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篇1

[關(guān)鍵詞] 蛋白酶體抑制劑；泛素-蛋白酶體通路；肺癌；作用機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）08（b）-0038-04

[Abstract] The ubiquitin-proteasome pathway is the principle pathway for intracellular protein degradation. Research shows that ubiquitin-proteasome pathway plays a significant role in the genesis and progression of malignancy by regulating many processes of cellular biology. Proteasome inhibitors targeting the ubiquitin-proteasome pathway can inhibit tumorous cellular growth， becoming a novel class of potent and effective antitumor agents. Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths globally. The study about the effect of proteasome inhibitors on lung cancer is ongoing. The mechanisms are complicated， relating to the down-regulation of NF-κB， cell cycle control， PTEN/PI3K/AKT pathway， the regulation of P53 and others. The recent advances about proteasome inhibitors in the treatment of lung cancer is going to be reviewed in this paper.

[Key words] Proteasome inhibitor； Ubiquitin-proteasome pathway； Lung cancer； Mechanism

泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)降解的重要通路，此通路選擇性降解細(xì)胞內(nèi)受損及錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，并對(duì)各種短壽命的功能蛋白具有快速降解作用。80%～90%的細(xì)胞內(nèi)蛋白均通過此途徑降解，其中包括細(xì)胞周期調(diào)控因子、基因轉(zhuǎn)錄因子、癌基因蛋白等[1]。UPP通過對(duì)上述蛋白的降解，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、存活和凋亡，在人體諸多生理過程中發(fā)揮重要作用，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等，對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義，其功能的改變和異常能直接導(dǎo)致或誘發(fā)人類的許多重要疾病[2]。蛋白酶體抑制劑通過抑制蛋白酶體活性而阻斷UPP，具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，目前已成為抗腫瘤治療的研究新熱點(diǎn)。本文就UPP、蛋白酶體抑制劑在肺癌治療中的進(jìn)展綜述如下：

1 泛素-蛋白酶體通路的組成

UPP由泛素、泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3、26S蛋白酶體、去泛素化酶等組成。此途徑的核心是26S蛋白酶體，它是一個(gè)多催化復(fù)合物，由20S核心蛋白酶和兩端各一的19S調(diào)節(jié)亞基組成。20S核心蛋白酶是蛋白酶體復(fù)合物的水解核心，具有胰蛋白酶、糜蛋白酶和胱天蛋白酶活性。UPP在降解靶蛋白時(shí)，首先要實(shí)現(xiàn)靶蛋白的泛素化，即若干泛素經(jīng)E1、E2、E3的作用與靶蛋白相連[3]。只有泛素化的靶蛋白方可被19S調(diào)節(jié)亞基識(shí)別，進(jìn)而進(jìn)入20S核心蛋白酶體內(nèi)部，被降解成3～22個(gè)氨基酸的小肽段，在細(xì)胞內(nèi)回收利用。泛素分子則被泛素解離酶從靶蛋白上解離下來，重復(fù)利用[4]。

UPP通過上述過程，上調(diào)或下調(diào)某些抑癌基因、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期素等的表達(dá)以及改變MHC-Ⅰ限制性抗原肽的生成[5]，參與惡性腫瘤多種細(xì)胞生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)，從而參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

2 蛋白酶體抑制劑

蛋白酶體抑制劑按其不同的末端親電基團(tuán)可以分為硼酸肽類、環(huán)氧酮肽類、醛基肽類和乙烯基砜肽類等多種類型，以上均屬于合成化合物，此外還有天然蛋白酶體抑制劑如乳胞素、3，4-二氯異香豆素（DCI）、阿克拉霉素（Aclacinomycin）、PR-39等。按其作用方式不同，蛋白酶體抑制劑又可分為可逆性和不可逆性兩種。醛基肽類是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用的蛋白酶體抑制劑，如MG132，是可逆性蛋白酶體抑制劑，其進(jìn)入細(xì)胞速度快，能抑制ChT-L活性、半胱氨酸和絲氨酸蛋白酶活性，但醛基肽類化合物是非選擇性的，會(huì)抑制其他酶類，且穩(wěn)定性較差，易被氧化。

目前臨床上研究最多、最完善的是硼替佐米，它屬于硼酸肽類，是一種具有高選擇性、可逆性的蛋白酶體抑制劑。硼替佐米（PS341、萬珂）于2003年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，具有較廣的抗腫瘤譜，除了用于治療多發(fā)性骨髓瘤、套細(xì)胞淋巴瘤外，它對(duì)其他腫瘤細(xì)胞，如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等均具有細(xì)胞毒性，可引起腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)[6]。近年來，研究者對(duì)硼替佐米進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到了新型硼酸肽類蛋白酶體抑制劑YSY-01A，研究表明，它在多種腫瘤細(xì)胞中均具有抑制增殖的作用[7]，其LD50值高于硼替佐米3倍，且毒副作用更低，有望成為新的研究熱點(diǎn)。此外，環(huán)氧酮肽類化合物卡非佐米也于2012年被FDA批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤的治療。

3 蛋白酶體抑制劑與肺癌

肺癌在人類癌癥死亡中居于首位，嚴(yán)重危害人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2008年，世界范圍內(nèi)有160萬人被診斷為肺癌，同年有140萬人死于此病。我國(guó)每年大約超過60萬人死于此病。而其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）大約占肺癌所有患者的80%。因此，為了使這個(gè)龐大的患者群體得到更好的治療，能否制訂出有效的抗腫瘤方案尤為重要。蛋白酶體抑制劑對(duì)多種血液系統(tǒng)腫瘤及實(shí)體瘤均有療效，有關(guān)蛋白酶體抑制劑對(duì)肺癌，特別是NSCLC治療研究亦不在少數(shù)，但其作用機(jī)制仍不完全明確。

3.1 作用機(jī)制

3.1.1 下調(diào)核因子κB 核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）普遍存在于真核細(xì)胞中，對(duì)超過200種基因具有調(diào)節(jié)作用，其中包括細(xì)胞黏附分子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、凋亡調(diào)節(jié)基因如Bcl-2、Bcl-xL等，這些基因與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移息息相關(guān)。故而NF-κB的下調(diào)對(duì)抑制腫瘤的生長(zhǎng)或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用[8]。通常情況下，NF-κB以二聚體形式與其抑制蛋白IκB相結(jié)合，以無活性狀態(tài)存在于細(xì)胞中。但當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)菌、病毒、應(yīng)激狀態(tài)等刺激時(shí)，IκB被UPP降解，NF-κB從而被游離、激活[9]，發(fā)揮對(duì)其下游轉(zhuǎn)錄基因的調(diào)控作用，最終發(fā)生腫瘤生長(zhǎng)因子表達(dá)增多，血管生成，細(xì)胞凋亡減少，誘發(fā)腫瘤可能[10]。蛋白酶體抑制劑可抑制IκB降解，從而阻止上述過程，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，控制細(xì)胞凋亡，抑制血管生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤治療的各方面靶點(diǎn)均有作用。

3.1.2 對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控 在真核細(xì)胞中，細(xì)胞周期由細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期依賴性激酶（CDKs）調(diào)節(jié)。不同的CDK對(duì)應(yīng)相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的各個(gè)階段。而CDKs的抑制物（CKIs）則限制CDKs活性及細(xì)胞周期進(jìn)程。P21WAF1/Cip1是眾多CKIs中的一種，其在細(xì)胞周期G2/M期阻滯中發(fā)揮作用。P27Kip1是另一種CKI，可以阻止細(xì)胞從G1期到S期，上述二者都是UPP的降解底物[11]，當(dāng)?shù)鞍酌阁w被抑制時(shí)，CKIs不能被降解，使細(xì)胞分裂停止于各個(gè)不同時(shí)期，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤生長(zhǎng)[1]。Ling等[12]在PS341作用于NSCLC H460細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，在PS341作用下G2/M期細(xì)胞增多，研究中亦發(fā)現(xiàn)G2/M期阻滯與周期蛋白A1、周期蛋白B及其激酶的增加有關(guān)。

抗凋亡基因Bcl-2與腫瘤細(xì)胞凋亡抑制及化療抑制有關(guān)，蛋白酶體抑制劑能克服Bcl-2介導(dǎo)的凋亡抑制，同時(shí)上調(diào)Bcl-2家族中的促凋亡分子Bax，降低Bcl-2/Bax的比值，促使腫瘤細(xì)胞凋亡。Ling等[13]在PS341作用于NSCLC的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，G2/M期細(xì)胞的數(shù)目與Bcl-2的磷酸化程度相一致，提示蛋白酶體抑制劑通過磷酸化作用下調(diào)NSCLS細(xì)胞中的Bcl-2水平，這也是癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

3.1.3 P53的調(diào)控 抑癌基因P53在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到化學(xué)或電離輻射，DNA發(fā)生損傷時(shí)，P53經(jīng)磷酸化或其他途徑活化，從其抑制物MDM2中脫離，P53蛋白大量積累，誘導(dǎo)P21WAF1/CIP1轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞周期停滯，并阻止DNA合成，同時(shí)修復(fù)損傷的DNA。許多腫瘤中都存在P53基因突變，使P53不能表達(dá)或無法誘導(dǎo)下游的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，DNA無法修復(fù)，異常的DNA傳遞給子代細(xì)胞，逐步積累，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。P53通過UPP降解，故而蛋白酶體抑制劑可使P53積累，且有穩(wěn)定P53的作用[14]。既往研究認(rèn)為，P53誘導(dǎo)NSCLC停滯于G2/M期[15]，從而阻止腫瘤的發(fā)生。但有研究通過使用除P53外，其余基因完全相同的人類癌細(xì)胞，重新評(píng)估P53在PI誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用[16]，該研究發(fā)現(xiàn)，硼替佐米和MG132誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡均不依賴P53。Ling等[12]在NSCLC的研究中也發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用僅部分依賴P53功能，而細(xì)胞周期發(fā)生G2/M期停滯并不依賴P53。

3.1.4 PTEN/PI3K/Akt 通路 PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是腫瘤生長(zhǎng)的重要通路，PI3K的激活是此通路的基礎(chǔ)，活化的PI3K可將信息傳遞給通路的第二信使PIP3，接著活化Akt及PDK1，通過刺激其下游作用因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。PTEN基因是與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切的抑癌基因，它可通過PIP3去磷酸化拮抗PI3K/Akt通路[17]。Sherwood等[18]在硼替佐米致結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，PTEN蛋白表達(dá)水平與硼替佐米作用時(shí)間正相關(guān)，隨PTEN蛋白表達(dá)增加，Akt蛋白表達(dá)降低，從而抑制通路活性。Sun等[19]在YSY-01A抑制NSCLC A549細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制的研究中亦發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞增殖抑制時(shí)，PTEN的表達(dá)增加，PI3K表達(dá)減少。

3.1.5 抑制血管生成 腫瘤直徑達(dá)到1～2 mm后，若無新生血管生成來提供營(yíng)養(yǎng)，則不能繼續(xù)生長(zhǎng)[20]。新生的血管不僅可以為腫瘤輸注養(yǎng)分、排除廢物，還提供了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移途徑。實(shí)驗(yàn)證明，蛋白酶體抑制劑通過阻礙NF-κB入細(xì)胞核的過程，降低其活性，進(jìn)而下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的表達(dá)，使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）減少，抑制血管生成[21-22]，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

3.1.6 其他 蛋白酶體抑制劑的抗腫瘤機(jī)制復(fù)雜，除上述機(jī)制外，蛋白酶體抑制劑還可促進(jìn)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）誘導(dǎo)的凋亡[23]，此過程與蛋白酶體抑制劑下調(diào)NF-κB，誘導(dǎo)caspase-8和caspase -9活化，上調(diào)死亡受體DR4/DR5有關(guān)。此外，PIs還可逆轉(zhuǎn)化療藥物的耐藥性、增加放化療敏感性，緩解腫瘤惡病質(zhì)，這些均為蛋白酶體抑制劑對(duì)肺癌的治療提供了基礎(chǔ)。

3.2 聯(lián)合治療

放化療是肺癌治療中的重要手段，但肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性、毒副作用以及放療過程的輻射及患者耐受性是治療過程中的一大難題。上文陳述了蛋白酶體抑制劑在肺癌中的抗腫瘤機(jī)制，為肺癌的治療提供新思路。目前關(guān)于硼替佐米對(duì)肺癌治療的臨床研究較多見，硼替佐米耐受良好，但單一用藥效果較溫和。Li等[24]在硼替佐米對(duì)初次化療的已發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的NSCLC患者治療的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然患者耐受良好，但未見疾病客觀緩解，其療效并不明顯。另一些研究也表明，患者對(duì)硼替佐米耐受良好。Piperdi等[25]在硼替佐米聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)劑量的卡鉑及貝伐單抗治療晚期NSCLC的研究中發(fā)現(xiàn)，硼替佐米劑量分為1.3、1.6、1.8 mg/m2三組，在前3周中，三組中所有16例患者均未出現(xiàn)與硼替佐米劑量相關(guān)的不良反應(yīng)，硼替佐米與當(dāng)前化療方案相結(jié)合，則顯示出令人驚喜的療效。Davies等[26]在硼替佐米聯(lián)合吉西他濱/卡鉑治療晚期NSCLC的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，患者生存受益，中位生存期為11個(gè)月，1年和2年生存率分別為47%和19%。Zhao等[27]在硼替佐米聯(lián)合紫杉醇、卡鉑及胸部放療的治療研究中也提示該方案可潛在獲益，其中位存活期為25個(gè)月，12個(gè)月生存率為73%，但血液系統(tǒng)方面的副作用，如白細(xì)胞減少、中性粒細(xì)胞減少等有所增加。

