，后依次經(jīng)5%甲酰胺2×SSC（37 ℃）清洗15 min。PBS Buffer Ⅰ漂洗一次后，滴加50 μL馬血清封閉液，置濕暗盒中室溫1 h。后滴加Anti-Dig-Ab（1∶100，購自瑞士roche公司），室溫1 h后BufferⅠ、Ⅱ液依次漂洗數(shù)次，NBT-BCIP顯色。以結腸黏膜下孤立淋巴結作為陽性對照，以IgG正義探針代替反義探針作為陰性對照。

1.4 免疫組織化學結果評分 采用雙盲法，由3位病理學教授在400×的顯微放大倍數(shù)下隨機對染色切片獨立評分，所得平均分作為最終結果。評分標準如下：（1）陽性細胞數(shù)所占比例：小于5%為0，5%～25%為1，25%～50%為2，大于50%為3；（2）染色強度：未著色為0，淡紅色或粉紅色為1，紅色為2，深紅色為3。兩項測量標準得分之和為0～3分的切片標記為弱染色，陰性；4～6分的切片標記為強染色，陽性。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料比較采用Pearson 字2及Fisher確切概率法檢驗分析，評估IgG的表達情況與臨床病理學參數(shù)（年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤個數(shù)、腫瘤分化程度、AFP濃度、pTNM分期、1年內(nèi)是否復發(fā)或轉移）之間的相關性。以P

2 結果

2.1 IgG蛋白在肝癌組織的表達及免疫組化檢測結果 經(jīng)免疫組化檢測結果顯示60例肝癌組織的IgG蛋白陽性率為85.00%（51/60），癌周正常肝組織的陽性率為6.67%（4/60），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。IgG蛋白陽性染色主要定位于肝癌細胞胞漿和胞膜。

2.2 IgG mRNA在肝癌組織的表達及原位雜交結果 IgG mRNA陽性信號位于肝細胞肝癌細胞胞漿，為藍紫色，呈顆粒狀，與免疫組化結果具有良好的一致性，從mRNA水平證實了肝細胞肝癌組織自身具有產(chǎn)生IgG的能力。

2.3 IgG在肝癌組織中的表達和臨床病理學指標的關系 IgG的異常高表達與肝細胞肝癌分化程度和pTNM分期呈負相關（r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）；與血漿AFP濃度呈正相關（r=0.336，P=0.009）；與年齡、性別、腫瘤包膜完整性、腫瘤大小、腫瘤個數(shù)和一年內(nèi)是否復發(fā)與轉移無相關性（P>0.05），見表1。

3 討論

免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）是體內(nèi)免疫球蛋白家族中含量最高的一種，在機體抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。經(jīng)典免疫學理論認為IgG僅可由B淋巴細胞經(jīng)成熟分化過程才能夠特異性合成并分泌。近年來多項研究發(fā)現(xiàn)IgG在其他多種上皮性惡性腫瘤組織和細胞系中也存在異常高表達的現(xiàn)象[1-2，5，7-8]。Niu等[8]最近發(fā)現(xiàn)IgG在結直腸癌組織中和CRC細胞中高度表達，而且此高度表達與腫瘤的分期、淋巴結轉移和炎性細胞浸潤有密切的關系，提示腫瘤源性IgG可能對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要影響。有研究顯示在肝細胞肝癌患者的血漿中和肝癌細胞系（BCL-7402）中均可檢測到IgG的含量異常增高[2，5，9]。但是在肝癌組織中的表達情況未有報道，肝癌細胞所分泌的IgG的功能未知，其表達和癌癥的臨床病理學指標的關系也有待于研究。

在本項研究中，筆者分別從蛋白質(zhì)水平和mRNA水平證明了肝癌組織可以產(chǎn)生IgG。IgG在肝癌中的高表達（85.00%）與腫瘤的分化程度和pTNM分期呈負相關，IgG在分化較差（低分化或未分化）或在處于pTNM Ⅲ～Ⅳ期的肝細胞肝癌組織中的表達比在分化較好（中分化或高分化）或在處于pTNM Ⅰ～Ⅱ期的肝細胞肝癌組織中更為明顯；IgG的高表達與血漿AFP濃度呈正相關，與年齡、性別、腫瘤包膜的完整性、腫瘤大小、腫瘤個數(shù)和一年內(nèi)是否復發(fā)或轉移無相關性。實驗結果提示腫瘤源性IgG可能與腫瘤生長有關。免疫球蛋白能促進腫瘤生長的現(xiàn)象已有報道，這主要與“抗癌抗體”阻斷癌細胞表面的靶表位有關[10-13]。Taylor等[14]在研究卵巢癌中發(fā)現(xiàn)異常糖基化的免疫球蛋白分子不能誘導免疫應答。此外，免疫球蛋白重鏈，T淋巴細胞受體（例如：TCR-a，TCR-b），免疫球蛋白樣黏附分子（例如：CD47，CD54）均可在癌細胞中表達[15]。免疫球蛋白抗體和T淋巴細胞受體可啟動補體依賴的細胞毒作用，致使癌細胞凋亡。所以免疫蛋白超家族對于腫瘤細胞可能具有自身保護作用，并與癌細胞的增殖有關。邱曉彥等[4]早期研究了3例肝癌組織，其分化程度均為中度，研究結果顯示肝癌細胞中Ig蛋白均具有很高的表達量，因此認為在肝癌組織中IgG的表達程度與腫瘤的分化無相關性。而本研究提示IgG在肝癌中的異常表達與腫瘤的分化程度呈負相關。這種差異可能由于樣本量大小不同造成。

甲胎蛋白（AFP）是分子量為64 000～70 000道爾頓的一種糖蛋白，主要由肝細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體合成，是胎兒成長發(fā)育的重要蛋白，具有保護胚胎不受母體排斥的作用。AFP在出生后立即消失，若再次出現(xiàn)則提示肝癌或生殖胚胎癌，因此AFP是肝癌診斷、治療和預后判斷的重要指標。賈戶亮等[16]分析腫瘤數(shù)目、大小和pTNM分期不同的肝細胞肝癌的患者血清AFP水平顯示，AFP水平的高低與腫瘤的大小、數(shù)目和pTNM分期均呈正相關，其中pTNM Ⅰ期與pTNM Ⅲ～Ⅳ期以及pTNM Ⅱ期與pTNM Ⅲ～Ⅳ期肝細胞肝癌患者血清AFP水平具有顯著的差異。

本實驗結果表明，血清AFP水平較高（>400 μg/L）

的肝細胞肝癌患者組的IgG陽性表達率（92.8%，39/42），比血清AFP水平較低（≤400 μg/L）的肝細胞肝癌患者（66.7%，12/18）組顯著增高，與先前文獻報道結果一致。盡管血清AFP含量水平對肝癌的早期診斷有重要意義，但是并非所有AFP升高都可以斷定為肝癌，而且并非所有血清AFP含量水平正常就能排除肝癌的可能。在肝炎、肝硬化活動灶等疾病中亦可檢測到高水平含量的血清AFP，因此僅僅根據(jù)血清AFP濃度來對肝細胞肝癌進行早期診斷是不夠準確的[17-18]。所以聯(lián)合腫瘤源性IgG表達水平的檢測可提高陽性檢出率，降低漏診率和誤診。

綜上所述，在肝癌組織中IgG表達顯著增高，IgG的表達水平與腫瘤的分化、分期有著密切的關系。這可為以后的肝癌的早期診斷和分期判斷提供了又一重要指標。研究IgG的表達與腫瘤的生長分化的關系，有助于為腫瘤的免疫治療提供理想的理論依據(jù)，但是對于其功能與分子機制的關系有待于進一步研究。

參考文獻

[1]汪渙，張叔人，何祖根，等.免疫球蛋白樣物質(zhì)在上皮來源的惡性腫瘤中的表達[J].中國腫瘤臨床，2001，28（12）：169-171.

[2]邱曉彥，楊貴貞.惡性腫瘤細胞內(nèi)存在免疫球蛋白樣物質(zhì)[J].白求恩醫(yī)科大學學報，1996，22（5）：572-575.

[3]邱曉彥，楊貴貞.惡性腫瘤細胞內(nèi)呈現(xiàn)Ig樣物質(zhì)的特性及其基因結構分析[J].中國免疫學雜志，1996，5（12）：296.

[4]邱曉彥，侯春梅，李秀森，等.Ig樣蛋白的表達與惡性腫瘤分化及增殖細胞核抗原的相關性分析[J].軍事醫(yī)學科學院院刊，1999，23（1）：16-18.

