導(dǎo)語：如何才能寫好一篇上皮細胞，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

    患者，女，62歲，農(nóng)民，因左側(cè)腮腺區(qū)無痛性腫塊，于2006年10月入院。1年前發(fā)現(xiàn)左側(cè)腮腺區(qū)有一腫物，無痛，緩慢生長，一直未作特殊處理。入院查體：生命體征正常，全身重要臟器檢查未見異常。?？茩z查：左側(cè)腮腺區(qū)隆起，可觸及一3cm×2cm×2cm大小腫塊，邊界不清質(zhì)中滑動無觸痛，無周圍性面癱征，頸部淺表淋巴結(jié)無腫大。輔助檢查：左側(cè)腮腺腫塊穿刺細胞學(xué)檢查提示：瘤樣腺上皮細胞及泡沫細胞。入院診斷：左側(cè)腮腺混合瘤。入院后在全麻插管下行左腮腺淺葉及混合瘤切除術(shù)，術(shù)中見腫物3cm×2cm×1cm大小，呈結(jié)節(jié)狀，位于淺葉與深葉之間，包膜完整，質(zhì)中，面神經(jīng)分支均從包塊表面穿過，尚無明顯粘連，手術(shù)順利。病理學(xué)檢查：灰紅色不規(guī)則組織3cm×2cm×1cm大小的腫物一個，無明顯包膜，切面灰白灰褐色，質(zhì)中。鏡下檢查：腫瘤呈浸潤性生長，由兩種細胞構(gòu)成典型雙套管狀結(jié)構(gòu)，管腔內(nèi)層為立方細胞，管腔外層為透明細胞，瘤細胞輕度異型。免疫組織化學(xué)：ck、ema內(nèi)層腺上皮呈陽性反應(yīng)；s100、sma外層肌上皮呈陽性反應(yīng)。病理診斷：左側(cè)腮腺上皮肌上皮細胞癌,見圖1～3。

    2  討論

    上皮肌上皮癌（epithelialmyoepithdial carcinoma，emc)，又稱閏管癌，是一種極少見的雙細胞型、低度惡性涎腺腫瘤，患病率僅占涎腺腫瘤的0.5％[1]。臨床上較少見。emc好發(fā)于老年人，女性稍多見，腮腺為最常見部位[2]。其組織病理學(xué)上可見腫瘤由內(nèi)層的腺上皮細胞和外層的透明肌上皮細胞構(gòu)成。腺上皮細胞立方形或矮柱狀，胞漿嗜酸性紅染，核圓形位于中央，此細胞形成腺管，其外層為透明的肌上皮細胞圍繞，胞漿透明，瘤細胞核均有一定異型性，核分裂罕見。上述兩種細胞構(gòu)成典型的同心圓或雙管樣結(jié)構(gòu)，瘤細胞均有不同程度包膜侵犯。免疫組化染色結(jié)果示細胞角蛋白、s100蛋白及肌動蛋白反應(yīng)陽性，表明上皮—肌上皮癌與正常組織的肌上皮細胞和涎腺肌上皮瘤具有相同的免疫特性，含有相同的抗原成分[3]，可作為與其他涎腺腫瘤鑒別的標(biāo)志物。此癌的生物學(xué)行為以往大部分文獻均將其列為低度惡性腫瘤之一，但李浩等[4]認為涎腺上皮肌上皮癌屬中高度惡性腫瘤，因為腫瘤呈浸潤性生長，邊界不清楚，局部復(fù)發(fā)率高，血行轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后較差。涎腺上皮肌上皮癌的治療以手術(shù)為主，首次手術(shù)非常關(guān)鍵，應(yīng)有足夠的邊界；如果腮腺腫瘤范圍大，緊貼面神經(jīng)或復(fù)發(fā)性腫瘤者，常需犧牲面神經(jīng)。本例因為腮腺腫瘤位于淺葉與深葉之間，邊界清楚，面神經(jīng)分支均從包塊表面穿過，尚無明顯粘連，而行保留面神經(jīng)的腺體淺葉及腫瘤切除術(shù)，并給予術(shù)后輔助放射治療，以達到臨床治愈，本例目前尚在隨訪中。如何降低局部復(fù)發(fā)率，改善患者的預(yù)后是近年來對涎腺上皮—肌上皮癌研究的熱點。

【參考文獻】

[1] nagao t,sugano i,ishida y,et al.salivary gland malignant myoepithelioma:a clinicopathologic and immunohistochemical study of ten cases［j］.cancer,1998,83(7):12921299.