4 小結(jié)與展望

蛋白酶體抑制劑對(duì)肺癌的治療作用已經(jīng)取得了一定的研究成果。許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)蛋白酶體抑制劑對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用，目前的臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)蛋白酶體抑制劑對(duì)肺癌的治療具有很高的可行性。隨著蛋白酶體抑制劑的作用機(jī)制以及在臨床應(yīng)用方面研究的不斷深入，在肺癌方面的作用也會(huì)進(jìn)一步明確，可能成為治療肺癌的新方法。

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篇2

【關(guān)鍵詞】核糖體核糖體S6Ks蛋白激酶;腫瘤

蛋白分子的磷酸化是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過程中最重要的調(diào)節(jié)方式之一。各種蛋白激酶通過將ATP的γ磷酸基轉(zhuǎn)移到底物特定的氨基酸殘基上,使底物蛋白磷酸化,這種磷酸化作用不僅可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性,還可以使傳導(dǎo)信號(hào)逐級(jí)放大,最終引起細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)?？梢赃@么說,細(xì)胞內(nèi)所有的活動(dòng)都離不開蛋白激酶的參與,而激酶的磷酸化作用也正體現(xiàn)了細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中最為有效的調(diào)節(jié)方式。核糖體S6Ks蛋白激酶作為cAMP-cGMP依賴性激酶和PKC激酶超家族成員之一,在細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖和細(xì)胞能量代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。激酶的活性調(diào)節(jié)首先是通過一系列絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)的磷酸化和去磷酸化作用實(shí)現(xiàn)的,生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素等細(xì)胞外刺激信號(hào)可引起激酶的快速活化,而生長(zhǎng)抑制物如類固醇等則能抑制激酶的活性。另一方面,活化的S6Ks蛋白激酶又可以將上游信號(hào)傳導(dǎo)給多種效應(yīng)底物,其中比較著名的就是核糖體蛋白S6,后者作為真核細(xì)胞中核糖體40S亞基的組成元件,通過增加具有5’末段寡嘧啶序列結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯,達(dá)到誘導(dǎo)多種蛋白組分合成的作用。

1核糖體蛋白S6Ks概述

S6Ks最初分離自有絲分裂劑刺激的瑞典鼠源3T3細(xì)胞系,經(jīng)純化、克隆、表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)RPS6KB1基因定位在17號(hào)染色體長(zhǎng)臂23位,由于選擇性mRNA剪切和不同的翻譯起始位點(diǎn)得到兩個(gè)激酶同工型,分別命名為S6K1和S6K2。根據(jù)核漿定位的不同又將激酶區(qū)分為核定位的S6K1 I,S6K2 I和漿定位的S6K1 II,S6K2 II,兩者的主要區(qū)別在于前者的氨基末端存在有額外的核定位信號(hào)。核漿表達(dá)轉(zhuǎn)換是所有胞漿型S6K激酶具有的共同特點(diǎn)之一,表現(xiàn)為在血清饑餓的細(xì)胞中S6Ks II型主要存在于胞漿內(nèi),而當(dāng)有血清或生長(zhǎng)因子刺激時(shí),S6K II型激酶將轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi),盡管這一改變的具體機(jī)制不甚明了,但其所存在的意義已經(jīng)受到多方關(guān)注。研究表明S6Ks在控制細(xì)胞大小、生長(zhǎng)和繁殖中發(fā)揮著重要作用,通過協(xié)同作用方式達(dá)到組織器官的正常發(fā)展。

2S6Ks分子的活化機(jī)制

首先,在我們具體研究S6K1磷酸化信號(hào)通路之前,我們有必要簡(jiǎn)述一下S6K1蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)組成,以及每個(gè)引起激酶活化的磷酸化位點(diǎn)及其之間的相互作用方式。 S6K1蛋白激酶主要由三個(gè)部分組成(圖1),他們分別是:位于羧基末端的自主調(diào)控區(qū),具有高度同源性的酸性氨基末端以及位于兩者之間的絲氨酸/蘇氨酸激酶催化區(qū)域(1)。

2.1S6K1多磷酸化位點(diǎn)到目前為止,在內(nèi)源性S6K1蛋白激酶中已基本確定了八個(gè)主要的磷酸化位點(diǎn)(1)。其中位于激酶羧基末端自主抑制區(qū)內(nèi)的Ser411、Ser418、Thr421和Ser424四個(gè)磷酸化位點(diǎn)是最先被確定下來的,被稱作S/T-P位點(diǎn),在有絲分裂原刺激的S6K1活化中發(fā)揮重要作用。這些位點(diǎn)具有的共同特點(diǎn)是在他們的+1位上有一脯氨酸而在-2位上有一疏水性氨基酸殘基,這一結(jié)構(gòu)可以被一系列脯氨酸作用激酶,例如Erk1和Erk2、壓力活化蛋白激酶和Cdc2所識(shí)別,進(jìn)而使位點(diǎn)得以磷酸化。隨后研究又發(fā)現(xiàn)了擁有相同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的Ser371位點(diǎn)和Thr229、Thr389、Ser404位點(diǎn)(2),其中Thr229位于激酶活化環(huán)中而其余三者位于連接催化區(qū)和自主抑制區(qū)的激酶鉸鏈區(qū),這些后期發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)均表現(xiàn)出對(duì)免疫抑制劑rapamycin和真菌代謝產(chǎn)物wortmannin的高度敏感,在激酶活化過程中具有重要作用。突變分析揭示Thr229、Thr389、Ser404位點(diǎn)有一共同特點(diǎn)即在它們的側(cè)位上均有一些龐大的芳香族氨基酸,將這三個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)變成酸性或者中性氨基酸會(huì)發(fā)現(xiàn)Thr229和Thr389具有重要調(diào)控作用,而Ser404僅表現(xiàn)一定調(diào)節(jié)功能。同源性分析還發(fā)現(xiàn)Thr229、Thr389、Ser371位點(diǎn)以及他們所定位區(qū)域在大部分Ser/Thr激酶的AGC超家族成員中高度保守,相反地,自主抑制區(qū)以及S6K1的羧基末端結(jié)構(gòu)在AGC家族的其他成員中卻顯著缺失。這一不同使人們對(duì)自主抑制區(qū)在S6K1活化過程中的具體作用產(chǎn)生了疑問,為此多種S6K1蛋白截?cái)囿w和不同位點(diǎn)突變體被相應(yīng)構(gòu)建出,用以分析在各種不同結(jié)構(gòu)中,S6K1蛋白活性情況的改變。比較突出的發(fā)現(xiàn)是當(dāng)截?cái)郤6K1的氨基末端時(shí),將嚴(yán)重影響到激酶的活性以及有絲分裂原誘導(dǎo)的Thr229和Thr389位點(diǎn)的磷酸化,而這種影響在同時(shí)移除掉激酶羧基末端或缺失掉自主抑制區(qū)的情況下得以解救。這些結(jié)果說明自主抑制區(qū)或者說這些磷酸化位點(diǎn)定位的區(qū)域在調(diào)控S6K激酶活性以及Thr229和Thr389位點(diǎn)磷酸化的過程中起著重要作用。

2.2磷酸化調(diào)節(jié)許多研究已表明S6K蛋白激酶的活化是由多磷酸化位點(diǎn)級(jí)聯(lián)反應(yīng),協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的,它反映出分子水平上錯(cuò)綜而復(fù)雜的交互關(guān)系。首先,突變掉氨基末端的p70S6KΔN54突變體,其對(duì)有絲分裂原反應(yīng)活性的降低可被羧基末端同時(shí)缺失的行為所解救(3),而突變掉羧基末端四個(gè)自主抑制S/T-P位點(diǎn)的行為僅可部分解救其活性損失,這說明自主抑制區(qū)在調(diào)控p70S6K蛋白活性和Thr229磷酸化水平中起重要作用卻又不完全(1)。其次當(dāng)突變掉羧基末端104個(gè)氨基酸殘基得p70S6KΔC104突變體,發(fā)現(xiàn)Thr229基礎(chǔ)磷酸化水平有所升高而Thr389未受影響,但突變體本身卻表現(xiàn)出低激酶活性,當(dāng)受到血清刺激反應(yīng)時(shí),Thr229和Thr389的磷酸化水平均提高且相應(yīng)的激酶被活化(3),這說明羧基末端的缺失將打破對(duì)Thr229磷酸化的調(diào)節(jié)卻無法使激酶活化。進(jìn)一步的Thr389位點(diǎn)突變反應(yīng)發(fā)現(xiàn)由谷氨酸替代Thr389可以使基礎(chǔ)p70S6K蛋白激酶活性和Thr229的磷酸化水平得以提高,而由丙氨酸替代Thr389后則使p70S6K活性及Thr229相對(duì)于血清的磷酸化反應(yīng)完全喪失(1),這可說明在p70S6K蛋白激酶中,Thr229的磷酸化受到自主抑制區(qū)和Thr389位點(diǎn)的協(xié)同調(diào)節(jié)作用。此外還有相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺失掉氨基和羧基末端的突變體p70S6KN54C104對(duì)rapamycin不再敏感,卻保留了對(duì)wortmannin的敏感性,而缺失羧基末端的p70S6KΔC104突變體卻仍然保持著對(duì)rapamycin的敏感性,將這些發(fā)現(xiàn)結(jié)合在一起可以得出這樣的假設(shè),rapamycin-FKBP12復(fù)合物增加了某種負(fù)性影響因子的活性,例如磷酸酶,而這一因子的活性作用正需要p70S6K的氨基末端執(zhí)行其抑制功能。相反的,在PI3K依賴的信號(hào)通路中,則可能是某一正性影響因子受到調(diào)控,因?yàn)閜70S6KN54C104仍保有對(duì)wortmannin的敏感性。綜上所述,我們可為p70S6K蛋白激酶活化途徑建立如下一個(gè)級(jí)聯(lián)模型(如圖2):首先刺激信號(hào)影響自主抑制區(qū)的S/T-P位點(diǎn),使其磷酸化;他們的活化將打破激酶羧基和氨基之間的相互作用,暴露出鏈結(jié)構(gòu)區(qū)的Thr389位點(diǎn),使此位點(diǎn)在氨基末端功能的協(xié)調(diào)下易于被磷酸化,但此時(shí)蛋白仍處于失活狀態(tài);而后Thr389位點(diǎn)的磷酸化將完全暴露激酶活化環(huán)中的Thr229位點(diǎn),此位點(diǎn)的最終磷酸化將激活S6K蛋白活性,發(fā)揮其功能。

2.3其他調(diào)節(jié)位點(diǎn)盡管上述結(jié)論使我們建立了一個(gè)p70S6K蛋白活化基本模型,但針對(duì)細(xì)胞內(nèi)具體活化步驟仍存在有許多疑點(diǎn)。由于缺失掉羧基末端的p70S6KΔC104突變體仍對(duì)激酶活化和Thr389磷酸化具有嚴(yán)格的調(diào)控作用,這說明還存在有其他調(diào)節(jié)位點(diǎn)在S/T-P缺失的情況下控制Thr389磷酸化。因?yàn)锳GC家族成員中多數(shù)含有與Thr389同源的位點(diǎn),且在此位點(diǎn)周圍有一些保守結(jié)構(gòu)域(2),為此人們確定出一個(gè)新位點(diǎn),即Ser371(4).Ser371位點(diǎn)的+1位和-2位上也分別有一脯氨酸和疏水性氨基酸殘基,盡管其不能自身磷酸化,但他卻可潛在性的調(diào)節(jié)激酶氨基末端,催化區(qū)域和自主抑制區(qū)間的相互作用(4)。實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn),將Ser371突變?yōu)楣劝彼峄蛘咛於彼峥煞忾]掉Thr389磷酸化和激酶活性,卻并不影響Thr229的磷酸化(4),這可能是因?yàn)镾er371的突變打破了鉸鏈區(qū)對(duì)Thr389和Thr229磷酸化水平的正常調(diào)節(jié)功能。要想使有關(guān)p70S6K蛋白激酶活化機(jī)制的描述更加精確,Ser371和Ser404位點(diǎn)在級(jí)聯(lián)模型中的作用更加具體,更多的實(shí)驗(yàn)需要我們作進(jìn)一步研究。