[5]邱曉彥，侯春梅，李秀森，等.多種腫瘤傳代細胞中Ig樣物質(zhì)存在與檢測[J].癌癥，1999，18（11）：180-181，184.

[6]李浩勇，梁培育，朱孝峰，等.免疫球蛋白G在膀胱癌細胞中的表達及其抗體誘導腫瘤細胞凋亡的研究[J].中國生理病理雜志，2007，23（6）：1068-1073.

[7]葉雪，郭慧方，昌曉紅，等.免疫球蛋白IgG在卵巢上皮性癌的表達[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2007，8（2）：192-194.

[8] Niu N，Zhang J，Huang T，et al.IgG expression in human colorectal cancer and its relationship to cancer cell behaviors [J].Plos One，2012，7（11）：e47 362.

[9] Olubuyide I O，Salimonu L S，Adeniran S O.Soluble immune complexes and immunoglobulin （IgG， IgA and IgM） levels in Nigerians with primary liver cell carcinoma[J].African Journal of Medicine and Medical Sciences，1993，22（4）：57.

[10] Schreiber H，Wu T H，Nachman J，et al.Immunological enhancement of primary tumor development and its prevention[C].Seminars in Cancer Biology，Academic Press，2000，10（5）：351-357.

[11] Prehn R T.Stimulatory effects of immune reactions upon the growths of untransplanted tumors[J].Cancer Research，1994，54（4）：908-914.

[12] Manson L A.Anti-tumor immune responses of the tumor-bearing host： the case for antibody-mediated immunologic enhancement[J].Clinical Immunology and Immunopathology，1994，72（1）：1-8.

[13] Sj?gren H O，Hellstr?m I，Bansal S C，et al.Suggestive evidence that the "blocking antibodies" of tumor-bearing individuals may be antigen-antibody complexes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1971，68（6）：1372-1375.

[14] Taylor D D，Gercel-Taylor C.Tumor-reactive immunoglobulins in ovarian cancer： diagnostic and therapeutic significance？（review）[J].Oncology Reports，1998，5（6）：1519.

[15] Lee G，Zhu M，Ge B，et al.Widespread expressions of immunoglobulin superfamily proteins in cancer cells[J].Cancer Immunol Immunother，2012，61（1）：89-99.

[16]賈戶亮，刑戌健，葉青海.甲胎蛋白在原發(fā)性肝癌臨床診斷中的應用[J].中國醫(yī)學科學院學報，2008，30（4）：440-443.

[17]趙恒，廖靜，劉瑜.甲胎蛋白與肝癌[J].臨床肝膽病雜志，2008，24（5）：385-387.

篇4

[關鍵詞] T細胞共刺激分子；T細胞亞群；胃癌；大腸癌

[中圖分類號] R735 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）02（a）-0003-03

[Abstract] Objective To discuss and analyze the significance of T cell co-stimulatory molecules and their subgroups in the expression of gastric carcinoma and colorectal cancer tissues. Methods 41 cases of patients with gastric carcinoma and 39 cases of patients with colorectal cancer treated in our hospital from September 2014 to October 2016 were selected as the research objects and the patients with gastric carcinoma were selected as the group A， while the patients with colorectal cancer were selected as the group B， and 33 cases of healthy persons at the same period were selected as the group C， and the admission persons were tested by the Flow cytometry， and test results of T cell co-stimulatory molecules and their subgroups of the three groups were compared. Results The T cell co-stimulatory molecule CD28+CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C[（25.81±10.55），（28.94±9.28）% vs （0.81±0.97）%]， and T cell CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C[（53.62±13.83），（55.95±10.67）% vs （72.06±7.82）%]，the T cell CD4+CD3+ level in the group A and group B was lower than that in the group C[（29.83±9.72），（33.74±9.03）% vs （38.78±5.07）%]， the T cell CD8+CD28+CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C， [（1.58±1.98）%，1.92±2.62）% vs（0.04±0.03）%]，the T cell CD8+CD28-CD3+ and CD4/CD8 levels in the group A was lower than that in the group C[（16.07±6.95）， （1.15±0.54）%vs （20.55±6.55），（1.35±0.32）%]， and the T cell CD4+CD25+CD3+ level in the group B was higher than that in the group C[（19.75±6.88）% vs （13.71±3.07）%]， and the difference had statistical significance（P0.05）. Conclusion The T cell number of patients with gastric carcinoma and colorectal cancer obviously decreases， but the expression of CD28 increases， and CD4+T cell number of patients with gastric carcinoma obviously decreases， but the regulatory T cell number of patients with colorectal cancer obviously increases.

[Key words] T cell co-stimulatory molecules； T cell subgroup； Gastric carcinoma； Colorectal cancer

臨床上，腫瘤發(fā)生、發(fā)展同抗腫瘤免疫存在一定的聯(lián)系，抗腫瘤免疫的機理目前主要有腫瘤細胞免疫逃逸學以及免疫監(jiān)視學[1-3]。為了探討和分析T細胞共刺激分子及其亞群在胃癌和大腸癌組織中表達的意義，該次研究方便選擇該院于2014年9月―2016年10月期間收治的41例胃癌患者和39例大腸癌患者作為研究主體，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該次研究選擇該院收治的41例胃癌患者和39例大腸癌患者作為研究主體，胃癌患者為甲組，大腸癌患者為乙組，選擇同期進行檢測的33名健康人作為丙組。其中甲組患者男性為23例，女性為18例；年齡在43～79歲之間，平均為（59.61±3.15）歲。乙組患者男性為22例，女性為17例；年齡在42～78歲之間，平均為（59.31±3.24）歲。丙組中男性為19名，女性為14名；年齡在41～79歲之間，平均為（58.68±3.61）歲。甲乙丙3組上述資料差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），可對比。

1.2 方法

在術前和術后1周對甲乙兩組患者進行外周靜脈血抽取，抽取量為2 mL，行ETDA3K抗凝。丙組抽取2 mL的外周靜脈血抽取，行ETDA3K抗凝，在室溫下進行保存，檢測要在18 h之內(nèi)完成。

取100 μL的血樣全血分別加入熒光標記的CD3-Pc5、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-PE、CD28-FITC單抗和相應同型對照，在室溫下行避光孵育，時間為25 min左右，之后加入0.5 mL的溶血劑，作用時間為30 min，加入PBS直到0.5 mL。在混合均勻后通過流式細胞儀進行檢測，在檢測前行熒光微球矯正，保證機器的誤差

1.3 觀察指標

觀察并記錄3組的檢測結果。

1.4 統(tǒng)計方法

通過SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對此次研究數(shù)據(jù)進行處理，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，并采用 t 檢驗，以 P

2 結果

甲乙兩組T細胞共刺激分子CD28+CD3+水平高于丙組，甲乙兩組T細胞CD3+水平低于丙組，甲乙兩組T細胞CD4+CD3+水平低于丙組，甲乙兩組T細胞CD8+CD28+CD3+水平高于丙組，甲組T細胞CD8+CD28-CD3+以及CD4/CD8水平低于丙組，乙組T細胞CD4+CD25+CD3+水平高于丙組，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），見表1、表2。

3 討論

T細胞、巨噬細胞以及NK細胞是機體抗腫瘤免疫主要效應細胞，而CD4+T細胞能調(diào)節(jié)和活化上述細胞抗腫瘤效應。Ts細胞（CD8+CD28-CD3+）組織抗原的呈遞，并可阻斷Th細胞功能。T細胞的完全活化是CD28共刺激活化，CD8+CD3-細胞的亞群參與到了腫瘤細胞的免疫反應中，同機體的帶瘤狀態(tài)存在一定關系[4-7]。此次研究結果表明，甲乙兩組CD3+、CD4+以及CD8+等T細胞亞群的表達都明顯降低，尤其是甲組CD4+降低最為明顯，所以無法發(fā)揮出正?？鼓[瘤的作用；丙組的CD28表達比較微弱，甲乙兩組增高明顯。甲乙兩組的CD4+、CD8+表達升高，差異有統(tǒng)計學意義。甲乙兩組的CD8+、CD3-較術前有所增加，但同丙組對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這同傅冷西等[8]的研究結果： CD28+CD3+表達：胃癌組（25.80±10.56）%，大腸癌組（28.95±9.29）%，均明顯高于對照組的（0.82±0.98）%（P

綜上所述，在胃癌患者中T細胞亞群的異常表現(xiàn)主要為T細胞共刺激分子（CD28）的無效表達增加，CD4+T細胞的數(shù)量明顯減少。而大腸癌患者的主要特征為CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞數(shù)量增多，所以，T細胞亞群是腫瘤治療效果以及預后判斷有效的一個重要檢測指標。

[參考文獻]

[1] 鮑軼，郭麗.γδT細胞表達共刺激分子及協(xié)同信號通路的研究進展[J].中國醫(yī)學科學院學報，2014，36（2）：223-226.