篇2

【Abstract】　AIM: To study the injuring effect of lipopolysaccharide(LPS) on alveolar type Ⅱ cells (ATⅡ) in acute lung injury (ALI). METHODS: Sixteen rats were evenly randomized into 2 groups: control group and LPS group. Control group were injected physiological saline through jugular vein; LPS group were injected LPS through jugular vein. Four hours later， the rats were sacrificed to collect the bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Surface tension， total phospholipids(TPL)， total protein(TP) and maleic dialdehyde(MDA) contents in the BALF were measured; the activities of lactate dehydrogenase(LDH) and alkaline phosphatase(AKP) in BALF were detected. The pathological features of right lungs were observed under an optical microscope. RESULTS: Compared with control group， LPS could increase the TP content ［(28±17) vs (100±32) g/L， P

【Keywords】　 lipopolysaccharides; pulmonary surfactants; acute lung/injuries

【摘要】　目的： 研究急性肺損傷時脂多糖(LPS)對肺泡Ⅱ型上皮細胞(ATⅡ)的損傷作用. 方法： 將16只SD大鼠隨機等分為生理鹽水對照組、LPS模型組. 通過頸外靜脈給藥4 h后處死動物，收集肺泡灌洗液(BALF)，測定BALF表面張力、總磷脂含量(TPL)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)、丙二醛(MDA)及總蛋白(TP)含量；取右肺下葉，行HE染色光鏡觀察. 結(jié)果： 與對照組相比，LPS可提高BALF中LDH活性［（8.4±1.9） vs (4.8±1.9) μkat /L， P

【關(guān)鍵詞】 脂多糖類；肺表面活性劑；急性病，肺/損傷

急性肺損傷(ALI)由各種肺內(nèi)外致病因素所致. 發(fā)病機制復(fù)雜、治療手段有限，尤其是在急性呼吸窘迫綜合征階段，死亡率高達50%以上. 肺泡Ⅱ型上皮細胞(ATⅡ) 不僅可合成、分泌肺表面活性物質(zhì)(PS)，還具有修復(fù)肺泡上皮、肺水轉(zhuǎn)運、局部免疫等多種重要生理功能［1-3］，該細胞損傷是ALI發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)之一. 脂多糖(LPS)是內(nèi)毒素的主要生物活性成分，具有極強的生物活性，且肺是內(nèi)毒素的主要靶器官之一. 現(xiàn)已明確革蘭陰性菌感染、內(nèi)毒素血癥是ALI主要致病原因之一. 但是LPS是否對ATⅡ有損傷作用還存在較大爭議，我們擬通過動物實驗證實LPS對ATⅡ的損傷作用，進一步揭示ALI的發(fā)病機制.

1材料和方法

1.1材料成年SD大鼠16只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半（第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心）；LPS（美國Sigma公司）；堿性磷酸酶(AKP)，乳酸脫氫酶(LDH)，丙二醛(MDA)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；磷標(biāo)準(zhǔn)溶液由第四軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防系營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室高雙斌高級實驗師惠贈；725C型紫外可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）.1.2方法

1.2.1動物分組將動物隨機分為2組： ① 對照組(n=8)，經(jīng)頸外靜脈導(dǎo)管注入與LPS組等容積生理鹽水; ② 模型組(n=8)，經(jīng)頸外靜脈導(dǎo)管注射2 mg/kg LPS，以復(fù)制ALI動物模型.