2.4S6K2磷酸化因?yàn)镾6K2蛋白在調(diào)控區(qū)域和磷酸化位點(diǎn)上與S6K1高度同源,有研究估計(jì)S6K1的活化機(jī)制可能也適用于S6K2。除此之外,由于S6K2還在羧基末端含有一個(gè)潛在的核定位信號(hào)以及一個(gè)脯氨素富集區(qū)段,可以通過與SH3結(jié)構(gòu)的結(jié)合,介導(dǎo)S6K2蛋白與其他含有SH3結(jié)構(gòu)蛋白間的相互作用。因此,S6K1和S6K2的羧基末端可以使S6K1和S6K2分別結(jié)合于不同的分子內(nèi)區(qū)域(3)。

3S6Ks蛋白在腫瘤中的表達(dá)

近年來有關(guān)S6K與腫瘤相關(guān)性的研究認(rèn)為S6K蛋白激酶具有致癌潛能。研究發(fā)現(xiàn)在MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中,基因編碼的S6K1得到大量擴(kuò)增且表達(dá)增加,并且有近10%預(yù)后較差的人類乳腺腫瘤與S6K1相關(guān)(5)。因此有的作者認(rèn)為S6K1可以作為第一個(gè)致瘤標(biāo)記物用以評(píng)判原位治療術(shù)后的預(yù)后情況,以及在腫瘤病人診斷初期用于作為臨床是否進(jìn)行原位治療的標(biāo)準(zhǔn)之一(5)。此外還有報(bào)道稱S6K1蛋白在乳腺腺瘤和腺癌,甲狀腺癌(6)以及子宮內(nèi)膜癌(7)中均有過表達(dá),在原發(fā)性人白血病和骨髓瘤中被結(jié)構(gòu)性活化(7),在狀甲狀腺組織中也檢測(cè)到S6K1磷酸化水平的增加(5),以上研究結(jié)果都讓人意識(shí)到S6K1的表達(dá)與細(xì)胞惡性增生以及腫瘤的發(fā)生有著一定的聯(lián)系。此外盡管S6K2很少被認(rèn)為具有致瘤潛能,但有關(guān)報(bào)道也發(fā)現(xiàn)其在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(8),乳腺癌及乳腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)(5),其在上皮腺腫瘤細(xì)胞核中的聚集強(qiáng)于正常組織。

4展望

隨著人們對(duì)S6Ks激酶活化機(jī)制諸多細(xì)節(jié)的研究以及其在各種病理狀態(tài)下表達(dá)水平的改變,增加了我們對(duì)于調(diào)控S6Ks激酶功能的上游元件以及激酶在細(xì)胞生長(zhǎng)中的具體作用機(jī)制的了解。這些研究確定了PI3K和mTOR通路為活化S6Ks激酶的兩條主要通路,mTOR作為活化通路上的重要調(diào)控元件,參與了多種信號(hào)誘導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外免疫抑制劑rapamycin及其類似物針對(duì)mTOR功能的抑制所表現(xiàn)出來的抗腫瘤特性,已受到人們的廣泛關(guān)注,盡管他們?cè)谝黄谂R床實(shí)驗(yàn)中所表現(xiàn)的抗腫瘤活性并不十分普遍,但畢竟腫瘤是一個(gè)多因素多途徑涉及的病理異常產(chǎn)物,對(duì)于它的研究及治療亦需兼顧到多因素的協(xié)同作用。因此我們堅(jiān)信,隨著人們對(duì)于S6Ks如何控制蛋白翻譯和細(xì)胞生長(zhǎng)等具體功能機(jī)制研究的逐步完善,勢(shì)必為我們?cè)诠タ四[瘤疾病這一艱難旅途上提供更為有效的藥物治療依據(jù)。

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篇3

鼻咽癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是其治療失敗的主要原因。目前認(rèn)為，癌基因異常激活和抑癌基因監(jiān)控失活在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中起著重要作用，闡明上述機(jī)制，是控制鼻咽癌的關(guān)鍵。蛋白酶活化受體家族pars（protease－activated receptors）是介導(dǎo)血栓形成的一種g蛋白耦聯(lián)受體，pars家族有4 種亞型,par1是其中研究最為深入的一種。par1表達(dá)于人多種正常細(xì)胞，在調(diào)節(jié)血栓形成、細(xì)胞粘附和遷移、整合素的銜接、有絲分裂、介導(dǎo)過敏等多種病理生理過程中發(fā)揮作用。新近研究發(fā)現(xiàn)par1在多種惡性腫瘤（如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等）中也高表達(dá)par1，而且這種表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。par1在人鼻咽癌這一高度惡性高侵襲性的腫瘤中的表達(dá)未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)人鼻咽癌組織及細(xì)胞系中的par1表達(dá)進(jìn)行研究,并探討par1的表達(dá)在人鼻咽癌中的意義。

1 資料及方法

1.1 標(biāo)本及臨床病理資料

收集武漢協(xié)和醫(yī)院耳鼻喉科門診2006年12月～2007年9月期間的鼻咽部活檢標(biāo)本共89例，均為初治患者，所有標(biāo)本均經(jīng)光鏡he染色后病理學(xué)診斷：其中鼻咽良性病變28例，鼻咽癌61例。腫瘤生長(zhǎng)模式按照顯微鏡下npc 癌細(xì)胞生長(zhǎng)方式分為三型[1]即: 癌細(xì)胞巢狀膨脹性生長(zhǎng)為主的regaud型,癌細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)性生長(zhǎng)為主的schminke型,癌細(xì)胞既膨脹性又浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的combination混合型。

1.2 藥物和試劑

細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自gibco公司，trizol (invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(k1621)由武漢晶美公司購(gòu)自fermentas公司。par1鼠抗人單克隆抗體(購(gòu)自santa cruz biotechology,sc?13503)。sp kit、hrp標(biāo)記羊抗鼠igg購(gòu)自、dab顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。蛋白裂解液購(gòu)自pierce公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人鼻咽高分化鱗癌細(xì)胞株cne?1、低分化鱗癌細(xì)胞株cne?2由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)選用含有10％新生牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液，置于37℃、5％ co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部70％～80％時(shí)，用含0.02% edta的胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 rt?pcr檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞株中的par1mrna的表達(dá)

用trizol從細(xì)胞中提取總rna并逆轉(zhuǎn)錄成cdna。設(shè)計(jì)引物序列(上海生工)，見表1。pcr儀進(jìn)行相應(yīng)基因擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2.5μl的10×pcr緩沖液(含mg2＋)，2μl cdna，1μl dntps(2.5mmol／l)，上下游引物各0.5μl (10pmol/l)，taq聚合酶0.5μl (5u/l )，用滅菌ddho，補(bǔ)足至25μl。pcr循環(huán)參數(shù)為：94℃,5min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 50s，59.8℃(par1)／56℃(β?actin) 50s，72℃ 50s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min終止反應(yīng)。pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,eb染色,紫外燈觀察并照相。 表1 par1和內(nèi)參β?actin基因引物序列

基因引物序列擴(kuò)增長(zhǎng)度par1上游：gtgctgtttgtgtctgtgct598bp下游：cctctgtggtggaagtgtgaβ?actin上游： ggcggcaacaccatgtaccct202bp下游： aggggccggactcgtcatact

1.5 western blot檢測(cè)

檢測(cè)細(xì)胞株中par1蛋白表達(dá)，并比較兩種細(xì)胞株中的表達(dá)差異：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的cne?1、cne?2細(xì)胞各1×107/ml（約50ml培養(yǎng)瓶），蛋白提取: 用預(yù)冷的pbs 洗細(xì)胞3 次, 加入細(xì)胞裂解液400μl(900μl mem?per加入100μl pmsf）裂解細(xì)胞，冰盒上刮下細(xì)胞,4℃、10000r/min離心10min,收集上清,－20℃保存，bradford比色法測(cè)定蛋白濃度定量，調(diào)蛋白濃度一致后，行sds?page電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5％脫脂奶粉37℃封閉1h，與鼠抗人par1一抗（1∶200稀釋）4℃孵育過夜，用tbst洗滌3次，每次15min,后加入hrp標(biāo)記羊抗鼠igg（1∶5000稀釋），37℃孵育1h后，用ecl發(fā)光試劑，暗室中曝光壓片，檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)，膠片掃描保存。

1.6 免疫組織化學(xué)（sp法）檢測(cè)

檢測(cè)鼻咽癌標(biāo)本及鼻咽良性標(biāo)本中par1的蛋白表達(dá)并行亞細(xì)胞定位。標(biāo)本處理：收集新鮮鼻咽部活檢標(biāo)本用0.9％生理鹽水沖洗后立即置于100ml/l 甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4μm，he染色進(jìn)行組織學(xué)分類。免疫組化sp法,具體步驟參照試劑盒說明書。空白對(duì)照以pbs取代一抗，陽性對(duì)照為已知陽性片。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性染色呈棕黃色顆粒狀，陰性對(duì)照無著色。對(duì)每例鼻咽部活檢標(biāo)本的par1表達(dá)情況與患者臨床資料進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用spss10.0軟件進(jìn)行分析，相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn),定量分析采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩種鼻咽癌細(xì)胞株中par1的mrna和蛋白的表達(dá)情況及其差異

rt?pcr檢測(cè)到兩種細(xì)胞株中均存在par1mrna的表達(dá), 兩種鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)存在明顯差異，其中低分化鱗癌細(xì)胞株cne?2中為高表達(dá)，高分化鱗癌細(xì)胞株cne?1為中等表達(dá)，見圖1。western blot檢測(cè)到兩種鼻咽癌細(xì)胞株中存在par1蛋白表達(dá)，par1在cne?2中的表達(dá)明顯高于par1在cne?1中的表達(dá)，見圖2。

2.2 免疫組化結(jié)果

免疫組化示，par1主要表達(dá)于細(xì)胞膜，28例良性鼻咽組織表達(dá)為10（+），61鼻咽癌組織中48（+），鼻咽癌組織中par1表達(dá)率明顯高于良性鼻咽組織（χ2＝15.219， p<0.01）。癌細(xì)胞膜上可見陽性染色的棕黃色顆粒（圖略）。

2.3 par1的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系

研究顯示，par1在鼻咽癌中的表達(dá)與癌細(xì)胞

圖1 rt?pcr顯示兩種細(xì)胞株中par1的表達(dá)

圖示兩種鼻咽癌細(xì)胞株中存在par1蛋白表達(dá)，t檢驗(yàn)得出par1在cne?2細(xì)胞株中的表達(dá)明顯高于par1在cne?1細(xì)胞株中的表達(dá)（條帶灰值：cne?1：0.34356686±0.149120837, cne?2：0.89469757±0.100732874, p＝0.188）

圖2 western blot顯示兩種細(xì)胞株

中par1的蛋白表達(dá)及其差異

的生長(zhǎng)方式、局部淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、tnm分期早晚相關(guān)（p<0.05），見表2。schmincke型方式生長(zhǎng)的鼻咽癌患者中par1的表達(dá)明顯高于regaud型,有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者,par1的表達(dá)高于無局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，par1的表達(dá)率與原發(fā)腫瘤范圍即t分期（但隨t分期的提高表達(dá)率增加）無明顯相關(guān)，但與tnm分期密切相關(guān)，分期越晚，par1的表達(dá)率越高。此外，男性患者中par1表達(dá)率稍高于女性患者，隨著年齡的增高，par1的表達(dá)率也增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。

3 討論

惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是其危害患者生命的主要原因，阻斷惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移在惡性腫瘤的治療中尤為關(guān)鍵。最新研究提示,par1在多種惡性腫瘤中高表達(dá)[2]。高表達(dá)的par1介導(dǎo)某些腫瘤的惡性生物學(xué)行為，主要是表現(xiàn)在許多腫瘤中與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。在良性乳腺上皮及非侵襲性細(xì)胞株中par1的表達(dá)最低或無表達(dá),而在侵襲性乳腺癌mda?mb?21細(xì)胞株中則表達(dá)高水平的功能性par1[2]。martin等[3]得出par1的表達(dá)水平與促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移相關(guān)。

目前認(rèn)為，par1主要是作為某些介導(dǎo)惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的物質(zhì)的受體而作用，主要是與凝血酶[4]、基質(zhì)金屬蛋白酶家族（mmps）[5]、整合素家族[6]、血管生存[7，8]等相關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)par1還可能參與某些信號(hào)通路而與腫瘤形成[9]、分化[10]、凋亡逃避[11]、耐藥[12]等也有關(guān)。