[2] 王婷，劉翠平，朱然然，等.轉染小鼠可誘導共刺激分子配體基因細胞株的構建及其對T細胞體外活化與增殖的促進作用[J].國際免疫學雜志，2013，36（3）：226-230.

[3] 劉芝翠，元慧杰，曾維宏，等.天皰瘡患者外周血CD4+T細胞活化狀態(tài)及其表面共刺激分子的表達[J].中華皮膚科雜志，2014，47（1）：7-10.

[4] 王瑜，丁曉霞，胡孝彬，等.CHB患者CD4+ T細胞ICOS表達及其與干擾素治療的相互關系[J].中華微生物學和免疫學雜志，2012，32（2）：124-127.

[5] 盧芩，俞婷，張有珍，等.胃癌患者外周血及癌組織中調(diào)節(jié)性T細胞和Foxp3的表達意義[J].中國老年學雜志，2014，34（18）：5140-5142.

[6] 馬俊杰，劉會平，周春祥，等.運用胸腔鏡技術探索細支氣管肺泡細胞癌中醫(yī)證型與Th1/Th2關系[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2013，33（8）：1069-1071.

[7] 溫鵬強，趙俊山，齊中香，等.急性期川崎病患兒CD4+CD25 highFOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞亞群改變及意義[J].中華風濕病學雜志，2015，19（2）：91-96.

[8] 傅冷西，張聲，陳思曾，等.T細胞共刺激分子及其亞群在胃癌和大腸癌組織中表達的意義[J].中國普外基礎與臨床雜志，2008，15（1）：51-55.

篇5

[關鍵詞] eIF-4E基因;表達;非小細胞肺癌;預后

[中圖分類號] R734 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）01（a）-0012-04

Expression of eIF-4E in non-small cell lung cancer and its correlation with prognosis

WANG Binliang LI Xiaobo KONG Yiming ZHANG Rongying

Department of Respiratory Medicine， the Affiliated Huangyan Hospital of Wenzhou Medical University the First People's Hospital of Taizhou City， Zhejiang Province， Taizhou 318020， China

[Abstract] Objective To investigate eIF-4E expression in patients with non-small cell lung cancer （NSCLC）， and its correlation with prognosis. Methods Tumor tissues were collected from 60 NSCLC patients who underwent surgical resection from January 2009 to December 2010 in the Affiliated Huangyan Hospital of Wenzhou Medical University， and 30 adjacent normal tissues samples were also collected. The expression level of eIF-4E in NSCLC tissues and adjacent normal tissues were measured by immunohistochemical method. All the NSCLC patients after resection were subject to treatment with elemene plus cisplatin for more than 2 weeks. A systematic follow-up evaluation was also performed to investigate the correlation of eIF-4E expression level with disease-free survival （DFS） and overall survival （OS）. Results The expression rate of eIF-4E in the tumor tissues （80.00%） was significantly higher than that in adjacent normal tissues （33.33%）， the difference was statistically significant （P < 0.01）. The eIF-4E high expression rate of the patient with age≥60 years and clinical stage of Ⅲ-Ⅳ was higher than whose age<60 years and clinical stage ofⅠ-Ⅱ， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The DFS and OS values of patients with low eIF-4E expression level were significantly larger than those of patients with high eIF-4E expression level， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion eIF-4E is highly expressed in NSCLC tissues; the DFS and OS values of patients with low eIF-4E expression level are significantly larger. High eIF-4E expression level may be an independent predictor of poor NSCLC prognosis.

[Key words] eIF-4E gene; Expression; NSCLC; Prognosis

目前，肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其引起的死亡在各種癌癥導致的死亡中居首位，這與其腫瘤細胞侵襲性和轉移性的生物學特征密切相關[1]。非小細胞肺癌（non-small cell cancer，NSCLS）約占肺癌的80%，大部分患者發(fā)現(xiàn)患有非小細胞肺癌時已屬于晚期，因此化療是治療非小細胞肺癌的主要方法[2]。真核細胞翻譯起始因子-4E（eukaryotic initiation factor-4E，eIF-4E）是相對分子質(zhì)量25 000、堿基序列>50 kb、包括7個外顯子和6個內(nèi)含子的多肽[3]，在許多腫瘤中過度表達，并且與多種惡性腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉移密切相關。eIF-4E在諸如甲狀腺癌、食管癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、肺癌、白血病以及膽管癌等惡性腫瘤和腫瘤旁組織中過度表達并與腫瘤的侵襲轉移能力呈正相關。eIF-4E基因科是肺癌演進過程中重要的標志物，可指導非小細胞肺癌的生物治療并為其臨床分期和預后判斷提供參考價值，在肺癌的復發(fā)和轉移方面有著重要的意義。本研究EIF4E基因在NSCLC的表達及其與療效及預后的關系，現(xiàn)將結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年1月～2010年12月于溫州醫(yī)科大學附屬黃巖醫(yī)院（以下簡稱“我院”）進行外科手術切除的60例非小細胞肺癌組織樣本，同時收集30例癌旁正常組織（距離癌組織大于5 cm以上的組織）作為對照。所有患者術前均未進行過化療或者靶向治療。根據(jù)2002年美國癌癥聯(lián)合會和國際抗癌聯(lián)盟制訂的TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期33例，根據(jù)2002年WHO分類標準，60例非小細胞肺癌組織中鱗癌29例，腺癌31例，低分化36例，中高分化24例。60例非小細胞肺癌組織中男31例，年齡35～83歲，平均（56.47±18.85）歲，女29例，年齡32～86歲，平均（58.75±19.23）歲。30例癌旁正常組織中男18例，年齡34～85歲，平均（58.94±19.62）歲，女12例，年齡33～81歲，平均（55.84±18.52）歲。非小細胞肺癌組織和癌旁正常組織性別、年齡等基本資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會通過，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 60例患者均在術后接受2～4周期的欖香烯（大連金港制藥公司，生產(chǎn)批號：0705131）聯(lián)合順鉑（山東德州制藥廠，生產(chǎn)批號：9050212DC）化療：欖香烯：125 mg/m2，d1、d8;順鉑;30 mg/m2，d1～d3。藥物均靜脈滴注給藥，所有患者均接受至少2周的化療，對于耐受良好患者進行3～4周期的化療。

1.2.2 檢測方法 將獲得標本制成3 μm厚的石蠟切片，常規(guī)脫蠟后使用蘇木精染色和DAB顯色（北京中杉金橋生物科技有限公司），脫水后二甲苯透明并以中性樹脂封固后置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 結果判讀方法 以細胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。免疫組化標準[5]：每例標本均在400倍視野下選取500～1500個腫瘤細胞進行陽性細胞染色強度的觀察并計算陽性細胞的百分數(shù)。按陽性細胞染色強度：無著色為0分;黃色為1分;棕黃色為2分;深棕色或棕褐色為3分。按陽性細胞百分數(shù)：0%～10%為0分，>10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～100%為3分。以按陽性細胞染色強度得分和按陽性細胞百分數(shù)得分之和為最終結果。0～1分：陰性（-），2～3分：弱陽性（+），4～5分：中陽性（++），6分：強陽性（+++）。-～+為低表達，++～+++為高表達。

1.2.4 預后評價方法 無瘤生存期（DFS）[4]：從開始化療至轉移、復發(fā)或死亡之間的時間。總生存時間（OS）[4]：從開始化療至死亡或者最后1次隨訪之間的時間，最后1次隨訪時間為2014年3月20日。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 真核細胞翻譯起始因子-4E在癌組織以及正常肺組織中的表達

非小細胞肺癌組織中eIF-4E基因的陽性表達率為80.00%（48/60），顯著高于癌旁正常組織的33.33%（10/60），差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2=9.38，P < 0.01）。見圖1（封四）。