1.2.2手術(shù)及標(biāo)本采集將大鼠腹腔注射200 g/L烏拉坦5 mL/kg，麻醉后固定于鼠板;沿頸部正中切開皮膚，分離一側(cè)頸外靜脈，插入導(dǎo)管給藥，給藥后4 h行頸椎脫臼處死并行氣管插管術(shù)，以20 mL/kg生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗，連續(xù)3次，取第1次灌洗所得肺泡灌洗液(BALF) 0.2 mL用于表面張力的測量，收集所有BALF并記錄BALF回收量，1000 r/min離心10 min，取上清，取其中1.4 mL用于測AKP， MDA， LDH，總蛋白(TP)等，剩余上清用于磷脂的提取.

1.2.3肺組織的光鏡觀察取右肺下葉，以40 mL/L甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察.

1.2.4BALF中AKP， MDA， LDH， TP的測量根據(jù)試劑盒說明書測量BALF中AKP， MDA， LDH的含量. 考馬斯亮藍G250染色法測定TP含量.

1.2.5總磷脂(TPL)的測定采用Bartlett法［4］略有改進. BALF中加入2倍體積的氯仿-甲醇（2∶1， V/V）萃取液，震蕩1 min， 2500 r/min離心10 min，棄上層液體但不棄界面雜質(zhì). 加入1/4體積的甲醇-水（1∶1， V/V）萃取液，震蕩1 min， 2500 r/min離心10 min. 棄去上層液及界面雜質(zhì)，氮氣吹干，即得到TPL， -20℃保存待測. 將TPL加入1 mL高氯酸加熱，溫度由低到高逐漸上升，直至顏色由黑變白表示磷脂完全氧化為無機磷，繼續(xù)加熱蒸干高氯酸. 磷鉬藍比色法測定樣本中無機磷含量. 根據(jù)磷脂中磷含量約為4%算出磷脂含量，再計算出每公斤體質(zhì)量的磷脂含量.

轉(zhuǎn)貼于

1.2.6表面張力的測定用毛細管法測定肺泡BALF表面相對張力，即將毛細玻璃管垂直插入到BALF中，測量毛細管內(nèi)外液面高度差，然后根據(jù)拉普拉斯方程σ=rρg(h+r/3)/2計算出BALF的表面張力，以此來反映PS的含量及功能. 其中，σ為表面張力(單位為N/cm)，r為毛細管的半徑，ρ為液體密度，g為重力加速度，h為液體上升高度.

統(tǒng)計學(xué)處理：　數(shù)據(jù)均以x±s表示， 組間差別以兩樣本t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理，P

2結(jié)果

2.1LPS對肺組織的損傷作用LPS可使BALF中TP含量、LDH活性升高，使BALF中MDA含量升高(表1). 光鏡下可見LPS組大鼠肺間質(zhì)較對照組明顯增寬，有白細胞浸潤，肺泡萎陷，肺不張，肺泡腔偶見紅細胞，表現(xiàn)為間質(zhì)性肺水腫（圖1）.表1脂多糖對肺組織及肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷作用

2.2LPS對ATⅡ的損傷作用LPS可使BALF中AKP活性升高近4倍，使BALF中TPL含量明顯下降，表面張力明顯升高(表1).

3討論

革蘭氏陰性菌感染、內(nèi)毒素血癥是引發(fā)ALI的常見原因. ATⅡ具有合成、分泌PS、增殖和修復(fù)、肺水轉(zhuǎn)運及局部免疫等多種重要生理功能［1-3］，該細胞損傷是ALI發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)之一［5-6］. ALI時LPS是否對ATⅡ有損傷作用還存在較大爭議. 鄭閔琴等［7］研究證明，LPS能使PS含量及活性下降，ATⅡ腫脹、變性、板層小體減少，肺組織面積密度增加. Romeron等［8］研究表明，LPS不僅對ATⅡ無損傷作用，還可以促進ATⅡ分泌PS. 本實驗中，LPS可使BALF中TP含量升高，表明肺泡滲出增加； LDH是胞內(nèi)酶，LPS組BALF中LDH活性增加表明細胞損傷加重；LPS組BALF中MDA含量升高，提示脂質(zhì)過氧化作用增強. 上述3項指標(biāo)變化符合急性肺損傷表現(xiàn)，表明LPS性急性肺損傷模型復(fù)制成功. AKP是ATⅡ的特異性分化標(biāo)志，當(dāng)ATⅡ損傷時被釋放入BALF，LPS使BALF中AKP活性增強，表明其對ATⅡ有損傷作用；磷脂是PS的主要成分，TPL能反映PS含量變化，我們利用定磷法測量BALF中TPL含量，結(jié)果表明LPS可使BALF中TPL含量降低；表面張力反映了PS降低肺泡表面張力的功能，是ATⅡ合成、分泌PS的質(zhì)和量的綜合體現(xiàn). 綜合TPL及表面張力的變化，說表明LPS可以抑制PS的合成、分泌，其機制可能為內(nèi)毒素血癥時，肺血流阻力增加，肺組織缺血、缺氧，引起ATⅡ損傷，進而影響PS的合成、分泌，也可能是LPS對ATⅡ有直接損傷作用，進而使PS合成和分泌減少，具體作用機制尚有待于進一步研究.