表2 par1的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系par1在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等復(fù)雜生物學(xué)行為中的具體作用及調(diào)控機(jī)制遠(yuǎn)未被闡明，par1在許多腫瘤中的作用具有明顯的特征性。不同類型腫瘤在腫瘤進(jìn)展的不同期別，par1發(fā)揮的作用，值得深入研究。

par1在鼻咽癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)尚無文獻(xiàn)報(bào)道,筆者首次采用免疫組織化學(xué)、western blot和rt?pcr方法檢測(cè)par1在鼻咽癌組織及細(xì)胞系中par1的表達(dá)。結(jié)果顯示,鼻咽癌組織中par1的表達(dá)水平明顯高于鼻咽部良性病變。61例鼻咽癌標(biāo)本中，不同性別鼻咽癌患者的par1的表達(dá)無明顯差異,年齡高低與par1的表達(dá)亦無明顯相關(guān)。schmincke型方式生長(zhǎng)的鼻咽癌患者中par1的表達(dá)明顯高于regaud型，par1的表達(dá)和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),這說明par1的表達(dá)可能增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲，影響了癌細(xì)胞間的粘附性，使癌細(xì)胞容易相互分離并向間質(zhì)移動(dòng)，導(dǎo)致向周圍鄰近組織侵襲。此外，par1的表達(dá)率與原發(fā)腫瘤范圍無明顯相關(guān)，可能有待增加病例數(shù)證實(shí),但與tnm分期密切相關(guān)，分期越晚，par1的表達(dá)率越高。低分化鱗癌細(xì)胞株cne?2中par1表達(dá)水平顯著高于高分化鱗癌細(xì)胞株cne?1，病理組織學(xué)認(rèn)為，分化程度越低的腫瘤細(xì)胞惡性程度越高，侵襲性越強(qiáng)，提示par1在鼻咽癌中的表達(dá)水平可能與鼻咽癌細(xì)胞惡性程度及侵襲力相關(guān)，這與par1在其他惡性腫瘤中的研究一致。

綜上，初步研究得出par1在鼻咽癌中的高表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為相關(guān)。本研究尚待擴(kuò)大標(biāo)本數(shù),進(jìn)一步完善臨床病理資料（如病理類型、治療反應(yīng)、預(yù)后）和結(jié)合細(xì)胞學(xué)功能實(shí)驗(yàn),探討par1的表達(dá)及其改變與鼻咽癌成瘤襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的關(guān)系，為今后研究鼻咽癌的發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移等機(jī)制并進(jìn)行干預(yù)打下基礎(chǔ)。

(致謝：感謝武漢協(xié)和醫(yī)院耳鼻喉科胡運(yùn)梅護(hù)師，鐘剛、陳沛、陳建軍醫(yī)師等在收集鼻咽部標(biāo)本中給予的幫助。)

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篇4

[關(guān)鍵詞]魚腥草 胰蛋白酶抑制劑

中圖分類號(hào)：P618.21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2014）10-0374-01

蛋白酶抑制劑（proteinase inhibitor， PI）是一類能夠抑制蛋白水解酶活性的物質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。其中胰蛋白酶抑制劑（Trypsin inhibitor， TI）具有重要的藥用價(jià)值，對(duì)急性胰腺炎、肺氣腫、抗休克、防治腦水腫和腦缺血等都有很好的臨床 治療 效果，還有研究表明對(duì) HIV 和腫瘤的治療也有重要意義。因此，從傳統(tǒng)中藥中篩選具有TI活性的材料有很廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)價(jià)值。

魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的地上部分，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋之功效，是臨床應(yīng)用極其廣泛的中藥之一。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期篩選的結(jié)果，利用魚腥草為材料對(duì)從魚腥草中提取TI的工藝進(jìn)行優(yōu)化，找出最佳的提取條件，為今后的 工業(yè) 化生產(chǎn)TI提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 試劑胰蛋白酶（ 北京麒麟宏偉公司） 、大豆蛋白酶抑制劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、苯甲酰DL-精氨酸對(duì)硝基苯胺（BAPNA）（上海三杰生物技術(shù)有限公司）、三-羥甲基-氨基甲烷、無水氯化鈣、鹽酸、三氯乙酸、氫氧化鈉等為國(guó)產(chǎn)分析純；魚腥草。

1.2？ 儀器可見光分光光度計(jì)（7202B） 、離心機(jī)（LD-4） 、精密pH 計(jì)、水浴鍋、精密 電子 天平（FA2004N）。

2 方法

2.1？ 魚腥草中胰蛋白酶抑制活性成分提取的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù) 文獻(xiàn) 及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用雙蒸水作為提取TI的溶劑。稱取干燥的魚腥草全草5 g，粉碎，在平行操作條件下，選用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，以胰蛋白酶活性大小為指標(biāo)，進(jìn)行9次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，然后過濾并收集濾液，減壓濃縮到100 ml。

2.2？ 魚腥草中胰蛋白酶抑制活性成分對(duì)胰蛋白酶的抑制率測(cè)定方法采用苯甲酰DL-精氨酸對(duì)硝基苯胺（BAPNA）法：取胰蛋白酶液1 ml，加藥材提取液1 ml在37℃水浴保溫5 min，加入BAPNA溶液5 ml，37℃水浴保溫10 min后，立即加1 ml三氯乙酸（30%）終止反應(yīng)，用分光光度法在410 nm條件下測(cè)定吸光度。按下列公式 計(jì)算 樣品提取液的抑制百分率：i=（Ar-Abr ）-（As-Abs）（Ar-Abr）×100%

式中：i ―抑制百分率；Ar ―標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度；Abr―含標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白對(duì)照液的吸光度；As―樣品溶液的吸光度；Abs―含樣品溶液的空白對(duì)照液的吸光度。

3 結(jié)果與方差分析

由方差分析可知，各因素對(duì)提取效果的影響程度依次為B>A>C>D，其中因素B為高度顯著，因素A，C影響顯著，因素D沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響很小。由R值可知， 各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的重要次序?yàn)锽>C>A>D?？紤]到規(guī)模化生產(chǎn)中 經(jīng)濟(jì) 、效率等因素，本文優(yōu)選工藝A1B2C3D2， 即在60℃，用30倍量水， pH值為9，3 h/次為最佳提取工藝。按照此工藝條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定提取液對(duì)胰蛋白酶的抑制率，結(jié)果平均抑制率為58.27%，表明本實(shí)驗(yàn)確定的工藝路線穩(wěn)定可靠。

4 討論

因素A對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著的影響，60℃時(shí)提取活性最高，隨著溫度的上升抑制率有下降的趨勢(shì)，說明隨著溫度的上升對(duì)TI有失活的作用。因素B對(duì)實(shí)驗(yàn)有高度顯著的影響，在所有因素中影響最顯著，說明隨著溶劑量的增加會(huì)提高TI的提取效率，但從變化趨勢(shì)看當(dāng)30倍量時(shí)繼續(xù)增加溶劑量，TI的提取率增幅不是很明顯，因此考慮生產(chǎn)成本和效益用30倍量是最好的。因素C對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有顯著影響，隨著pH值的增加，提取活性成分的提取率增加，這說明在堿性條件下提取效率升高。

本實(shí)驗(yàn)通過正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化， 并按最佳工藝進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)， 結(jié)果證明用該工藝作為魚腥草中TI的有效部位的粗提取，具有工藝簡(jiǎn)單、提取率高、操作控制容易、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

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篇5

泛素結(jié)合酶 E2 家族中的 UbcH10，又稱周期蛋白選擇性泛素載體蛋白 E2-C，是腫瘤相關(guān)的泛素結(jié)合酶，在多種惡性腫瘤中過度表達(dá)，自然成為抗腫瘤靶標(biāo)之一。Wagner等報(bào)道，抑制 UbcH10 的過表達(dá)和基因擴(kuò)增是腫瘤的潛在治療方法。研究者采用siRNA 選擇性沉默 UbcH10 轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致 UbcH10 表達(dá)減少，結(jié)果顯示能明顯抑制腫瘤細(xì)胞但正常細(xì)胞增殖卻不受影響。當(dāng)結(jié)合 DR5/TRAIL 受體拮抗劑時(shí)，針對(duì) UbcH10 轉(zhuǎn)錄的siRNA 增強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，而不殺傷增殖中的原代人上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。Berlingieri 等發(fā)現(xiàn)通過 RNA 干擾封閉 UbcH10 的蛋白質(zhì)合成能抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究還發(fā)現(xiàn)，在大腸癌組織中 UbcH10 的表達(dá)明顯高于非癌組織，而且它還與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在體外實(shí)驗(yàn)中，UbcH10 能促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤的侵襲，但通過 RNA 干擾封閉 UbcH10 的蛋白質(zhì)合成能明顯抑制細(xì)胞的增殖和降低腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移力。UbcH10 可能是一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物，為大腸癌的治療提供了一個(gè)新方案，在大腸癌的診斷和預(yù)后判定上也有非常重要價(jià)值。針對(duì) UbcH10 的干擾和抑制可能成為一種新型的臨床分子靶點(diǎn)抗癌藥物。

E3 與腫瘤的相關(guān)性很大程度上是因?yàn)樗鼈兡軐?dǎo)致癌基因或腫瘤抑制物降解。目前研究得比較清楚的是環(huán)狀 E3 連接酶 HDM2(human double minute2)，HDM2 蛋白是腫瘤抑制蛋白 p53 蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，它同時(shí)也是能調(diào)控細(xì)胞周期的多亞基 SCF 連接酶的負(fù)40調(diào)節(jié)蛋白。針對(duì) E3 的活性位點(diǎn)、或針對(duì)它們與底物間的特異性相互作用來開發(fā)出副作用小的高選擇性藥物，HDM2 蛋白自然成了首選藥物靶標(biāo)。如果使 HDM2 失活，就能夠激活 p53 通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡。另一個(gè)藥物靶標(biāo)是 SKP2 蛋白，它是SCF 連接酶復(fù)合體中的底物特異性亞基，如果在細(xì)胞周期抑制蛋白 p27 表達(dá)水平較低的腫瘤細(xì)胞中的 SKP2 蛋白失活，可能也會(huì)起到一定的抑癌效果。但在一些腫瘤中，反而應(yīng)該提高 E3 的活性，可這要比抑制它們的活性困難得多。如在高表達(dá) c-Myc 或 cyclin E蛋白的腫瘤患者體內(nèi)使用 Fbxw7 激動(dòng)劑，就會(huì)促進(jìn)上述這些癌基因產(chǎn)物降解;而促進(jìn)VHL 連接酶的活性也能夠使 HIF1α 失穩(wěn)，抑制腫瘤血管的形成。近 10 年來，一直在尋求 E3 連接酶的抑制劑或激動(dòng)劑，也開發(fā)出了能特異性抑制 HDM2 蛋白 E3 連接酶活性的小分子抑制劑，不過還沒有一種藥物在臨床上表現(xiàn)出抗癌效果。用 HLI98 抑制劑來治療腫瘤的作用機(jī)理就是激活了 p53 信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。但這些藥物的生物效價(jià)差，同時(shí)還有與 p53 無關(guān)的脫靶效應(yīng)，其中最成功的是 Nutlins，該藥物能針對(duì) HDM2蛋白的溝槽(groove)結(jié)構(gòu)，而該溝槽結(jié)構(gòu)正是 HDM2 蛋白與 p53 蛋白相結(jié)合的部位。

但 Nutlins 藥物只針對(duì)表達(dá)野生型 p53 蛋白的腫瘤細(xì)胞起作用，而對(duì)表達(dá)突變型 p53 蛋白或不表達(dá) p53 蛋白的腫瘤細(xì)胞則無效。

還有一條開發(fā)泛素連接酶抑制劑的策略，那就是找到一種能與連接酶底物蛋白相結(jié)合的物質(zhì)，從而阻止其被泛素化。以 p53 蛋白為例，發(fā)現(xiàn)一種名為 RITA 的小分子化合物能夠與 p53 蛋白的 N 末端相結(jié)合，使得細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。不過 RITA 并不是通過特異性抑制 p53 蛋白與 HMD2 蛋白間的相互作用來起作用的，它還能影響好幾個(gè)能與 p53 蛋白相結(jié)合的其它蛋白，而這些蛋白都能通過不同于泛素修飾途徑的方法來抑制 p53 蛋白。去泛素化酶是致癌或抑癌 E3 連接酶的直接抑制物，也可作為抗癌治療的靶標(biāo)。其中最有望取得成功的是核去泛素化酶(nuclear DUB)，包括 USP1、USP28 和 USP44，它們都與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。USP1 蛋白通過抑制范康尼貧血互補(bǔ)基團(tuán) D2 蛋白(FANCD2)和 PCNA 蛋白的單泛素化作用調(diào)控 DNA 修復(fù)檢查點(diǎn)。USP28 蛋白在結(jié)腸癌、乳腺癌患者體內(nèi)都過量表達(dá)，它通過抑制 SCF–Fbxw7 連接酶的泛素化活性來穩(wěn)定cyclin E1 蛋白和 c-Myc 蛋白。而 USP44 蛋白則能夠通過去除 Cdc20 蛋白的泛素化修飾作用來對(duì)抗細(xì)胞分裂后期促進(jìn)蛋白 APC/C 的活性，防止紡錘體檢查點(diǎn)過早失效。