2.2 真核細胞翻譯起始因子-4E的表達與患者臨床特征的關系

非小細胞肺癌組織中eIF-4E表達與患者的性別、病理類型和分化程度無關（P > 0.05），年齡≥60歲及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者的eIF-4E高表達率明顯高于年齡<60歲及分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。提示IF-4E表達與患者的年齡及臨床病理分期有關。見表1。

2.3 真核細胞翻譯起始因子-4E的表達與患者的無瘤生存期和總生存時間關系分析

與eIF-4E基因高表達患者比較，eIF-4E基因低表達患者的DFS和OS均延長，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖2、3。

圖2 真核細胞翻譯起始因子-4E的表達與患者無瘤生存期的關系

圖3 真核細胞翻譯起始因子-4E的表達與患者總生存時間的關系

3 討論

肺癌是發(fā)病率和病死率增長最快的惡性腫瘤，目前在世界范圍內(nèi)已成為嚴重危害人類生命和健康的主要疾病，肺癌的發(fā)病率和病死率在男性中均占第一位，在女性中，肺癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌。腫瘤的形成是一個復雜的多階段連續(xù)過程，受多種因素的影響。目前對肺癌的治療仍缺乏有效的方法，對于失去手術機會的患者來說藥物治療的有效性緊密關聯(lián)著其生存質(zhì)量及生存期。對肺癌的轉移機制、預后影響因素和藥物對肺癌細胞作用的分子機制的研究可為肺癌的藥物治療提供依據(jù)[6]。eIF-4E是真核細胞翻譯起始和調(diào)控的核心成分，它與mRNA 5'端帽子結構結合，在蛋白質(zhì)翻譯起始過程中發(fā)揮重要作用[7]。有研究進展表明eIF-4E是影響腫瘤的生長、侵襲、演進等生物學行為的腫瘤相關因子，在許多腫瘤中過度表達且與多種惡性腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉移密切相關[8]，其過度表達成為腫瘤惡性改變及判斷其惡性程度的一個重要分子標志，可為抗腫瘤治療提供新思路[9-10]。通過反義mRNA介導降低eIF-4E的表達可以抑制癌細胞的腫瘤特性，有研究表明，可以通過降低eIF-4E的表達抑制頭頸部惡性腫瘤細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞等多種腫瘤細胞的生長、侵襲[11-13]。欖香烯是在中藥姜科植物溫莪術的揮發(fā)油中提取的有效成分，是由α-欖香烯、β-欖香烯、δ-欖香烯和γ-欖香烯組成的復合物，是臨床上一種被廣泛應用并取得了治療效果的廣譜抗腫瘤藥物，β-欖香烯通過阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡來實現(xiàn)其在甲狀腺癌中的抗腫瘤效果[14]，在臨床上其不僅具有較強的抗腫瘤作用，而且可逆轉化療產(chǎn)生的多藥耐藥性[15]。目前關于eIF-4E基因在非小細胞肺癌細胞內(nèi)的表達及其與欖香烯聯(lián)合順鉑治療非小細胞肺癌的效果與預后關系的研究甚少，明確eIF-4E基因在非小細胞肺癌細胞內(nèi)的表達及其與欖香烯聯(lián)合順鉑治療非小細胞肺癌的效果與預后關系可為非小細胞肺癌的治療提供依據(jù)。

本研究結果顯示，eIF-4E基因在非小細胞肺癌組織中呈現(xiàn)高表達，提示eIF-4E基因在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要的作用。eIF-4E的表達與患者的性別、病理類型和分化程度無關。本研究結果亦發(fā)現(xiàn)，年齡較大以及分化等級較高的非小細胞肺癌患者的eIF-4E陽性表達水平明顯增高，提示非小細胞肺癌患者的eIF-4E基因表達與其年齡和腫瘤分化程度密切相關。欖香烯順鉑聯(lián)合化療后eIF-4E低表達患者的DFS和OS均明顯延長。eIF-4E低表達患者欖香烯順鉑聯(lián)合化療效果較eIF-4E高表達患者明顯提高，提示eIF-4E低表達患者對化療更加敏感，因此eIF-4E的低表達是影響非小細胞肺癌化療效果的重要因素，eIF-4E基因的高表達可能成為非小細胞肺癌治療效果及預后不良的預測因子。欖香烯聯(lián)合順鉑化療可能通過組織有活性的eIF-4E基因的低表達抑制細胞的增長，導致致癌細胞的自我繁殖受阻，從而控制癌細胞進展及擴展eIF-4E復合物的形成，起到抑制腫瘤形成、發(fā)展和轉移的目的。eIF-4E基因表達在肺癌治療效果和預后中的作用可從分子學角度找到肺癌診斷和預后的分子指標。

綜上所述，eIF-4E基因在非小細胞肺癌組織存在過表達。欖香烯聯(lián)合順鉑化療后eIF-4E低表達患者的DFS和OS均明顯延長，因此eIF-4E基因的高表達可能成為非小細胞肺癌治療效果及預后不良的預測因子。

[參考文獻]

[1] 張?zhí)m蘭.經(jīng)纖維支氣管鏡冷凍治療中、晚期肺癌致氣道狹窄的護理[J].護士進修雜志，2011，26（19）：1824-1825.

[2] 趙萬，胡鈴敏，王鋮，等.XRCC1、PARP1和APE1多態(tài)性與晚期非小細胞肺癌鉑類藥物化療敏感性的關系[J].南京醫(yī)科大學學報：自然科學版，2011，31（7）：1021-1026.

[3] 孫陽陽，曹友德，劉浩，等.shRNA沉默eIF-4E基因?qū)θ橄侔㎝DA-MB-231細胞VEGF-C表達的影響[J].中國腫瘤臨床，2011，38（4）：200-203.

[4] 蘇彤，趙立軍，常文軍，等.ERCC1、XPD和BRCA1基因多態(tài)與晚期非小細胞肺癌患者鉑類藥物化療效果的相關性[J].第二軍醫(yī)大學學報，2010，31（2）：117-122.

[5] 趙美玲，楊海虹.Ⅱb/Ⅲa期非小細胞肺癌患者腫瘤RRM1蛋白的表達意義[J].重慶醫(yī)科大學學報，2012，37（8）：698-702.

[6] Mathieu KB，Ali H，F(xiàn)ox PS，et al. Radiation dose reduction for CT lung cancer screening using ASIR and MBIR：a phantom study [J]. J Appl Clin Med Phys，2014，15（2）：4515.

[7] Yao CC，Tu YR，Jiang J，et al. β-elemene reverses the drug resistance of lung cancer A549/DDP cells via the mitochondrial apoptosis pathway [J]. Oncol Rep，2014，31（5）：2131-2138.

[8] Martineau Y，Azar R，Müller D，et al. Pancreatic tumours escape from translational control through 4E-BP1 loss [J]. Oncogene，2014，33（11）：2131-2138.

[9] 胡愛俠，孫淼淼，陳奎生，等.乳腺癌組織中mTOR、eIF-4E、4EBPS蛋白的表達及意義[J].中國婦幼保健，2012， 27（31）：4976-4979.

[10] 王曉琳.eIF-4E與腫瘤[J].中國腫瘤生物治療雜志，2010， 17（4）：473-477.

[11] Zhao Y，Pang TY，Wang Y，et al. LMP1 stimulates the transcription of eIF-4E to promote the proliferation，migration and invasion of human nasopharyngeal carcinoma [J]. The FEBS Journal，2014，281（13）：3004-3018.

[12] Ma J，Han LZ，Liang H，et al. Celastrol inhibits the HIF-1α pathway by inhibition of mTOR/p70S6K/eIF-4Eand ERK1/2 phosphorylation in human hepatoma cells [J]. Oncology Reports，2014，32（1）：235-242.

[13] Zhou S，Wang GP，Liu C，et al. Eukaryotic initiation factor 4E （eIF-4E） and angiogenesis：prognostic markers for breast cancer [J]. BMC Cancer，2012，6（3）：231-232.

[14] 紀春梅，甄永占，范曉禹，等.賴氨大黃酸與順鉑聯(lián)合對人肺癌A549細胞系增殖和凋亡的影響[J].基礎醫(yī)學與臨床，2014，34（2）：155-159.