參考文獻

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篇3

微絨毛、纖毛。上皮細胞游離面的特化上皮組織的游離面是直接與外環(huán)境相接觸的，常分化形成適應(yīng)其特殊生理功能的結(jié)構(gòu)，形式多樣。

除陸生動物皮膚的表面接觸的外環(huán)境為空氣外，一般上皮組織接觸的都是濕潤的環(huán)境。陸生脊椎動物皮膚的表面為復(fù)層上皮，表層細胞角質(zhì)化形成角質(zhì)蛋白防止水分蒸發(fā)，并有保護作用。

（來源：文章屋網(wǎng) ）

篇4

【關(guān)鍵詞】 氯化錳

錳是一種較常見的職業(yè)毒物。近年來，隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，錳的生產(chǎn)和消費日益增多，錳與生殖健康的關(guān)系逐漸引起人們的重視〔1〕。有研究表明，若機體攝入過量的錳，會導(dǎo)致組織發(fā)生病理學(xué)改變，性功能障礙及組織生化酶學(xué)的改變〔2〕。本實驗采用氯化錳染毒小鼠，動態(tài)觀察小鼠臟器系數(shù)；檢測小鼠染錳56d生育指數(shù)及生殖指標(biāo)的變化；定量組織學(xué)分析生精上皮細胞數(shù)的變化，以探討錳對雄性小鼠生殖毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

1 材料與方法

11 動物 6～8周雄性昆明種小鼠140只，體重23～28g(貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)，均為普通級動物，合格證號為scxk 2002-0001。普通飼料飼養(yǎng)。

12 主要試劑及儀器 MnCl2·4H2O(分析純，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司)；電子稱（武漢自動化儀器廠）；BI2000圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟公司產(chǎn)品）。

13 方法

131 動物分組 雄性昆明種小鼠140只，隨機分成3個染錳組和1個對照組，每組35只。

132 染錳方法 3個染錳組分別給予腹腔注射氯化錳（75，150和300mg/kg）。對照組采用等容生理鹽水腹腔注射，每周5d，1次/d。每周測小鼠的體重1次，以調(diào)整用藥量。

133 標(biāo)本收集 分別于染錳3，7，14，28，56d每組隨機抽取5只小鼠，脫臼法處死，立即分離雙側(cè)，生理鹽水沖洗，用濾紙吸干后稱重，用于測定臟器系數(shù)。取小鼠左側(cè)迅速置于10%甲醛溶液內(nèi)固定，常規(guī)方法脫水，石蠟包埋。

14 觀察指標(biāo)及方法

141 臟器系數(shù) 稱重后按照公式：臟器系數(shù)=重（g）/小鼠體重（g）×100%。

142 生殖實驗 于染錳第56d，將剩余各組小鼠（每組10只），分別與未經(jīng)處理的成熟雌性小鼠1：1合籠一周后，取出雄鼠。雌鼠以合籠第1d為妊娠0d，于妊娠第19d處死，計錄妊娠母鼠數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)。計算：(1)雄鼠生育指數(shù)（使雌鼠受孕的雄鼠數(shù)/總的雄鼠數(shù)×100%）；(2)每窩平均活胎數(shù)（活胎總數(shù)/受孕母鼠總數(shù)）；(3)平均著床數(shù)（胎鼠總數(shù)/受孕母鼠總數(shù)）；(4)總死胎數(shù)（死胎總數(shù)/胎鼠總數(shù)×100%）〔3〕。