其它與腫瘤相關(guān)的去泛素化酶還能調(diào)控 NF-κB 信號(hào)通路。泛素連接酶以及去泛素化酶都參與了 NF-κB 的調(diào)控，它們可能同處于一個(gè)復(fù)合體中，甚至共同位于一條多肽鏈上。正因?yàn)槿绱?，它們才能更有效地?duì) NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控。這種泛素連接酶與去泛素化酶之間 “親密關(guān)系”最為經(jīng)典的范例非 A20 蛋白莫屬。A20 蛋白的 OUT 結(jié)構(gòu)域具有去泛素化酶活性，而 A20 蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)具有 E3 連接酶的活性。A20 蛋白能催化 RIP蛋白和 NEMO 蛋白等底物蛋白上第 63 位賴氨酸位點(diǎn)去泛素化，也能促進(jìn)靶蛋白的第 48位賴氨酸位點(diǎn)與泛素蛋白連接，繼而靶蛋白被蛋白酶體降解。

另一種名為 CYLD 的去泛素化酶也能調(diào)控 NF-κB 信號(hào)通路。CYLD 蛋白見于一種皮膚腫瘤—圓柱瘤病的患者體內(nèi)，由一種抑癌基因的突變體所編碼。CYLD 蛋白在其 C末端含有一個(gè)泛素蛋白水解酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能將連接在靶蛋白第 63 位賴氨酸殘基上的多聚泛素蛋白修飾物水解掉，這些靶蛋白中有許多都參與了細(xì)胞因子誘導(dǎo)的 NF-κB信號(hào)通路調(diào)控。在人體皮膚癌以及腎臟腫瘤、肝臟腫瘤以及宮頸腫瘤等患者體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)CYLD 蛋白的表達(dá)量下降，甚至被抑制，這說明 CYLD 蛋白具有普遍的抑癌作用。對(duì)敲除了 CYLD 基因的小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，BCL3 蛋白是 CYLD 蛋白的重要底物，BCL3 蛋白對(duì)于圓柱瘤病相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有極其重要的作用。BCL3 蛋白是一種轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，它在胞質(zhì)中處于失活狀態(tài)，經(jīng)多泛素蛋白修飾后活化進(jìn)入核內(nèi)，隨后與NF-κB1 蛋白或 NF-κB2 蛋白一起啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，促進(jìn)有助細(xì)胞增殖的靶基因表達(dá)。

對(duì)去泛素化酶進(jìn)行更深入研究，將有助于開發(fā)出去泛素化酶抑制劑并將其作為抗癌藥物。已證實(shí)，針對(duì)泛素蛋白 C 末端水解酶(UCH-L1)的小分子抑制劑具有治療肺癌的作用。雖然這一成功案例證明，去泛素化酶抑制劑具有美好的前景，但是要將它真正應(yīng)用到臨床，還有很多問題需要克服。

2. 針對(duì)腫瘤細(xì)胞的蛋白酶體

蛋白酶體抑制劑通過抑制蛋白酶體的活性，阻斷其對(duì)細(xì)胞蛋白的降解，以此來抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。蛋白酶體抑制劑在體外可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，為人類開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了新的思路。蛋白酶體抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞引起的反應(yīng)是不相同的，它作用于正常細(xì)胞常常會(huì)造成細(xì)胞周期阻滯，而在快速增殖的腫瘤細(xì)胞則更容易誘發(fā)凋亡。

硼替佐米的成功帶動(dòng)了一大批蛋白酶體抑制劑的研發(fā)，比如 PR-171(carfilzomib)、NPI-0052 和 CEP-18770 等。目前各種蛋白酶體抑制劑作用機(jī)制以及作用靶點(diǎn)各不相同，比如有針對(duì) 20S 蛋白酶體糜蛋白酶活性位點(diǎn)的、針對(duì) 20S 蛋白酶體胰蛋白酶活性位點(diǎn)的以及針對(duì) 20S 蛋白酶體半胱天冬酶活性位點(diǎn)等。作用機(jī)制也分為可逆性的抑制與不可逆性的結(jié)合或共價(jià)修飾等。我們需要開發(fā)針對(duì)更多種底物、生物利用度更高、毒性更低的蛋白酶體抑制劑。argyrinA 就是這樣一種新型的蛋白酶體抑制劑，它是在篩選能穩(wěn)定細(xì)胞周期抑制蛋白 p27Kip1的復(fù)合物時(shí)發(fā)現(xiàn)的，因此其抗癌活性必須依賴 p27Kip1蛋白的正常表達(dá)，如果缺乏 p27Kip1蛋白，那么 argyrinA 也就不能起到抗癌作用。

癌霉素(Gankyrin)是一個(gè)近年發(fā)現(xiàn)的癌蛋白，是 19S 顆粒的組分之一，可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 CDK4 緊密結(jié)合。19S 顆粒的 Rpt3 亞基可特異地、不穩(wěn)定地結(jié)合Gankyrin，形成一個(gè) 19S 調(diào)控復(fù)合體，加速體內(nèi) pRB 的磷酸化，增強(qiáng) pRB 通過蛋白酶體降解;還與 p53 的一個(gè)主要 E3 酶 MDM2 結(jié)合，提高 MDM2 的活性，利于 p53 的多聚泛素化并被 26S 蛋白酶體降解。癌霉素的過表達(dá)使 pRB 和 p53 通過泛素-蛋白酶體通路的降解增強(qiáng)，表達(dá)下降。

在肝癌等一些類型的腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)中 Gankyrin 過表達(dá)，它能夠拮抗致 DNA 損傷物質(zhì)所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。Gankyrin 水平的下調(diào)能夠誘導(dǎo)野生型 p53 基因的腫瘤細(xì)胞凋亡。在腫瘤生物學(xué)中，抑癌基因 Rb 與 p53 發(fā)揮核心作用，這兩條通路失活是形成腫瘤的重要條件。所以說，作為 Rb 和 p53 共同的負(fù)調(diào)節(jié)物，Gankyrin 很有可能會(huì)成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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[4]SHANG F, DENG G, LIU Q, et al. Lys6-modified ubiquitin inhibits ubiquitin-dependent protein degradation. J Biol Chem,2005,280:20365–20374.

篇6

本病由于骨髓中惡性漿細(xì)胞無節(jié)制地增生、廣泛浸潤(rùn)和大量單一的免疫球蛋白的出現(xiàn)及沉積，使正常的免疫球蛋白分泌受到抑制，從而引起廣泛骨質(zhì)破壞、高鈣血癥、反復(fù)感染、貧血、高黏滯綜合征、腎功能不全等一系列臨床表現(xiàn)并導(dǎo)致嚴(yán)重不良后果。根據(jù)多發(fā)性骨髓瘤研究基金會(huì)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅2004年一年我國(guó)就有1.1萬人死于這種疾病。

由于受醫(yī)學(xué)發(fā)展水平的制約，傳統(tǒng)方法治療多發(fā)性骨髓瘤的效果不佳，臨床緩解率不高。國(guó)內(nèi)部分統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，傳統(tǒng)化療方案M2、MP、VAD的有效率分別為55.6%、50%和66.7%，化療總緩解率約為60%，平均生存時(shí)間僅為30~36個(gè)月。盡管大劑量化療后自體干細(xì)胞移植等新方法使緩解率和生存期有所改善，但該病仍無法治愈，最終會(huì)出現(xiàn)耐藥及復(fù)發(fā)。近10年來，治療緩解率或緩解期及總生存率沒有明顯提高，患者急切需要新的治療方法。

正當(dāng)廣大患者飽受病魔煎熬、臨床醫(yī)學(xué)工作者束手無策之際，硼替左米問世了。硼替左米是目前全球唯一批準(zhǔn)用于臨床治療的蛋白酶體抑制劑，它的應(yīng)用將為多發(fā)性骨髓瘤的治療帶來希望。人體細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體可調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)，但當(dāng)?shù)鞍酌阁w超出它的正常生理作用時(shí)，就會(huì)減弱對(duì)癌細(xì)胞的抑制，減少癌細(xì)胞的凋亡，引發(fā)各種腫瘤。硼替左米這種誕生前就與2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)緊密聯(lián)系的藥物，開啟了腫瘤細(xì)胞通向凋亡的大門?？茖W(xué)家通過硼替左米來抑制蛋白酶體，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)，促使腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)正常細(xì)胞生長(zhǎng)，恢復(fù)正常細(xì)胞的平穩(wěn)狀態(tài)的目的。

自從2003年5月在全球市場(chǎng)上市以來，硼替左米已廣泛應(yīng)用于臨床，顯著提高了多發(fā)性骨髓瘤患者的生存期，與接受地塞米松治療的患者相比，患者的病死率減少了55%。此外，硼替左米對(duì)于復(fù)發(fā)性與難治性多發(fā)性骨髓瘤的治療效果也令人折服，緩解率約為30%。也就是說，對(duì)一般化療方案無效或曾經(jīng)有效治療一段時(shí)間后無效的患者，仍有30% 對(duì)硼替左米敏感。目前，該藥已被視為治療復(fù)發(fā)性與頑固性多發(fā)性骨髓瘤的突破性療法，可以減緩甚至逆轉(zhuǎn)患者病情惡化。該藥被PrixGalien獎(jiǎng)的評(píng)審小組稱贊為“高度創(chuàng)新、也是多發(fā)性骨髓瘤治療上令人振奮的獨(dú)特藥物”。

如今，越來越多的多發(fā)性骨髓瘤患者看到了希望，該病的治療已不再是難題，更多患者的緩解和延長(zhǎng)生存期將不再是幻想。

篇7

【摘要】 目的研究大豆胰蛋白酶抑制劑提取物對(duì)四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治療效果。方法以市售大豆為材料，經(jīng)酸浸、脫脂、硫酸銨沉淀、透析除鹽、葡聚糖凝膠G-75柱純化等方法進(jìn)行大豆胰蛋白酶抑制劑的分離提純。然后，用大豆胰蛋白酶抑制劑提取物對(duì)四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃給藥。通過比較正常對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、大豆抑蛋白酶抑制劑高中低劑量組的多項(xiàng)血液指標(biāo)（血糖、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇）及各組小鼠病理切片等，研究大豆胰蛋白酶抑制劑的降糖活性。結(jié)果給予大豆胰蛋白酶抑制劑灌胃的糖尿病小鼠其血糖水平明顯下降，甘油三酯水平下降，總膽固醇水平和高密度脂蛋白膽固醇水平無明顯變化。結(jié)論大豆胰蛋白酶抑制劑提取物對(duì)糖尿病有較顯著的療效。

【關(guān)鍵詞】 大豆 胰蛋白酶抑制劑 分離提純 糖尿病 小鼠胰蛋白酶

抑制劑（soybean trypsin inhibitor，SBTI）是一類可以抑制胰蛋白酶水解活性的小分子多肽，普遍存在于植物的儲(chǔ)藏器官，如種子、塊根和塊莖中［1］。大豆胰蛋白酶抑制劑已在多種醫(yī)藥領(lǐng)域有所應(yīng)用［2，3］，另有報(bào)道大豆中微量胰蛋白酶抑制劑對(duì)于糖尿病治療，調(diào)節(jié)胰島素失調(diào)可能有一定效果［4］，但未見SBTI對(duì)糖尿病治療效果的專項(xiàng)研究，本文就大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治療作用進(jìn)行研究和探索。

1 材料與儀器

1.1 試劑與藥品市售大豆，牛胰蛋白酶(1∶250，上海維編科貿(mào)有限公司），BAPNA·HCl(Na-苯甲酰-DL-精氨酸對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽，上海維編科貿(mào)有限公司)，Tris(三羥甲基氨基甲烷，成都化學(xué)試劑廠生產(chǎn))，Sephadex G-75（葡萄糖凝膠G-75，上?；瘜W(xué)試劑廠生產(chǎn)），Alloxan（四氧嘧啶，sigma公司），葡萄糖試劑盒-GLU(氧化酶法，液體，北京北化康泰臨床試劑有限公司)，高密度脂蛋白膽固醇試劑盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），甘油三酯試劑盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），總膽固醇試劑盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），肝素鈉（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司），硫酸銨，正己烷，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，36%乙酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器DS-1高速組織搗碎機(jī)（上海標(biāo)本模型廠），DF206電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)（北京醫(yī)療設(shè)備二廠），F(xiàn)A1004電子天平（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），KDC-1042低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），722分光光度儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠），AE240電子天平（METTLER公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 胰蛋白酶抑制劑的分離純化

2.1.1 大豆胰蛋白酶抑制劑（SBTI）粗提物的制備用酸抽提法所得粗品蛋白和抑制劑總量高［1］，故本實(shí)驗(yàn)采用酸性水溶液浸泡大豆粉末提取大豆胰蛋白酶抑制劑［5，6］。

2.1.2 大豆胰蛋白酶抑制劑粗提物的透析除鹽將抑制劑粗制備物置于透析袋中蒸餾水充分透析7 d，除去鹽分。

2.1.3 凝膠柱的制備及抑制劑粗提物的純化［5，7］參考文獻(xiàn)［5，7］中方法，吸出存留緩沖液，加入1 ml樣品，用緩沖液進(jìn)行洗脫，控制流速在2 ml·h-1。流出10 ml后，用干凈的試管分部收集，檢測(cè)每管抑制劑的活性。