篇6

[關鍵詞] 肺腫瘤；化療；Stathmin；β-tubulin-Ⅲ

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）12-0059-03

2011年肺癌NCCN指南中指出：對于行R0切除的Ⅱ期非小細胞肺癌（NSCLC），術后需行輔助化療（一類證據(jù)），但不同患者對化療的反應及預后差別很大。這可能與個體的生物學差異有關，因此建立循證醫(yī)學基礎上，以藥物基因組學研究為依托的個體化治療已成為未來NSCLC臨床研究的重要方向。目前研究表明，微管基因是許多抗腫瘤藥物的作用位點，其中Stathmin、β-tubulin-Ⅲ表達增高與紫杉醇類藥物的敏感性降低相關。那么它們的表達水平與長春堿類藥物療效的關系怎么樣呢？國內(nèi)外的研究結果很不一致，甚至自相矛盾[1]。

因此，本文篩選出73例接受手術且術后病理明確為Ⅱ期NSCLC患者，術后均給予長春瑞濱聯(lián)合順鉑輔助化療，并檢測腫瘤組織中Stathmin、β-tubulin-Ⅲ蛋白表達水平，隨訪患者無瘤生存時間（DFS）和總體生存時間（OS），統(tǒng)計學分析蛋白表達水平與患者DFS和OS的關系，探討Stathmin及β-tubulin-Ⅲ蛋白表達水平與化療藥物療效的相關性，希望能為個體化治療方案的制定提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標本及資料收集

所有標本均從本院標本庫中篩選（所有入標本庫患者均簽定知情同意書，醫(yī)院倫理委員會討論通過）。術后病理按照2006年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）TNM分期標準進行分期，共篩選2007年9月～2010年6月經(jīng)根治性手術切除的Ⅱ期NSCLC患者73例?；颊叩呐R床特征：男58例、女15例；年齡≤60歲55例、>60歲18例；腫瘤大小≤3 cm2 2例、>3 cm 51例；無淋巴結轉移28例、有淋巴結轉移45例；高-中分化53例、低分化20例；腺癌33例、鱗癌36例、其他病理類型4例。

1.2 輔助化療

患者術后轉至化療科室進行長春瑞濱聯(lián)合順鉑化療，順鉑75 mg/m2分3天給予，長春瑞濱25 mg/m2第1、8天，以上方案每3周重復。其中1例患者因骨轉移只進行2周期化療，4例患者第1周期在本院進行，余3個周期化療當?shù)剡M行，其余患者均在本院完成4個周期的化療。

1.3 隨訪資料（DFS和3年生存率）的收集

均通過電話隨訪，由指定醫(yī)生完成，每3個月1次。共隨訪70例，失訪3例，隨訪率為95.89%。

1.5 結果判斷

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用COX模型進行單因素分析，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并經(jīng)Log-rank檢驗。

3討論

近年來腫瘤的個體化治療越來越受到從事腫瘤臨床和基礎研究的學者的重視。NSCLC患者的治療更是需要這一原則。真正意義的個體化治療是對每一個肺癌患者“量體裁衣”，根據(jù)腫瘤生物學特征和藥物基因組學改變進行針對性的治療。2006年《新英格蘭醫(yī)學雜志》發(fā)表了肺癌個體化化療里程碑式的文章。在該研究中，只有腫瘤ERCC1蛋白低表達者可從輔助化療中獲益[2]。

Stathmin是一種微管不穩(wěn)定蛋白，在細胞周期的不同階段通過磷酸化和去磷酸化作用對細胞微管系統(tǒng)動力平衡的調(diào)節(jié)發(fā)揮十分重要的作用。通過對幾種肺癌細胞的研究表明，微管的聚合狀態(tài)能夠影響其與化療藥物的結合。增加微管的聚合狀態(tài)能夠增加紫杉醇與微管的結合，減少長春堿與微管的結合，從而影響肺癌患者對化療藥物的反應[3]。蒲驍麟等[4]報道：在晚期NSCLC中，免疫組織化學方法測得的Stathmin表達水平與長春瑞濱+順鉑/卡鉑（NP）方案的化療療效負相關。但我們的研究結果表明，Ⅱ期NSCLC術后標本中Stathmin的蛋白表達與患者預后無關，不能作為患者預后的獨立預測因素。其高表達患者與低表達患者相比，DFS和OS均無明顯差異。

那么β-tubulin-Ⅲ的表達水平與長春堿類藥物療效的關系怎么樣呢？國內(nèi)外用免疫組化方法檢測得到的結果很不一致，甚至相互矛盾。Seve等[5]研究了術后接受NP方案輔助化療的ⅠB～Ⅱ期NSCLC或者， 發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中β-tubulin-Ⅲ蛋白高表達者，其無復發(fā)生存期和總生存期均優(yōu)于低表達者。Reiman T探討了JBR.10等4個臨床試驗中1149例已切除NSCLC的患者與β-tubulin-Ⅲ蛋白表達之間的關系，發(fā)現(xiàn)β-tubulin-Ⅲ蛋白表達水平可以作為預測患者預后的指標，但并不能作為預測化療療效的指標[6]。我們的研究結果表明，Ⅱ期NSCLC術后標本中β-tubulin-Ⅲ的蛋白表達與患者預后無關，其高表達患者與低表達患者相比，DFS和OS均無明顯差異。

[參考文獻]

[1] Seve P，Dumontet C. Class Ⅲ beta tubulin expression in non-small cell lung cancer[J]. Rev Mal Respir，2010，27（4）：383-386.

[2] Olaussen KA，DunantA，F(xiàn)ouretP，et al. DNA repair by ER-CC1 in non-small-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy[J]. N Engl J Med，2006，355（10）：983-991.

[3] Singer S，Malz M，Herpel E，et al. Coordinated expression of stathmin family members by far upstream sequence element-binding protein-1 increases motility in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Res，2009， 69（6）：2234-2243.

[4] 蒲驍麟，王峻，許林，等. β-tubulin-Ⅲ和Stathmin與晚期NSCLC化療敏感性的關系[J]. 中國肺癌雜志，2009，12（1）：49-53.

[5] Seve P，Lai R，Reiman T，et al. Class Ⅲ beta-tubulin expression and benefit from adjuvant cisplatin/vinorelbine chemotherapy in operable non-small-cell lung cancer：analysis of NCIC JBR.10[J]. Clin Cancer Res，2007，13（3）：994-999.

[6] Reiman T，Lai R，Veillard AS，et al. Cross-validation study of class Ⅲ beta-tubulin as a predictive marker for benefit from adjuvant chemotherapy in resected non-small-cell lung cancer： analysis of four randomized trials[J]. Ann Oncol，2012，23（1）：86-93.

[7] Alli E，Bash Babula J，Yang JM，et al. Effect of stathmin on the sensitivity to antimicrotubule drugs in human breast cancer[J]. Cancer Res，2002，62（23）：6864-6869.

篇7

【中圖分類號】R711.74【文獻標識碼】B文章編號：1004-7484（2012）-05-0786-02宮頸癌發(fā)病與很多因素有關。筆者對宮頸癌患者進行輔助檢查，以研究TRAIL、Survivin兩項指標在宮頸病變患者疾病中的表達和其與細胞凋亡之間的關系，并進行分析，現(xiàn)總結如下：1.對象與方法

1.1對象：收集2007年-2010年北京市順義區(qū)醫(yī)院74例患者的標本，都為進行陰道鏡室活檢及手術切除的標本。輔助病理檢查均明確診斷，27例患者為宮頸浸潤癌設為宮頸癌組。22例患者為CINII-III級設為CIN II-III級組；25例患者為CIN I級設為CIN I級組。并設立對照組進行研究，對照組15例患者為筆者所在醫(yī)院宮頸正常的患者，其標本為子宮肌瘤手術切除標本。所有宮頸癌患者在手術之前都沒有進行化療、放療的治療。RT-PCR方法檢測Survivin、TRAIL的表達，采用SPSSll.0統(tǒng)計學軟件進行分析。

1.2結果：宮頸癌組的Survivin基因的表達指標l.293±0.438，CIN II-III級組為1.010±0.367，CIN I級組為0.718±0.205，正常宮頸組為0.596±0.229。結果顯示正常宮頸組明顯低于CIN組，CIN組明顯低于宮頸癌組。CIN I級組指標明顯低于CINII-III級組，差異明顯有統(tǒng)計學意義（P0.05)。CINI級組和正常宮頸組比較無明顯差異，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

宮頸癌組TRAIL基因的表達指標為0.441±0.117，CIN II-III級組為0.536±0.150，CIN I級組為0.675±0.211，正常宮頸組為0.940±0.427。宮頸癌組和CIN II-III級組的指標明顯高于正常宮頸組，差異有統(tǒng)計學意義(P