143 定量組織學(xué)分析 取染錳56d用蘇木素-伊紅(HE)染色，每例切片一張，在圖象分析儀下每例測定10個曲細精管的橫截面積及管內(nèi)生精上皮細胞數(shù)量。

15 統(tǒng)計分析 采用SPSS110統(tǒng)計軟件進行分析。用方差分析進行檢驗。生育指數(shù)、總死胎率采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

21 染錳劑量與時間對小鼠臟器系數(shù)的影響(表1) 由表1可見，于染錳第28d，30mg/kg組臟器系數(shù)開始降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜005）；染錳第56d，15與30mg/kg組臟器系數(shù)均與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜005，P＜001）。

表1 染錳劑量與時間對小鼠臟器系數(shù)的影響（略）

注：與對照組比較，a P

22 染錳對雄性小鼠生育能力的影響(表2) 染錳56d，75，15mg/kg組生育指數(shù)低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>005）；30mg/kg組生育指數(shù)低于對照組（P

表2 染錳對雄性小鼠生殖能力的影響（略）

注：與對照組比較，a P

23 染錳對小鼠曲細精管橫截面積及管內(nèi)生精上皮細胞數(shù)量的影響(表3) 定量組織學(xué)分析結(jié)果表明，染錳可使小鼠曲細精管橫截面積明顯減少，管內(nèi)發(fā)育各階段的生精細胞數(shù)量降低。染錳56d，各染錳組與對照組比較，其曲細精管橫截面積及生精上皮細胞定量測定數(shù)值均明顯減少（P

表3 染錳56d小鼠曲細精管橫截面積和生精上皮細胞數(shù)量的變化（略）

注：與對照組比較，b P

3 討論

錳作為機體內(nèi)某些代謝酶的組成部分或酶的激動劑，參與了許多生物化學(xué)反應(yīng)，是機體必需的微量元素之一〔4〕。但過量的錳在體內(nèi)蓄積，會對機體產(chǎn)生不良作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨染錳劑量的增加和時間的延長，小鼠重量下降，臟器系數(shù)明顯降低，提示錳可通過血睪屏障，損害的正常結(jié)構(gòu)，干擾的生長和發(fā)育過程〔5〕。有研究發(fā)現(xiàn)，錳能使多巴胺（DA）和5-羥色胺（5-HT）含量減少，從而降低了DA和5-HT對垂體促性腺激素（LH、FSH）的抑制，導(dǎo)致FSH和LH水平升高〔6〕。下丘腦血循環(huán)中性激素水平的負反饋調(diào)節(jié)作用而使睪酮濃度下降，從而使數(shù)量減少。錳還可抑制乳酸脫氫酶（LDH），阻礙能量來源，干擾粗線期初級精母細胞的減數(shù)分裂及分化為的過程，從而影響的數(shù)量和活力。錳最先抑制曲細精管生精上皮細胞的琥珀酸脫氫酶，干擾曲細精管細胞的能量合成，導(dǎo)致細胞代謝降低，使曲細精管生精細胞、Sertoli細胞受損〔7〕。研究證實，錳是一種較強的染色體斷裂劑〔5〕。氯化錳可使生精細胞發(fā)生基因突變和染色體畸變，從而導(dǎo)致小鼠畸形率升高。Gavin等認為錳可直接作用于線粒體呼吸鏈而影響線粒體的氧化磷酸化，對線粒體功能具有抑制作用〔8〕。Galvani等〔9〕利用嗜鎘細胞瘤(PCI2)細胞進行體外研究表明，MnCl2可抑制呼吸鏈中的還原型煙酰胺腺膘呤二核苷酸(NADH)脫氫酶和NADH細胞色素還原酶的活性。從而影響電子傳遞和線粒體的呼吸功能，使三磷酸腺苷(ATP)生成減少，影響生精細胞供能，使活動度降低。數(shù)量減少、畸形率升高和活動度的降低，可引起的運動能力和穿透卵細胞的能力下降，使母鼠受孕率下降；由于畸形和染色體畸變，基因發(fā)生突變，受精卵在植入后的發(fā)育過程中胚胎可在早期死亡或胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)死亡，因而死胎率增加。