2.1.4 大豆胰蛋白酶抑制劑的活性測(cè)定［5，7］參考文獻(xiàn)［7］中方法，以BAPNA為底物測(cè)定胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制劑的活性。計(jì)算其抑制百分率［5］。收集具有抑制活性的洗脫液（即大豆胰蛋白酶抑制劑的提取物）。

2.2 大豆胰蛋白酶抑制劑提取物對(duì)小鼠血糖、甘油三酯、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇水平的影響

2.2.1 實(shí)驗(yàn)性四氧嘧啶糖尿病動(dòng)物模型的建立隨機(jī)選取10只小鼠作為正常對(duì)照組(Control)。除正常對(duì)照組外，其它小鼠禁食12 h后，腹腔注射四氧嘧啶250 mg·kg-1。72 h后尾尖取血，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定注射四氧嘧啶小鼠的血糖，以血糖值大于11.1 mmol·L-1［8］的小鼠作為四氧嘧啶糖尿病模型小鼠。將糖尿病模型小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(Alloxan) 、大豆胰蛋白酶抑制劑低劑量組(Alloxan+ SBTIL) 、大豆胰蛋白酶抑制劑中劑量組(Alloxan +SBTIM) 和大豆胰蛋白酶抑制劑高劑量組(Alloxan+SBTIH)。

2.2.2 分組給藥及測(cè)定方法Alloxan+SBTIL組、Alloxan+SBTIM組和Alloxan+ SBTIH組的定時(shí)給藥劑量分別為每只每天0.1，0.3 ml和0.5 ml。但為了消除不同給藥劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，需將Alloxan+SBTIL組和Alloxan+SBTIM組的藥液用蒸餾水稀釋，使得稀釋后藥液的給藥量為每只每天0.5 ml。Control組和Alloxan組給予等容量生理鹽水（0.5 ml）。連續(xù)7 d經(jīng)口灌胃給藥。末次給藥后次日分別測(cè)定各組小鼠的血糖、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇4項(xiàng)血液指標(biāo)（均采用試劑盒法，其具體操作過程見試劑盒內(nèi)說明書）。完成測(cè)定后，處死小鼠，取腎臟和肝臟制作病理切片。

2.2.3 大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)糖尿病模型小鼠血糖水平的影響結(jié)果見表1。表1 對(duì)糖尿病模型小鼠血糖水平的影響由表1可見，造模72 h后，四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠的血糖水平均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），并且糖尿病模型小鼠狀態(tài)較為萎靡，表明糖尿病模型制造成功。對(duì)照實(shí)驗(yàn)后的各給藥組和糖尿病模型小鼠的血糖水平可見大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)糖尿病的降糖作用：由Alloxan組、Alloxan+SBTIL組、Alloxan+SBTIM組到Alloxan+ SBTIH組小鼠的血糖水平有逐漸降低的趨勢(shì)，即血糖降低程度與給藥劑量正相關(guān)。其中Alloxan+SBTIM組、Alloxan+SBTIH組與Alloxan組相比有明顯降低（P＜0.01），尤以Alloxan+SBTIH組更為明顯。結(jié)果表明，大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)糖尿病小鼠的血糖有較明顯的降低作用。

2.2.4 SBTI對(duì)糖尿病模型小鼠TG，CHO和HDL-C的影響結(jié)果見表2。表2 SBTI對(duì)糖尿病模型小鼠TG，CHO和HDL-C指標(biāo)的影響與Control組比較，aP＜0.01，cP＜0.05；與Alloxan組比較，bP＜0.01

本實(shí)驗(yàn)中，SBTI給藥組的血清甘油三酯水平有所降低，其中大豆胰蛋白酶抑制劑高、中劑量給藥組小鼠的甘油三酯水平與四氧嘧啶糖尿病模型組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），可認(rèn)為給藥組小鼠血清甘油三酯水平明顯降低。另一方面，SBTI對(duì)總膽固醇有一定的降低作用，對(duì)高密度脂蛋白膽固醇有一定的升高作用，但其差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），即影響不顯著。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上補(bǔ)充說明了SBTI對(duì)糖尿病具有較好療效。

2.2.5 SBTI對(duì)糖尿病模型小鼠腎臟和肝臟細(xì)胞的病理切片顯微鏡觀察結(jié)果比較觀察圖1～3，Control組小鼠腎臟細(xì)胞的組織切片中可見，其細(xì)胞形態(tài)為飽滿，結(jié)構(gòu)清晰，與周圍細(xì)胞的界限較明顯，細(xì)胞排列相對(duì)整齊；腎小球形態(tài)正常；近曲小管、遠(yuǎn)曲小管形狀較規(guī)則，均勻排列。Alloxan組切片的細(xì)胞形態(tài)萎縮變形，輪廓不飽滿，界限不清晰，細(xì)胞排列紊亂；腎小球固縮較明顯，腎小球囊壁增厚；腎小管萎縮；間質(zhì)組織細(xì)胞增生明顯，有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。Alloxan+SBTIH組細(xì)胞形態(tài)、界限、排列狀況均較高血糖對(duì)照組有改善；腎小球固縮程度減輕；腎小管的形態(tài)、排列狀況及間質(zhì)增生情況也有改善。腎組織切片顯示，大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)糖尿病模型小鼠的腎組織有一定的保護(hù)作用。

比較觀察圖4～6，Control組小鼠肝臟切片中可見，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)飽滿，界限清晰；肝板排列規(guī)則整齊，且較為緊密。Alloxan組切片肝臟細(xì)胞體積變??；胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，細(xì)胞核染色較深；肝板排列較為疏松，且不整齊。高劑量給藥組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)明顯，肝板細(xì)胞體積增大，排列較整齊、規(guī)則。

3 討論

血糖是糖尿病的主要表征，臨床上以血糖值作為糖尿病的主要診斷依據(jù)。因此，血糖水平的降低程度可直接反映糖尿病的治療效果。通過分析各組小鼠血糖水平的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得出，大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)糖尿病具有較好的治療作用。

四氧嘧啶糖尿病小鼠較正常小鼠的血清甘油三酯，膽固醇水平均有升高［9］。本實(shí)驗(yàn)中，SBTI給藥組的血清甘油三酯水平有所降低，其中，SBTI高、中劑量給藥組小鼠的甘油三酯水平與Alloxan組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。另一方面，SBTI對(duì)總膽固醇有一定的降低作用，對(duì)高密度脂蛋白膽固醇有一定的升高作用，但其差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上補(bǔ)充說明了SBTI對(duì)糖尿病具有較好療效。

由于糖尿病小鼠胰島素的缺乏會(huì)引起肝糖原合成減弱和分解過程加強(qiáng)加速，引起糖尿病的肝細(xì)胞體積減小，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，即肝細(xì)胞發(fā)生病變；糖尿病腎組織中腎小管的重吸收作用降低，大量葡萄糖由腎臟排出，病理性滲透性利尿，即腎細(xì)胞發(fā)生病變。而且，蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)的代謝紊亂等也對(duì)肝腎細(xì)胞造成相應(yīng)的損傷。因而，通過其腎、肝臟器質(zhì)病變程度也可反映出治療糖尿病藥物的療效。腎、肝的病理切片反映，給藥組糖尿病小鼠的病情有一定程度的好轉(zhuǎn)。

從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可觀察到，各大豆胰蛋白酶抑制劑給藥組的CHO，HDL-C水平與Control組及Alloxan組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，擬定在下一步研究中，通過四氧嘧啶和高糖高脂飼料誘導(dǎo)大鼠的高糖高脂糖尿病，研究大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)糖尿病模型各項(xiàng)血脂指標(biāo)的影響，進(jìn)一步探索大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)糖尿病的療效。

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篇8

[關(guān)鍵詞] 心肌酶譜；纖維蛋白原；D-二聚體；腦梗死

[中圖分類號(hào)] R743.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2013）06（a）-0100-03

腦血管病是目前危害人類健康的主要疾病，腦梗死則是最常見的難治性疾病之一，其發(fā)病主要是與動(dòng)脈粥樣硬化、血管病變、高凝狀態(tài)和血栓形成有關(guān)[1-2]。D-二聚體是交聯(lián)纖維蛋白的降解產(chǎn)物，為高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的重要指標(biāo)，而腦梗死患者往往合并心臟損傷[3-4]，心肌酶譜在腦梗死患者中的檢測(cè)報(bào)道較少，本研究聯(lián)合檢測(cè)腦梗死患者中心肌酶譜聯(lián)合纖維蛋白原和D-二聚體水平，并觀察其在腦梗死患者中的意義，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2009年1月～2012年1月在上海市第一人民醫(yī)院寶山分院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）就診的腦梗死患者120例為腦梗死組，其中男73例，女47例，年齡47～85歲，平均（67.87±10.76）歲。所有患者均經(jīng)其診斷符合頭顱CT或頭顱MRI所證實(shí)，符合1995年全國(guó)第四屆腦血管病會(huì)議通過的診斷標(biāo)準(zhǔn)。按照臨床神經(jīng)功能缺損評(píng)分分為：0～15分為輕型；16～30分為中型；31～45分為重型，其中輕型組24例，中型組52例和重型組44例；根據(jù)Pullicino公式計(jì)算梗死灶面積分為小梗死灶組51例，中梗死灶組45例和大梗死灶組24例。同時(shí)選擇同期在我院健康體檢者30名為對(duì)照組，其中男19名，女11名，年齡45～84歲，平均（66.83±9.76）歲，所有健康體檢者的體檢指標(biāo)均在正常范圍。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)通過，所有患者均知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：1個(gè)月內(nèi)無明顯外傷、手術(shù)、創(chuàng)傷和感染病史；無明顯心肝腎肺功能衰竭；無自身免疫性疾??；無口服激素類藥物或者免疫抑制制劑；無腫瘤病史。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集和保持 所有患者入院后次日凌晨抽取患者清晨空腹肘靜脈血3 mL。注入普通塑料管內(nèi)，1.8 mL注入含0.2 mL 3.8%枸櫞酸鈉的抗凝管內(nèi)，標(biāo)本采集后1 h內(nèi)3000 r/min，離心10 min，將血清或血漿提取后分別分裝于0.5 mL的EP管內(nèi)，-30℃保存，1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)方法 應(yīng)用酶法測(cè)定血清心肌酶，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）及其同工酶（CK-MB）。檢測(cè)儀及試劑采用BECKMAN公司的ACCESSII型檢測(cè)儀和北京中生公司試劑。纖維蛋白原和D-二聚體均采用日本Sysmex-CA6000血凝儀檢測(cè)，試劑由德國(guó)Dade behring Marburg GMBH生產(chǎn)，嚴(yán)格按說明操作。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察兩組的心肌酶譜、纖維蛋白原和D-二聚體的變化，及腦梗死患者心肌酶譜、纖維蛋白原和D-二聚體水平與神經(jīng)功能缺損程度和腦梗死灶大小的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組心肌酶譜、纖維蛋白原和D-二聚體的變化比較

腦梗死組的心肌酶譜、纖維蛋白原和D-二聚體的水平較對(duì)照組明顯提高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 腦梗死患者的心肌酶譜、纖維蛋白原和D-二聚體水平與神經(jīng)功能缺損程度的關(guān)系

心肌酶譜、纖維蛋白原和D-二聚體水平隨著神經(jīng)缺損程度升高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.3 腦梗死患者的心肌酶譜、纖維蛋白原和D-二聚體水平與病灶大小的關(guān)系

心肌酶譜、纖維蛋白原和D-二聚體水平隨著梗死灶范圍增大而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

3 討論

心肌酶正常存在于心肌、骨骼肌、肝臟、腎臟及腦組織中，這些臟器和組織損害時(shí)會(huì)引起心肌酶的改變。心肌酶在急性腦血管病時(shí)升高，其程度與病變范圍及意識(shí)障礙相一致[5]。腦梗死組的心肌酶譜的水平較對(duì)照組明顯提高，心肌酶譜水平隨著神經(jīng)缺損程度和腦梗死灶大小的升高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。其機(jī)制為[6-8]：大面積腦梗死大量神經(jīng)細(xì)胞壞死和腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞變性壞死，酶的漏出及血腦屏障破壞而引起血清心肌酶明顯升高；大面積腦梗死常伴有明顯腦水腫，大腦中線結(jié)構(gòu)移位或腦干受壓，影響下丘腦或腦干功能，導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮性增高或腦干心血管中樞功能失調(diào)，易出現(xiàn)心律失常和心肌缺血性損傷；大面積腦梗死時(shí)，交感-腎上腺素系統(tǒng)顯示出最大應(yīng)激性，兒茶酚胺、去甲腎上腺素分泌增加在心肌代謝中均起重要作用，分泌增加可引起心肌營(yíng)養(yǎng)不良性壞死；大面積腦梗死患者常伴有心臟瓣膜病或心房纖顫等心律失常，腦梗死后患者處于應(yīng)激狀態(tài)，加重心肌損害；大面積腦梗死常并發(fā)肺部感染、電解質(zhì)紊亂、多臟器功能損害。