1.3統(tǒng)計學處理：對宮頸癌組織中的各項表達指標進行統(tǒng)計學處理，應用Spearman等級處理，其呈負相關關系表現(xiàn)。相關系數(shù)r=-0.541，P

在人體腫瘤的研究中，Survivin基因在此疾病的檢查中都有明顯表現(xiàn)。其高度表達可讓患者的細胞凋亡受到抑制，從而致使患者的細胞出現(xiàn)了增殖異常的表現(xiàn)。這表明此指標和患者發(fā)生腫瘤疾病有著很大的關聯(lián)。筆者應用RT-PCR的方法對患者的標本進行檢查，經(jīng)對比分析顯示此指標在早期宮頸癌惡性轉化的時候可能會高表達。分析結果還顯示其和宮頸癌疾病地發(fā)生有很大的關系。

TRAIL指標為腫瘤壞死因子，其本身在正?；颊唧w內(nèi)為高表達的表現(xiàn)，其在腫瘤患者及胚胎中的表現(xiàn)為低表達或者為沒有表達。本組資料顯示其在宮頸癌組中的表達指標為最少，這表明患者在發(fā)生腫瘤疾病時TRAIL表現(xiàn)為逐漸地丟失。這表明其和疾病的產(chǎn)生和法則有很大的關系。故對其進行研究可能會有新的突破。

篇8

【摘要】

目的： 研究轉錄產(chǎn)物MALA1的表達水平與早期非小細胞型肺癌(NSCLC)轉移之間的關系。方法： 用實時定量PCR分析了MALA1基因在70例NSCLC患者中的表達情況。 結果： 在對Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC患者超過5年的隨訪期中發(fā)現(xiàn)，MALA1高表達的患者死亡率超過40 %(12/28)，而MALA1低表達的患者死亡率僅有9 %(2/22) （P=0.01)。說明高表達量的MALA1很可能是早期NSCLC 患者預后不良的一個指標。此外，也發(fā)現(xiàn)了MALA1基因與腫瘤組織的轉移有關。結論： MALA1的轉錄水平不僅可以作為預測發(fā)生腫瘤轉移的高危人群的生物學標記，并有望在今后用于早期NSCLC患者的診斷或治療中。

【關鍵詞】 轉移； 非小細胞型肺癌； MALA1； 表達； 扣除雜交

［Abstract］Objective: To investigate the relationship of the expression level of the transcript MALA1 and the metastasis of early stage nonsmall cell lung cancer(NSCLC).Methods： Expression level of MALA1 was analyzed with real time quantitative PCR in 70 patients of NSCLC.Results： In the study of an over fiveyear followup for stage Ⅰand Ⅱ NSCLC patients.It was found that the death rate was more than 40% in patients with high MALA1 expression， whereas only 9%(2/22) in patients with low MALA1 expression died(P=0.01)， suggesting high expression of MALA1 was potentially predictive for a poor prognosis in early NSCLC.Additionally， it was found that the association of MALA1 gene with metastasis depended on the tumor′s histology.Conclusion： These results demonstrated that MALA1 transcript could be used as a biological marker， which may predict high risk for the development of distant metastasis and could be further helpful in improvement of treatment for earlystage NSCLC patients.

［Key words］ metastasis; nonsmall cell lung carcinoma; MALA1; expression; subtractive hybridization

Bronchogenic carcinoma continues to be the leading cause of cancer death in both men and women ［1］.Nonsmall cell lung carcinoma(NSCLC) accounts for approximately 80% of all bronchogenic carcinomas， with SCLC(small cell lung carcinoma) accounting for the remainder［1］.Survival following treatment of NSCLC is stagerelated， and the patients with earlystage disease have the best chance for curative treatment.Although the patients with stage Ⅰ and Ⅱ disease undergo surgical resection of primary carcinomas， a considerable number of them will eventually die of metastatic neoplasm， implying a need for reliable indicator not only to predict survival of the patients with early stage NSCLC， but to provide information for the high risk patients who might benefit from additional therapy［2］.

Up to date， while there are some reports about DNA ploidy and DNA deletions， SPF(Sphase fraction)， PCNA(proliferating cell nuclear antigen)， the gene family of erb B， p53 mutation， EGFR and Ki67 antigen and so on as biological indicators of prognosis in most solid tumors， still have been conflicting results in lung cancer studies［3-9］.Recently， applying a subtractive hybridization procedure， we identified a few new genes whose expression levels were significant differences between NSCLC tumors that were cured by surgical resection and the tumors that subsequently metastasized.An approach to find the genes related to metastasis has been made by a cDNA subtractive hybridization［10］.In the present study， we investigated expression level of the identified genes in the subtracted cDNAs by realtime quantitative RTPCR.The results demonstrated that MALA1(Metastasis associated in lung Adenocarcinoma)， the most frequently appeared gene in identification of subtractive cDNA library， was associated with metastasis in the patients with early stage NSCLC.Therefore it is suggested that expression level of MALA1 could be one valuable molecular biological marker to predict survival for patients in early stage NSCLC.

1 Materials and methods

1.1 Tumor specimens and survival data

Tumor samples were obtained from 70 patients with stage Ⅰ to Ⅱ IA NSCLC at the time of initial surgical resection at Muester university hospital in Germany.Pathohistory examination showed no evidence for remaining tumor.RNA isolation and consequently cDNA preparation， characterization of the cohort of NSCLC patients were described previously ［11］.Parts of the surgically resected tumors were immediately shockfrozen and stored at -70℃ until analysis.All specimens were confirmed to contain a high percentage of tumor cells(>70%).Lung tissue without histological evidence of tumor infiltration was isolated from 12 inpiduals to serve as a control.

1.2 cDNA subtractive hybridization

To exclude differences in gene expression independent on the metastatic potential， all the patients in this study were male with more than five years of followup， all the tumors were at stage I and were completely resected by surgery(R0 resection). Histological classification were confirmed to be adenocarcinomas as described ［11］.The cDNA hybridization procedure was described as the method［11］.In brief， cDNA was prepared and amplified using realtime RTPCR in the ABI Prism 7 700 sequence detector(PE Biosystems， Foster City， CA).One gram of total RNA was reverse transcribed using random primers and Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase(Promega) following the manufacturer′s protocol.cDNA samples were diluted to 100 μl， and 2.5 μl of cDNA were used for each PCR.PCR amplification of the housekeeping gene glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase was used to confirm the quality of cDNA and standardize the total amount of cDNA between different samples.The primers for amplication of the MALA1 gene were: forwardTGAGAGAAAGGACTACAGA， and reverseCTTCCC GTACTTCTGTCTT.

1.3 Statistical Analysis

Statistical Analysis was carried out with SPSS software system(SPSS for Windows Version 10.0).Difference in gene expression level between metastasizing and nonmetastasizing tumors was analyzed statistically with MannWhitney Utest.Cancerspecific survival curves were plotted using the KaplanMeier method and the logrank test was used to assess the statistic significance of differences between groups.Cox proportional hazards regression analysis was used to define gene expression level with independent predictive value with respect to cancer specific survival.

2 Results

2.1 Cloning of MALA1 gene

Two hundred and twentyfive independent sequences were obtained totally in metastatic cDNA library after subtractive hybridization.Twentysix transcripts were found more than once.The most frequently identified transcript was a so far uncharacterized mRNA derived from chromosome 11q13 by DNA homology comparison in Genbank(Accession number AF203815).To obtain more of the sequence of this transcript， we used 5′ and 3′ Rapid Amplification of cDNA(RACE).The full length of this DNA sequence was 737 base pairs.Database searches revealed that this sequence had before been identified only as an EST(Expression sequence terminal).The sequence of the transcript is shown in Fig.1， in which the longest open reading frame for peptides of 52 amino acids(aa) was predicted in both directions.However， it is currently unclear whether this sequence codes for a peptide in vivo.We have named this RNA MALA1.To confirm the reliability of MALA1 expression， this transcript was analyzed in the pooled samples as well as in the subtracted libraries(metastasis minus nonmetastasis and nonmetastasis minus metastasis).These analyses demonstrated for MALA1 an about 3fold higher expression in the pooled sample from metastasizing tumors compared to the nonmetastasizing tumors.