參考文獻

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篇5

【摘要】 目的：探討大鼠腎小管上皮細胞的體外培養(yǎng)及鑒定方法，為腎結(jié)石病的研究提供實驗平臺。方法：采用機械研磨、Ⅰ型膠原酶消化法分離出腎小管節(jié)段，在含10%胎牛血清和1%上皮細胞生長因子的上皮細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)，并用原代和傳1代細胞做免疫細胞化學(xué)染色鑒定。結(jié)果：細胞培養(yǎng)至第3天完全貼壁，4～7 d處于對數(shù)生長期，為多邊鵝卵石樣;免疫細胞化學(xué)染色顯示cytokeratin 18表達陽性。結(jié)論:機械研磨、Ⅰ型膠原酶消化法結(jié)合使用上皮細胞培養(yǎng)基可以培養(yǎng)得到較純的腎小管，是大鼠腎小管上皮細胞原代培養(yǎng)的理想方法，為進一步研究泌尿系結(jié)石病因和機制提供了實驗基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 腎小管上皮細胞; 原代培養(yǎng); CK18; 大鼠

[Abstract] Objective： To discuss the method of the primary culture and identification of SD rats renal tubular epithelial cells， thus to supply an experimental platform for the study of renal calculi.Methods： The renal tubular segments were isolated by mechanical grinding and collagenase Ⅰdigestion. The collected cells were cultured with EpiCM，which contained 10% FBS and 1% EpicGs， in incubation with 5% CO2 at 37 ℃， and subcultured with 0.25% trypsin.The cultured cells were identified by immunocytochemistry. Results: The cultured cells were completely adhered after 3 days， the logarithmic growth phase was beween 4 and 7 days. The cells were large， displaying the typical cobblestone appearance.Immunocytochemistry suggested that the expressions of cytokeratin 18 in renal tubular epithelial cells were positive. Conclusion: Mechanical grinding and collagenase Ⅰdigestion combined with EpiCM is an ideal method to collect and culture the renal tubular epithelial cells，and it provides the experimental basis for further study of the etiology and mechanism of urinary tract stones.

[Key words] renal tubular epithelial cells; primary culture; CK18; rats

尿石癥是泌尿外科最常見的疾病之一，主要病因包括遺傳、環(huán)境、飲食、代謝等。一般認為，它的形成是一系列化學(xué)的、生化的、生理的及分子調(diào)節(jié)等因素綜合作用的結(jié)果[1]，其早期病變是微小晶體黏附在腎小管上皮細胞表面并引起損傷?？梢姡I小管上皮細胞可以作為進一步研究尿石癥病因及發(fā)病機制的一個實驗平臺。目前，國外已建立部分種屬的腎小管上皮細胞株，但價格昂貴且不易獲得。本實驗旨在探討一種理想的腎小管上皮細胞原代培養(yǎng)方法。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗動物：SD大鼠2只，一雄一雌，體重分別為220 g和200 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供[許可證號為SCXK(粵)20080020粵監(jiān)證字2008A002]。主要試劑：胎牛血清(Gibco公司)、上皮細胞培養(yǎng)基EpiCM(美國ScienCell公司)、Ⅰ型膠原酶(Sigma公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、青/鏈霉素(Sigma公司)、cytokeratin 18一抗(美國Santa Cruz公司)、山羊抗小鼠二抗(北京博奧森公司)、上皮細胞生長因子EpicGs(美國ScienCell公司)、PV9005小鼠超敏二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋)、ZLI9017濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋)。主要儀器：80和100目不銹鋼篩網(wǎng)(廣州普博生物公司)、XDS1B型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 腎小管節(jié)段的分離提取 大鼠實驗前禁食12 h，水?dāng)z入不限。頸椎脫臼后于70%酒精中浸泡2～3 min后取出，在超凈臺上無菌取下兩側(cè)腎臟。在盛有PBS培養(yǎng)皿中去除腎蒂和包膜，剪碎腎皮質(zhì)至約1 mm3大小(冰上操作)，PBS反復(fù)沖洗3遍去除血質(zhì)后轉(zhuǎn)移到80目篩網(wǎng)上，研磨并以PBS充分沖洗，網(wǎng)下液體倒至100目篩網(wǎng)上，收集網(wǎng)上物于培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打轉(zhuǎn)至15 ml離心管，1 200轉(zhuǎn)·min-1離心10 min。