腦梗死的生理過程是凝血和纖溶系統(tǒng)平衡異常，導(dǎo)致機(jī)體處于高凝狀態(tài)。纖維蛋白原為凝血系統(tǒng)最主要成分，也是一種急性反應(yīng)蛋白，在急性腦梗死時(shí)，心臟病和冠心病患者中明顯升高[9]，同時(shí)纖維蛋白原是血漿黏度的主要組成成分，能增強(qiáng)紅細(xì)胞和血小板的聚集性，使機(jī)體處于高黏和高凝狀態(tài)，最終導(dǎo)致機(jī)體血栓的形成[10]。D-二聚體為交聯(lián)纖維蛋白的降解產(chǎn)物，通常情況下凝血和纖溶處于動(dòng)態(tài)平衡[11]。當(dāng)腦梗死時(shí)，纖溶降低，凝血功能亢進(jìn)，導(dǎo)致機(jī)體D-二聚體水平升高。腦梗死組的纖維蛋白原和D-二聚體的水平較對(duì)照組明顯提高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。纖維蛋白原和D-二聚體水平隨著神經(jīng)缺損程度和腦梗死灶大小的升高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）?？赡芘c腦梗死時(shí)，纖溶和凝血平衡被打破，腦組織損傷后，顱內(nèi)壓升高，腦組織釋放大量的凝血因子，通過激素性和神經(jīng)性機(jī)制激活凝血系統(tǒng)，最終導(dǎo)致高凝狀態(tài)[12]。

總之，心肌酶譜聯(lián)合檢測(cè)纖維蛋白原和D-二聚體用于腦梗死的患者中檢測(cè)，有助于了解腦梗死病情及心臟受累程度，作為評(píng)價(jià)急性腦梗死發(fā)生、發(fā)展以及監(jiān)測(cè)病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，對(duì)臨床的診斷、治療具有重要參考價(jià)值。

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篇9

[關(guān)鍵詞] D-二聚體；高敏C反應(yīng)蛋白；抗凝血酶III；腦梗死

中圖分類號(hào)：R743.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2095-5200（2016）03-076-03

DOI：10.11876/mimt201603028

隨著我國(guó)人口老齡化，老年群體腦梗死人數(shù)有所增加[1]。腦梗死致殘、致死率均較高，判斷梗死程度，及早干預(yù)治療是改善患者預(yù)后關(guān)鍵。有研究發(fā)現(xiàn)， D-二聚體（D-dimer，D-D）、超敏C反應(yīng)蛋白（High sensitivity C reactive protein，hs-CRP）及抗凝血酶Ⅲ（Antithrombin Ⅲ，AT-Ⅲ）是機(jī)體炎性反應(yīng)、反映高凝和纖溶亢進(jìn)狀態(tài)的重要標(biāo)志物[2]。為進(jìn)一步探究其臨床價(jià)值，本研究對(duì)我院2012年9月―2014年9月收治的92例腦梗死患者血漿D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ水平進(jìn)行研究分析。

1 一般資料

1.1 病例資料

選取我院2012年9月―2014年9月收治的92例腦梗死患者納入腦梗死組，患者均首次發(fā)病，參照全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議（1996）制定的腦梗死臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)確診[3]。按照美國(guó)衛(wèi)生研究院卒中評(píng)分（NIHSS）分為輕度組（0～15分）65例，中重度組（>15分）27例。同期80例健康體檢者納入正常對(duì)照組。2組受試者一般臨床資料比較見表1，年齡、性別比例、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、血糖水平等指標(biāo)比較均未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），腦梗死患者TC、TG、HDL-C水平顯著高于正常組（P

1.2 研究方法

抽取2組受試者清晨空腹肘靜脈血3 mL，于30 min內(nèi)以3000 r/min離心10 min，保存于-20℃冰箱內(nèi)，統(tǒng)一檢測(cè)D-D、hs-CRP及AT-Ⅲ。D-D檢測(cè)使用膠乳凝集法，試劑盒購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司。hs-CRP檢測(cè)使用免疫散射比濁法，試劑盒購(gòu)自德國(guó)德靈公司。AT-Ⅲ檢測(cè)使用發(fā)光底物法，試劑盒購(gòu)自北京科美生物技術(shù)有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以（n/%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x±s）表示，t檢驗(yàn)。使用Pearson法分析D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ與腦梗死患者病情的相關(guān)性。以P

2 結(jié)果

2.1 腦梗死患者與健康體檢者血漿D-D、hs-CRP及

AT-Ⅲ水平比較

腦梗死組與正常組血漿D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ水平比較如表2所示。腦梗死組血漿D-D、hs-CRP水平顯著高于正常組，AT-Ⅲ水平顯著低于正常組（P

2.2 輕度與中重度腦梗死患者血漿D-D、hs-CRP及

AT-Ⅲ水平比較

輕度組與中重度組患者血漿D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ水平比較如表3所示。輕度組D-D水平顯著低于中重度組（P

2.3 D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ與腦梗死患者病情相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示，血漿D-D、hs-CRP水平與腦梗死病情呈顯著正相關(guān)（P

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是腦梗死最常見的病因之一，斑塊破裂引發(fā)的鈣超載、氧自由基釋放、炎性因子釋放、各類酶激活是導(dǎo)致腦組織損傷加劇的主要病理生理過程[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然腦梗死患者TC、TG、HDL-C等血脂指標(biāo)較正常組顯著增高，但其特異性不足，無法起到有效的預(yù)警作用。D-D是纖溶過程特異性標(biāo)志物之一，常用于纖溶酶和凝血酶活性的觀察。在本次研究中，腦梗死患者血漿D-D水平顯著升高，且中重度組患者D-D水平升高更為顯著，提示D-D在腦梗死的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。其機(jī)制可能為：腦梗死導(dǎo)致的腦組織損傷促進(jìn)凝血因子釋放，引發(fā)機(jī)體高凝狀態(tài)，患者凝血系統(tǒng)的激活進(jìn)一步促進(jìn)了纖溶系統(tǒng)代償性亢進(jìn)，導(dǎo)致纖維蛋白單體降解產(chǎn)物D-D釋放增加[5]。隨著患者病情加劇，其凝血功能異常更為嚴(yán)重，抗凝纖溶系統(tǒng)受到抑制，D-D水平進(jìn)一步上升。故血漿D-D水平與腦梗死病情呈顯著正相關(guān)。Palmieri等[6]亦指出，D-D在血漿中具有較高穩(wěn)定性，對(duì)體內(nèi)血栓形成的評(píng)價(jià)有著良好的敏感性與特異性，且檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、迅速，可作為腦梗死病情的檢測(cè)指標(biāo)。

hs-CRP由肝細(xì)胞受細(xì)胞因子誘導(dǎo)合成，是一種急性期反應(yīng)蛋白。腦梗死患者機(jī)體炎性反應(yīng)明顯，導(dǎo)致hs-CRP水平顯著升高?；颊吖Ｋ烂娣e越大，局部炎性反應(yīng)越嚴(yán)重[7]，故hs-CRP水平升高更為明顯，本研究中血漿hs-CRP與腦梗死病情呈顯著正相關(guān)，印證了上述結(jié)論。此外，hs-CRP還可促進(jìn)單核細(xì)胞釋放組織因子，加劇凝血纖溶系統(tǒng)失衡狀態(tài)，并可通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)損傷血管內(nèi)膜、增加血管通透性，使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊擴(kuò)大、血栓形成[8]?？梢哉J(rèn)為，hs-CRP與患者梗死面積、嚴(yán)重程度及預(yù)后均具有密切關(guān)聯(lián)，早期積極干預(yù)hs-CRP水平有望延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，改善患者預(yù)后。

AT-Ⅲ是一種由肝臟合成的蛋白酶抑制劑，主要參與彌散性血管內(nèi)凝血、肝病等各類血液障礙疾病[9]，在抗凝系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。正常情況下，機(jī)體抗凝、凝血系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，若機(jī)體發(fā)生凝血功能異常，往往導(dǎo)致凝血系統(tǒng)因子激活、抗凝纖溶系統(tǒng)抑制，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，促進(jìn)血栓形成[10]。本研究可見，腦梗死患者AT-Ⅲ水平顯著低于正常組，且中重度腦梗死患者AT-Ⅲ水平下降更為明顯，提示腦梗死患者凝血因子激活、凝血酶活化分泌過程消耗了大量的AT-Ⅲ。同時(shí)，機(jī)體凝血功能亢進(jìn)狀態(tài)亦影響了AT-Ⅲ合成[11]，導(dǎo)致AT-Ⅲ水平進(jìn)一步下降。因此，AT-Ⅲ能夠有效反映機(jī)體抗凝功能狀態(tài)，動(dòng)態(tài)觀察血漿AT-Ⅲ水平能夠明確腦梗死病程的動(dòng)態(tài)變化[12]。

在本次研究中，腦梗死患者血漿D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ水平均與健康體檢者存在顯著差異，且病情越嚴(yán)重，患者上述指標(biāo)變化越明顯。說明腦梗死患者存在明顯的凝血功能異常、炎性因子高表達(dá)狀態(tài)，據(jù)此進(jìn)行臨床診斷、預(yù)后評(píng)估，并實(shí)施合理的干預(yù)方案，對(duì)延緩病情進(jìn)展、改善患者預(yù)后均具有重要意義。

參 考 文 獻(xiàn)

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篇10

摘要

為探究不同熱處理方式的小米蛋白質(zhì)的消化情況，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶體外模擬消化法測(cè)定蒸制、煮制、擠壓處理并經(jīng)淀粉酶解的小米蛋白消化率。對(duì)從小米生粉中提取的醇溶蛋白蒸制、煮制的蛋白消化率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，經(jīng)120min的胃蛋白酶和胰蛋白酶處理，蒸制、煮制和擠壓處理的小米的體外蛋白消化率分別較未處理小米降低了31.00%，17.15%和11.02%。蒸煮的醇溶蛋白消化率也分別降低了35.57%和28.63%。蒸煮對(duì)小麥蛋白的消化率有不利影響，擠壓處理優(yōu)于蒸煮處理。蒸煮處理降低小麥蛋白體外消化率可能與醇溶蛋白消化率的降低有關(guān)。

關(guān)鍵詞

小米；蒸制；煮制；擠壓；蛋白消化率

小米隸屬禾本科草本植物，是世界上主要糧食作物之一，主要種植在亞洲和非洲。我國(guó)種植的多為谷子，谷子脫殼后的種仁即小米。小米適口性好，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受我國(guó)北方人民的喜愛。小米的蛋白質(zhì)含量較高，其干基平均含量為13.08%，高于其它禾谷類作物[1]。其中醇溶蛋白占46%，是小米中含量最多的一種蛋白，此外還有21.1%的堿溶蛋白以及5.5%的清蛋白和球蛋白[2]。通常用來評(píng)價(jià)食物蛋白好壞的最主要的2個(gè)指標(biāo)是蛋白質(zhì)的氨基酸組成和蛋白消化率[3]。在小米蛋白質(zhì)的氨基酸組成模式中，谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸和天門冬氨酸是小米氨基酸的主要組成部分，賴氨酸和蘇氨酸是小米中的第一、第二限制性氨基酸[4-5]。蛋白消化率是動(dòng)物從食物中所消化吸收的蛋白質(zhì)占總攝入量的百分比，是評(píng)價(jià)食物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)[6]。對(duì)于食物蛋白質(zhì)消化率的研究通常采用建立蛋白質(zhì)體外消化模型模擬食物在胃和小腸中的消化情況的方法，胃蛋白酶-胰蛋白酶體外模擬消化法是一種常見的方法。影響蛋白質(zhì)消化性的因素可歸為兩類：外因主要是酚類化合物、植酸、碳水化合物、脂類及蛋白酶抑制劑等，內(nèi)因主要是指蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)特性[7]。蛋白質(zhì)經(jīng)加熱處理后其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，從而影響其消化率。絕大多數(shù)谷物如大米、玉米、蕎麥等在一定的加熱處理之后的蛋白消化率都會(huì)有所提高[8-10]，但也有個(gè)別谷物如高粱，蒸煮之后的蛋白消化率反而降低[11]。小米作為一種公認(rèn)的營(yíng)養(yǎng)保健養(yǎng)胃米，它與高粱在蛋白質(zhì)組成上非常相似。劉思思[12]研究發(fā)現(xiàn)，蒸煮之后打漿的小米乳蛋白質(zhì)具有較低的消化率，而小米醇溶蛋白本身形成的二硫鍵及強(qiáng)烈的疏水性是導(dǎo)致小米蛋白抗消化的主要原因。本研究主要采用胃蛋白酶-胰蛋白酶體外模擬消化的方法，分析小米和小米醇溶蛋白經(jīng)蒸制、煮制和擠壓處理之后蛋白消化率的變化情況，探討不同加熱處理方式對(duì)小米蛋白消化率的影響，為小米蛋白的品質(zhì)評(píng)價(jià)以及小米相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料谷子：長(zhǎng)生07，產(chǎn)自山西。