2.2 Expression analysis of MALA 1 gene in patients

The issue of the association of MALA1 gene with metastasis was specific for certain histological subtypes or stages of disease was analyzed.When only stage Ⅰ and Ⅱ patients were included into the analyses， expression levels of MALA1(P=0.017) was significantly higher in metastasizing tumors， and another one was EIF4A1(Eukaryotic translation initiation factor A1)(P=0.031).Also， further analyses indicated that the association of MALA1 gene with metastasis was highly specific for histological subtypes.Twentysix tumors were histologically classified as adenocarcinomas.For three out of five genes(MALA1， EIF4A1， NPCRP) that we identified by our screening method， expressed in metastatic adenocarcinomas was several folds higher than in nonmetastatic adenocarcinomas.Interestingly， no significant differences in gene expression were found for squamous cell carcinomas(n=34).For large cell carcinomas(n=10) mixed results were obtained: whereas some of the genes were clearly enriched in metastasizing tumors(MALA1， EIF4A1， MDM2)， others were clearly not(NPCRP).These data provided evidence that the association of the identified genes with metastasis depended on the tumor′s histology.The relative expression of MALA1 in three types of lung carcinoma was shown in Fig.2.

To evaluate the relationship of the identified metastasisassociated transcripts and survival， all samples were classified for couples of gene as high or low expressers.High or low expression was determined according to the expression level of the samples with regard to median expression of all 70 samples ［11］.KaplanMeier plots indicated that high expression level of MALA1 was associated with significantly worse survival of patients with stage Ⅰ and Ⅱ disease(Fig.3).High expression of MALA1 was highly predictive for a poor prognosis in early disease.Indeed， only 2/22(9%) of low expressing stage Ⅰ and Ⅱ disease patients died during a fiveyear follow up period but more than 40%(12/28) of patients with high levels of MALA1 ultimately died.When a stepwise Cox regression analysis was performed for stage Ⅰ and Ⅱ patients， high levels of MALA1(P=0.02) emerged as independent prognostic parameters for patient survival(Fig.4).

3 Discussion

We identified genes that might be associated with metastasis of NSCLC.The direct comparison of subsequently metastasizing primary tumors with nonmetastasizing primary tumors could offer important advantages.Firstly， it avoided changes in gene expression and metastasis due to the different environments of tumor; secondly， for clinical patient management， the knowledge of differences between metastasizing and nonmetastasizing primary tumors can lead to better prognosis prediction and ultimately to risk adapted therapeutic strategies［12］.Several unknown genes were identified in our study.One of these， a novel transcript on chromosome 11q13， was the most frequently found transcript.To determine the 5′and 3′ends of the sequence we used 5′and 3′ RACE techniques and obtained a 737 base pair fragment that potentially encodes for a 52 amino acid peptide.This transcript was named as MALA1.Currently， it is unclear whether this sequence has peptidecoding potential in vivo， or whether its expression is merely an epiphenomenon for processes on 11q13 that are associated with the metastasisbearing potential of NSCLC tumors.The region 11q13 has been known to be relevant for tumorigenesis and metastasis ［13-15］， there were some important genes， such as CCND1(cyclin D1) and MEN1(Multiple endocrine neoplasia 1) located in this region as well.However， in most cases， 11q13 mutation was associated with lung carcinoma.It might hint that MALA1 in the region of 11q13 was translocated to a new area and affected other genes expression in that area.Nevertheless， even if MALA1 is nonfunctional， it bears strong prognostic potential in early stage NSCLC.

Tumors of patients were grouped for each gene in high vs.low expressing ones based on the expression of tumor in comparison to the median expression of all patients.Kaplan Meier survival plots are shown for patients with adenocarcinoma or squamous cell carcinoma and stage Ⅰ or Ⅱ disease.The logrank test was used to calculate statistical significance

Recently， Clark et al.［16］ published microarray data derived from a melanoma metastasis model.The thymosin β4 gene， identified by them， was also cloned by our strategy.Therefore， we tested to test whether the two other main genes identified by them were associated with metastasis in NSCLC.Thymosin β4 proved to be associated with metastasis and prognosis in our patient group， whereas no significant differences were found for either Rho C or fibronectin.These findings provided another strong hint that the stage and cell type specific gene expression profiles were associated with metastasis.

參考文獻

［1］Lloyd C， Silvestri GA.Mediastinal staging of nonsmallcell lung cancer［J］.Cancer Control， 2001， 8(4): 311-317.

［2］Walker S.Updates in nonsmall cell lung cancer ［J］.Clin J Oncol Nurs， 2008， 12(4):587-596.

［3］Anguiano A， Potti A.Genomic signatures inpidualize therapeutic decisions in nonsmallcell lung cancer ［J］.Expert Rev Mol Diagn， 2007， 7(6):837-844.

［4］Sung HJ， Cho JY.Biomarkers for the lung cancer diagnosis and their advances in proteomics ［J］.BMB Rep， 2008， 41(9):615-625.

［5］Schneider J.Tumor markers in detection of lung cancer ［J］.Adv Clinic Chem， 2006， 42:1-41.［6］ Costa DB， Nguyen KS， Cho BC， et al.Effects of erlotinib in EGFR mutated nonsmall cell lung cancers with resistance to gefitinib ［J］.Clin Cancer Res， 2008， 14(21):7060-7067.

［7］Pujol JL， Simony J， Jolimoy G， et al.Hypodiploidy， Ki67 growth fraction and prognosis of surgically resected lung cancers［J］.Br J Cancer， 1996， 74(6): 964-970.

［8］Dacic S.EGFR assays in lung cancer［J］.Adv Anat Pathol，2008，15(4):241-247.

［9］Yendamuri S， Vaporciyan AA， Zaidi T， et al.3p22.1 and 10q22.3 deletions detected by fluorescene in situ hybridization(FISH): a potential new tool for early detection of nonsmall cell lung Cancer(NSCLC)［J］.J Thorac Oncol， 2008， 3(9):979-984.

［10］Ji P， Diederichs S， Wang W， et al.MALAT1， a novel noncoding RNA， and thymosin beta4 predict metastasis and survival in earlystage nonsmall cell lung cancer［J］.Oncogene， 2003， 22(39):6087-6097.

［11］MüllerTidow C， Metzger R， Kügler K， et al.Cyclin E is the only cyclindependent kinase 2associated cyclin that predicts metastasis and survival in early stage nonsmall cell lung cancer［J］.Cancer Res， 2001， 61(2): 647-653.

［12］Ridley A. Molecular switches in metastasis［J］.Nature， 2000， 406(6795): 466-467.

［13］van Asseldonk M， Schepens M， de Bruijn D， et al.Construction of a 350kb sequenceready 11q13 cosmid contig encompassing the markers D11S4933 and D11S546: mapping of 11 genes and 3 tumorassociated translocation breakpoints［J］.Genomics， 2000， 66(1): 35-42.

［14］Rasio D， Negrini M， Manenti G， et al.Loss of heterozygosity at chromosome 11q in lung adenocarcinoma: identification of three independent regions［J］.Cancer Res， 1995， 55(18): 3988-3991.

篇9

[關鍵詞] 肺癌; Beclin1; p53; p16

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)07-26-02

Expression of Beclinl,p53 and p16 in Different Stages of Lung Cancer

LI Xiaoyan1 WANG Guiqin2

1.Affiliated Fenyang Hospital of Shanxi Medical University,Fenyang 032200,China;2.Teaching and Research Section of Microbiology and Immunology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

[Abstract] ObjectiveTo investigate expression of Beclinl,p53 and p16 in lung cancer tissue of different stages and provide reliable data for early diagnosis of lung cancer and the assessment of its m alignant degree. MethodsWe selected 50 patients with lung cancer from Shanxi Fengyang Hospital between Jan.2009 and Dec.2009. The expression levels of tissue Beclinl,p53 and p16 in different stages of lung cancer were detected and the analysis of variance and LSD-t test were used for their expression and their corresponding stage. ResultsThere were significant differences in the expression levels of Beclinl,p53 and p16 in different stages. ConclusionThe expression levels of Beclin1,p53 and p16 in the tissue of lung cancer in different clinical stages are different. With the increase in staging of lung cancer,the p53 expression level is increased,the p16 expression level is down-regulated and the Beclin1 expression level is decreased.