1.2.2 腎小管節(jié)段的消化和腎小管上皮細胞的原代培養(yǎng) 離心后棄上清，加入1 mg·ml-1的Ⅰ型膠原酶2 ml，0.1 mg·ml-1的DNase 0.1 ml，充分混勻，37 ℃水浴震蕩消化約30 min，加入不含血清的EpiCM 2 ml終止消化，混勻，1 600轉(zhuǎn)·min-1離心6 min，棄去上清，加入4 ml含10%胎牛血清、1%上皮細胞生長因子、1%雙抗的上皮細胞培養(yǎng)基EpiCM，吸管充分輕輕混勻后移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，在5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 腎小管上皮細胞的傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)至第3天首次換液，以后每兩天換1次，至第6天細胞基本鋪滿整個瓶底，吸去瓶內(nèi)全部培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，分兩組進行消化，各滴加0.25%胰蛋白酶(A組)、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA復(fù)合液(B組)1.5～2.0 ml(以剛好能全部覆蓋瓶底細胞為標(biāo)準(zhǔn))，37 ℃消化1～2 min，鏡下見約85%細胞收縮、變圓，少許脫落，此時立即加入雙倍的含10%胎牛血清、1%上皮細胞生長因子、1%雙抗的上皮細胞培養(yǎng)基EpiCM，用吸管順瓶底輕輕吹打使細胞完全脫落、充分混勻，細胞計數(shù)后以1∶2的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.4 腎小管上皮細胞的鑒定 形態(tài)學(xué)：倒置顯微鏡下觀察細胞體積較大，呈多邊鵝卵石樣，透明度和折光性較強，各細胞緊密相連。免疫細胞化學(xué)：將傳1代的腎小管上皮細胞接種于裝有蓋玻片(經(jīng)泡酸、滅菌處理)的24孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞約長滿時取出蓋玻片。PBS沖洗2次，4%冷多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗2次后加3% H2O2去離子水孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，cytokeratin 18一抗(1∶400)4 ℃過夜(陰性對照用PBS替代一抗)，二抗(即用型)37 ℃孵育1.5 h，再DAB顯色、自來水沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。普通光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

剛提取的腎小管節(jié)段如圖1所示。原代培養(yǎng)的腎小管上皮細胞12 h左右即有貼壁，24～36 h后可見上皮樣細胞從貼壁的節(jié)段外周爬出，使得此時整個培養(yǎng)瓶底的細胞呈“島嶼狀”(圖2)，培養(yǎng)第3天后首次換液。第4～7天是對數(shù)生長期，約6～7 d基本長滿瓶底(圖3)。鏡下觀察細胞體積較大，呈多邊鵝卵石樣，透明度和折光性較強。傳代細胞A組第2天貼壁，第5～6天呈指數(shù)性生長，形態(tài)多為短梭形，少數(shù)呈多邊形鵝卵石樣;B組3 d后少量細胞貼壁，形態(tài)不一，細胞連接不緊密，折光性較差，至第7天左右細胞全部漂浮、死亡。免疫細胞化學(xué)染色檢測腎小管上皮細胞特異性表達的cytokeratin 18，在鏡下可見腎小管上皮細胞的胞核周圍及胞質(zhì)內(nèi)有不均勻分布的棕褐色顆粒(圖4、5)，而陰性對照組未見到(圖6)，證明培養(yǎng)的是腎小管上皮細胞。