1.2主要試劑胃蛋白酶（活性：800~2500U/mg），北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（活性：250Umg），北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；α-淀粉酶（活性>6000U/mg），北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.3主要設(shè)備與儀器三立式搗精機(jī)（SY88-TH），雙龍機(jī)械產(chǎn)業(yè)；高速萬能粉碎機(jī)（LD-T300A），上海頂帥電器有限公司；雙螺桿試驗(yàn)機(jī)（DS30-Ⅲ），山東賽信機(jī)械有限公司；恒溫水浴振蕩器（SHA-BA），金壇市榮華儀器制造有限公司；冷凍干燥機(jī)（LGJ-2C），北京市四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；高速冷凍離心機(jī)（GL-20G-Ⅱ），上海安亭科學(xué)儀器廠；控溫消煮爐（KXL-1010），北京市通潤(rùn)源機(jī)電技術(shù)責(zé)任有限公司；電子精密天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；梅特勒-托利多pH計(jì)（FE20），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；凱氏定氮儀（KDY-9820），北京市通潤(rùn)源機(jī)電技術(shù)責(zé)任有限公司。

1.4方法

1.4.1樣品制備谷子樣品經(jīng)搗精機(jī)脫殼，分別做以下處理：蒸制：小米與水以1∶5（m∶V）混合，上汽后蒸制25min，于烘箱內(nèi)58℃烘干8h，磨粉，糊化度為92.67%。煮制：小米與水以1∶20（m∶V）混合，水開后煮制30min，于烘箱內(nèi)58℃烘干12h后磨粉，糊化度為91.88%。擠壓：小米磨粉，水分調(diào)制16%，雙螺桿擠壓設(shè)備設(shè)定：一區(qū)溫度90℃，二區(qū)150℃，三區(qū)190℃，螺桿轉(zhuǎn)速120r/min，喂料速度25r/min，糊化度為92.05%。

1.4.2小米醇溶蛋白提取小米脫殼后磨粉，過40目篩，小米粉∶正己烷=1∶5（W/V）振蕩4h脫脂，靜止1h除去上清液，將沉淀在通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干。風(fēng)干的小米粉粉碎后過60目篩，用65%乙醇溶液以料液比1∶6，75℃水浴振蕩1h，浸提液8000r/min離心15min。取上清液在4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行透析，2h換1次水。換水3~4次后取透析袋內(nèi)溶液8000r/min離心15min，將沉淀在-20℃冰箱內(nèi)速凍，于冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥12h，獲得的蛋白純度在85%以上。

1.4.3淀粉酶處理取5g樣品于150mL錐形瓶中，以料液比1∶5（m∶V）加水，37℃水浴5min，以酶與底物比例為1∶100（m∶m）加入淀粉酶，在恒溫水浴振蕩器上37℃水浴30min，以確保樣品中的淀粉充分水解。

1.4.4蛋白質(zhì)體外消化小米蛋白質(zhì)的體外消化實(shí)驗(yàn)采用胃蛋白酶-胰蛋白酶體外消化模型。具體操作如下：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的樣品分散于0.1mol/LHCl中形成50g/L的溶液，置于37℃水浴中預(yù)熱5min，以酶∶底物為1∶100（m∶m）加入胃蛋白酶，在37℃恒溫振蕩器上反應(yīng)，分別在不同的消化時(shí)間（0，30，60，120min）取樣，用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH7.0終止消化反應(yīng)。對(duì)120min時(shí)所得消化液調(diào)節(jié)pH7.0，以酶∶底物為1∶100（m∶m）加入胰蛋白酶，在消化30，60，90，120min之后煮沸停止反應(yīng)，分別取樣分析[13]。

1.4.5體外消化率測(cè)定體外消化率采用TCA-NSI（三氯乙酸氮溶指數(shù)）法[14]測(cè)定和計(jì)算。取5mL不同消化液于5mL10%TCA中，4000r/min離心20min，沉淀用10%TCA洗滌2次，離心得到TCA不溶組分。TCA不溶性氮含量采用凱氏定氮法測(cè)得，氮含量采用凱氏定氮法（GB5009.5-2010）測(cè)定，消化過程氮釋放量由下式計(jì)算。

2結(jié)果分析

2.1不同加熱處理的小米蛋白消化率經(jīng)蒸制、煮制和擠壓處理的小米樣品蛋白消化率變化情況如圖1所示。胃蛋白酶和胰蛋白酶各消化120min，未經(jīng)處理的小米蛋白消化率達(dá)到66.38%，而經(jīng)蒸制、煮制和擠壓處理的小米蛋白消化率分別下降了41.65%，32.52%和1.94%。在胃蛋白酶消化過程中，蒸小米、煮小米和擠壓小米蛋白消化率的變化率在前30min較大，之后逐漸減小，甚至趨于0，而生小米的蛋白消化率的變化率則在前30min較小，之后迅速提高。這可能與包裹小米蛋白體的其它成分如淀粉等有關(guān)。這一推測(cè)也可在后面經(jīng)淀粉酶解后不同加熱處理的小米蛋白的消化率的變化中得到印證。在胰蛋白酶消化過程中，除擠壓小米外，生小米和蒸煮小米的蛋白消化率的變化率幾乎不再變化，而擠壓小米的蛋白消化率先增高后趨于0。通常在谷物蛋白體周圍都存在淀粉顆粒而影響蛋白的消化。在人體消化食物的過程中，先有一個(gè)唾液淀粉酶解的過程。將經(jīng)各種處理的小米先用淀粉酶解，后用胃蛋白酶和胰蛋白酶消化。由圖2可看出，經(jīng)淀粉酶解的各種處理的小米蛋白消化率顯著提高。表1列出最終消化率的對(duì)比情況。經(jīng)淀粉酶解后，生小米、蒸小米、煮小米和擠壓小米的蛋白消化率分別提高了29.89%，53.60%，59.48%和17.87%。生小米在經(jīng)淀粉酶處理后蛋白消化率達(dá)到86.22%，比經(jīng)相同條件蒸煮處理的大米蛋白消化率（75.84%和81.09%）高。幾種加熱處理后小米的蛋白消化率變化情況較未加淀粉酶時(shí)有一定的差異。從圖2可看出，淀粉酶解后蒸小米、煮小米和擠壓小米的蛋白消化率較生小米分別降低了31.00%，17.15%和11.02%。在胃蛋白酶解階段，小米蛋白消化率的變化率在前30min較大，之后減小，甚至趨近于0。在胃蛋白酶終止作用時(shí)，蒸小米、煮小米和擠壓小米的蛋白消化率非常接近。在胰蛋白酶作用階段，生小米和蒸小米的蛋白消化率幾乎不再變化，擠壓小米的蛋白消化率先升高后趨于平緩，煮小米的消化率則呈直線升高。

2.2不同加熱處理的小米醇溶蛋白的消化率小米蛋白中約有46%為醇溶蛋白[3]，是含量最多的一種蛋白。其經(jīng)不同加工處理的消化率的變化對(duì)小米總蛋白的消化率有一定影響。因本試驗(yàn)中采用雙螺桿擠壓膨化機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行擠壓膨化，所需物料量較大，故沒有研究擠壓處理的醇溶蛋白。如圖3所示，蒸制和煮制的小米醇溶蛋白的消化率分別為54.21%和48.94%，較生蛋白分別降低了35.57%和28.63%。在胃蛋白酶消化階段，前30min蒸蛋白的消化率最高，之后趨于平緩，直至胰蛋白酶消化結(jié)束。生蛋白和煮蛋白的消化率的變化趨勢(shì)相同，在胃蛋白酶消化階段，前60min消化率提高較快，之后減慢，甚至趨于平緩；在胰蛋白酶消化階段，消化率先提高后趨于平緩。醇溶蛋白的消化率變化規(guī)律和小米蛋白消化率變化趨勢(shì)相似，推測(cè)醇溶蛋白在加熱過程中的變化，很可能是影響小米蛋白消化率的一個(gè)主要因素。

3討論

濕熱處理對(duì)蛋白質(zhì)的影響較大，對(duì)于大多數(shù)谷物來說，適宜的熱處理可提高蛋白質(zhì)的消化率和必需氨基酸的生物有效性[15]。也有一些谷物在濕熱處理下蛋白質(zhì)的消化率反而降低。本研究發(fā)現(xiàn)蒸煮加工對(duì)小米蛋白的消化具有不利的影響，這與之前很多研究[10、16-18]報(bào)道的高粱蛋白質(zhì)消化率因蒸煮而降低的結(jié)果類似。這些研究發(fā)現(xiàn)醇溶蛋白的低溶解性和二硫鍵的形成，很可能是造成高粱蒸煮后蛋白消化率降低的主要原因。Hamaker等[10]通過不同的溶劑對(duì)未經(jīng)蒸煮和蒸煮的高粱醇溶蛋白進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)蒸煮后用酒精提取的醇溶蛋白成分明顯減少，而用乙醇加2-巰基乙醇和亞硫酸鈉的溶劑提取的醇溶蛋白明顯增多，由此得出蒸煮之后醇溶蛋白的溶解度降低的結(jié)論。早在1991年，Shull[19]等根據(jù)分子質(zhì)量將醇溶蛋白分成3類，即位于蛋白體中心的α-醇溶蛋白（24ku和26ku）以及位于的β-醇溶蛋白（20，18ku和16ku）和γ-醇溶蛋白（28ku）。Rom[17]和Oria[18]等通過電鏡觀察到消化過程中，經(jīng)蒸煮的高粱蛋白體的很難被酶破壞，而在添加了能夠破壞二硫鍵的還原劑后，其會(huì)出現(xiàn)明顯的凹陷，推測(cè)是由于β-和γ-醇溶蛋白通過二硫鍵形成抵抗酶的聚合物，從而保護(hù)內(nèi)部的α-醇溶蛋白不被消化。Hamaker[10]等通過電泳的方法也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果。

劉思思[12]對(duì)小米所含4種蛋白進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)含量最多的醇溶蛋白主要分布在低分子質(zhì)量范圍，其電泳圖譜與高粱基本相同，有α-（18～21ku）、β-（15ku）、γ-（23ku）醇溶蛋白以及分布在12ku的4條譜帶。通常小米蛋白在60℃左右會(huì)發(fā)生熱變性。在對(duì)小米乳經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化的殘?jiān)娪竞?，劉思思[12]發(fā)現(xiàn)醇溶蛋白僅有18～21ku的少部分蛋白條帶消失，進(jìn)一步經(jīng)亞硫酸氫鈉處理消化殘?jiān)蟠蟛糠蛛娪緱l帶消失，說明小米醇溶蛋白中的二硫鍵是影響小米蛋白消化率的一個(gè)主要的原因。小米醇溶蛋白，如高粱醇溶蛋白一樣，通過二硫鍵在形成致密的保護(hù)結(jié)構(gòu)，阻止蛋白酶與蛋白的結(jié)合，從而導(dǎo)致消化率低。劉思思[12]還發(fā)現(xiàn)，蒸煮后的小米醇溶蛋白和生的醇溶蛋白的消化殘?jiān)脕喠蛩釟溻c處理后，其電泳條帶無顯著差異，說明亞基間未形成新的二硫鍵。本研究發(fā)現(xiàn)蒸煮后小米蛋白的消化率明顯降低。濕熱處理后小米蛋白質(zhì)消化率的降低是否與醇溶蛋白加熱后形成二硫鍵有關(guān)，這尚需證實(shí)。CalvinOnyango[20]等人對(duì)玉米-小米預(yù)混粉烹煮、發(fā)酵、擠壓等處理后也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)發(fā)酵、擠壓以及發(fā)酵后再擠壓幾種處理后，預(yù)混粉的蛋白消化率較生粉明顯提高，然而經(jīng)發(fā)酵再烹煮后，預(yù)混粉的蛋白消化率甚至較生粉還低，CalvinOnyango推測(cè)這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間加熱熟化導(dǎo)致蛋白多聚體的形成，從而抵抗酶的作用而致。擠壓作為一種高溫短時(shí)的加熱處理方式，在加工過程中，對(duì)谷物蛋白質(zhì)有很大的影響。擠壓溫度和樣品水分是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)。通過擠壓導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性可以暴露蛋白酶作用位點(diǎn)，從而提高蛋白消化率[20]，然而也會(huì)通過疏水作用、二硫鍵連同其它形式的共價(jià)鍵共同作用，使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，導(dǎo)致溶解性降低[21]，從而降低蛋白質(zhì)消化率。通過選擇合適的擠壓溫度和樣品水分來實(shí)現(xiàn)提高小米蛋白消化率的目的。

4結(jié)論