[Key words]Lung cancer; Beclin1; p53; p16

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。多數(shù)患者在確診時已失去根治的機會,早期發(fā)現(xiàn)和診斷肺癌及其惡性度的評估對其治療和預后都有重要意義。肺癌早期診斷與惡性度評估分子標志物的篩選是臨床腫瘤工作者亟待解決的課題[1,2]。

自噬現(xiàn)象是一種高度保守的細胞行為,存于所有的物種。研究表明Beclin1是唯一發(fā)現(xiàn)的哺乳動物的自噬基因,是自噬的執(zhí)行者;又是一類新的抑癌基因,只有在雙等位染色體都表達時才發(fā)揮抑癌作用。Beclin1基因的缺失性突變導致自發(fā)性腫瘤發(fā)生率提高。Beclin1基因表達異常(減少或缺失)是否為腫瘤細胞早期事件?如果研究結果是肯定的,那么我們可以將其作為早期診斷的指標之一,甚至有可能成為高危人群篩選指標之一。

p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關性最高的腫瘤抑制蛋白,在多種惡性腫瘤中有異常表達。正常狀態(tài)下,其效應分子的基因產(chǎn)物可防止細胞轉化癌變,當發(fā)生突變時可成為一個直接的腫瘤基因,在細胞惡性轉化中起作用,被認為是早期癌標志。p16蛋白是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個直接控制細胞增殖周期的固有蛋白,通過調(diào)節(jié)Rb蛋白的活性防止細胞過度增殖。p16蛋白的丟失、突變廣泛存在于人類惡性腫瘤中,因此p16蛋白既可作為早期診斷癌變的指標,也可用于評估預后。

本文旨在通過分析處于肺癌各個分期的50例肺癌患者的Beclin1、p53、p16的表達情況,探討B(tài)eclin1、p53、p16與肺癌惡性度的關系,從而為臨床診斷、治療肺癌提供依據(jù)[3]。

1 資料與方法

1.1 標本與來源

選擇2009年1～12月在山西省汾陽醫(yī)院就診的肺癌患者,取肺組織50例(每期10例)。入選條件和排除條件如下:(1)手術切除標本。所有標本均經(jīng)病理學診斷證實,術前均未接受放、化療。(2)均經(jīng)病理確診為肺癌。(3)另取癌旁正常肺組織(至少距癌邊緣3cm)。(4)病理排除合并炎性改變等的可能。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 依據(jù)1997年UICC公布的肺癌TNM分期,同時結合臨床、胸部CT、X線檢查將入選病例進行分組:按腫瘤分期0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分為5組,各組年齡、性別等控制情況基本匹配。

1.2.2 實驗方法 肺癌及相應癌旁手術標本經(jīng)10%甲醛固定,石蠟包埋連續(xù)切片,蘇木精-伊紅染色,進行組織病理學觀察后,采用PV-9000通用型二步法免疫組化法進行Beclin1、p16和p53基因表達水平的檢測。

1.2.3 結果判斷 定性:光學顯微鏡觀察Beclin1、p16和p53,陽性著色部位分別為細胞漿和細胞核,呈棕黃色,而陰性細胞不著色而顯示復染的藍色。定量:每張切片隨機地在200倍顯微鏡下取5個視野,錄入GD-6多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng),測定Beclin1、p53、p16的積分光密度。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS10.0軟件包對Beclin1、p53、p16的表達情況與其各自對應的分期分別進行方差分析與LSD-t檢驗。

2 結果

肺癌分期的五組Beclin1、p53、p16的表達情況差別有統(tǒng)計學意義(P

本研究顯示:各期肺癌組織中Beclin1、p53、p16表達的高低與肺癌的臨床分期有關聯(lián);隨肺癌分期的增高,p53表達量增高,p16表達量下調(diào),同時Beclin1表達量降低。見圖1。

3 討論

國內(nèi)外學者對Beclin1的研究大多集中在宮頸癌等生殖系統(tǒng)腫瘤,對其與肺癌的關系研究很少。對于p53、p16及Beclin1的測定方法大多是RT-PCR法、Western blot等,這些方法只能判斷陽性病例而不能定量診斷[4,5]。Beclin1與肺癌相關性的研究目前國內(nèi)報道較少,與肺癌病理分期相關的研究尚未見報道。

本文通過檢測不同分期肺癌組織中Beclin1、p53、p16的表達情況,揭示自噬蛋白與凋亡蛋白在肺癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用,研究三者之間及其與肺癌臨床病理分期的關系,為早期診斷肺癌提供理論依據(jù)。通過研究了解肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中Beclin1、p53、p16的表達情況,通過對肺癌組織中Beclin1、p53和p16表達的定量分析揭示自噬蛋白與凋亡蛋白在肺癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用,為腫瘤早期診斷提供一條新思路。

[參考文獻]

[1] Gorski DJ,Chittaranjan S,Pleasance ED,et al. A SAGE approach to discovery of genes involved in autophagic cell death[J]. Curr Biol,2003,13(4):358-362.

[2] Tan EM,Zhang J. Autoantibodies to tumor-associated antigens:reporters from the immune system[J]. Immunol Rev,2008,22(5):328-340.

[3] Gadducci A,Ferdeghini M,Buttitta F,et al. Assessment of the prognostic relevance of serum anti-p53 antibodies in epithelial ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol,1999,72(3):76-81.

[4] Tang R,Ko MC,Wang JY,et al. Humoral response to p53 in human colorectal tumors:a prospective study of 1,209 patients[J]. Int J Cancer,2001,94(13):859-863.

篇10

關鍵詞：  S100A2；喉鱗癌；免疫組織化學方法

1  材料與方法

1.1  實驗材料與儀器

1.1.1  資料  收集40例瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科2005年1月至2007年5月行手術切除后經(jīng)病理學診斷為喉鱗狀細胞癌（lscc）的存檔蠟塊。所有病例術前均行喉部高分辨率CT檢查，均未行放化療治療。40例喉鱗癌中，男性39例，女性1例,年齡45～71歲，平均61.8歲；病程2～36個月。將病例按年齡、不同分化程度、有無頸淋巴結轉移、TNM分期進行分組。年齡以60歲為界，分為兩組；按組織病理學分級分為高分化鱗癌22例，中分化鱗癌10例，低分化鱗癌8例；有淋巴結轉移22例，無頸淋巴結轉移18例；按1997年國際抗癌協(xié)會（UICC）制定的TNM分期， T1～T2期有14例，T3～T4期有26例;將40例同期手術切除經(jīng)病理證實無腫瘤浸潤的癌旁喉黏膜標本作為對照組。

1.1.2  主要實驗試劑  兔抗人多克隆S100A2抗體（購于sigma公司），SP免疫組化試劑盒、DAB顯色盒購于（北京中杉生物技術有限公司）。

1.1.3  主要實驗儀器  輪轉式切片機（Leica-RM2035 產(chǎn)于德國），OLYMPUS顯微鏡（BX-50，日本），CS2002-1恒溫干燥箱孵育盒 （重慶四達實驗儀器廠），SAYYO低溫冰箱-20℃(MDF-330.產(chǎn)于日本），病理圖像分析處理系統(tǒng)(GD-8,中國)。

1.2  實驗方法  所有樣本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為4μm。免疫組化染色按試劑盒說明進行，組織切片經(jīng)脫蠟、水化、微波處理，進行抗原修復，阻斷內(nèi)過氧化物酶30 min ，PBS 沖洗3 次，每次3min，非特異性血清封閉30 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min，抗原一抗4℃孵育過夜，PBS 沖洗3 次，每次3 min，二抗孵育30 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min，DAB 顯色，蘇木素復染細胞核，脫水，透明，封片，鏡檢及攝像。采用預實驗反復多次證實均呈陽性的組織切片為陽性對照，空白對照以PBS代替一抗。

1.3  結果判斷及資料整理  S100A2陽性結果判定：細胞核或核與胞漿染成黃色或棕黃色或彌漫的棕黃色為陽性細胞；每張切片選擇典型部位，隨意選5個不同高倍視野(400×)計數(shù)，以平均數(shù)做最后判定。根據(jù)陽性細胞數(shù)占視野中總細胞數(shù)比例進行判定：陽性細胞數(shù)≤10％為陰性結果，陽性細胞數(shù)≥ 11%，為陽性結果。切片均經(jīng)2位病理醫(yī)生盲法獨立計數(shù)閱片,兩者不一致時重新計數(shù)。最后根據(jù)免疫組化染色編號，對應的病理號及住院號整理檢測結果。

1.4  統(tǒng)計學處理  所得實驗數(shù)據(jù)通過SPSS14.0軟件進行統(tǒng)計學分析，檢驗水準а=0.05。計數(shù)資料采用χ2檢驗對結果進行統(tǒng)計學處理，比較其差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2  結果

   

60例標本全部進入結果分析，S100A2蛋白經(jīng)免疫組化染色后于細胞核或細胞核與細胞質(zhì)，出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽性表現(xiàn)。