3 討 論

盡管關(guān)于泌尿系結(jié)石的形成機制在國內(nèi)外已有不少研究，但仍存在一些未曾闡明的問題。目前已有多種學(xué)說，如腎鈣斑學(xué)說、過飽和結(jié)晶學(xué)說、基質(zhì)學(xué)說等[2]?？偠灾?，腎結(jié)石的形成是一個多因素參與的過程，包括尿液的過飽和、微小晶體的形成及結(jié)晶的生長和成熟等。其中，微小晶體黏附于腎小管上皮細胞表面并引起損害被認為是腎結(jié)石形成過程中關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)[3-4]。由此可見，利用體外培養(yǎng)的腎小管細胞作為一個實驗平臺，可以更進一步研究闡述泌尿系結(jié)石的形成機制。

目前，國內(nèi)外已建立了豬、兔、大鼠和人等多種不同種屬的腎小管上皮細胞株，雖然可以在短時間內(nèi)獲得數(shù)量足夠的細胞，但價格昂貴且不易獲得。況且，在反復(fù)傳代過程中細胞株會喪失某些功能甚至發(fā)生轉(zhuǎn)分化等[5]，不能完全代表其正常的生理狀況，且可能還具一些致瘤性[6]，因此不適合研究的需要。腎小管上皮細胞的培養(yǎng)方法除應(yīng)用細胞株培養(yǎng)外，還有另外兩種方法。其一是先分離篩選出腎小管節(jié)段，然后進行培養(yǎng);其二是van Kooten等報道的通過選擇性培養(yǎng)基促進上皮細胞的生長，同時抑制其他細胞的生長[7]。雖然原代培養(yǎng)技術(shù)要求高、傳代次數(shù)有限，但它更接近生理狀況，細胞的變化相對穩(wěn)定，既沒有損傷也沒有嚴(yán)格的研究時間限制[8]。目前，國內(nèi)外有報道用Percoll密度梯度離心法分離腎小管細胞，Percoll為一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒，它具有不穿透生物膜，對細胞無毒害的作用，其密度為1.130 g·ml-1，可根據(jù)活細胞、接近死亡的細胞以及細胞碎片密度不同而將其分離開，以獲得活性較好的細胞[5，9-10]。但是，用此法大大增加了細胞提取的操作時間，也會影響細胞的活性，另外Percoll密度梯度離心法所獲得的腎小管節(jié)段數(shù)量少。Mattila等報道，采用研磨、篩網(wǎng)過濾的方法能達到分離腎小管節(jié)段和腎小球的目的[11]。本研究應(yīng)用80目和100目孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)分離腎小管，可以排除腎小球上皮細胞的混雜，腎小管細胞的純度可達到90%以上，且與Percoll密度梯度離心法相比，研磨消化法獲得的細胞數(shù)量較多。對于腎小管上皮細胞的消化，國內(nèi)報道多采用胰蛋白酶，但是濃度難以確定，過高(>0.25%)會影響細胞貼壁和生長，甚至無法傳代;過低又不能很好地消化細胞[12-13]。用1 g·L-1的Ⅰ型膠原酶消化20～30 min效果佳，培養(yǎng)的細胞貼壁率高，長勢良好。在原代培養(yǎng)中，本實驗應(yīng)用上皮細胞培養(yǎng)基和上皮細胞生長因子，可以使成纖維細胞和其他一些雜細胞的增殖大部分甚至完全被抑制，從而有利于上皮細胞的生長，得到的細胞純度高[7，14]。在原代細胞生長至第6天傳代培養(yǎng)時，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代后的細胞貼壁和生長情況良好;而用0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA復(fù)合液消化，腎小管細胞貼壁需要時間長且數(shù)量少，無法繼續(xù)生長，原因可能是腎小管上皮細胞對EDTA敏感，EDTA對其有抑制性。

上皮細胞中間纖維結(jié)構(gòu)中含有角蛋白成分，是上皮細胞的特異性標(biāo)志。腎小管上皮細胞主要表達cytokeratin 18[15]，盡管有報道腎小球足細胞、球囊上皮細胞也有角蛋白表達(未明確是否為18型)，但使用研磨、分離方法已將腎小管和腎小球細胞分離純化，故不會對實驗造成影響。本實驗采用原代和傳一代的細胞進行免疫細胞化學(xué)染色，選擇cytokeratin18一抗(濃度為1∶400)進行特異性鑒定。鏡下均發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)和細胞核周圍有棕褐色不均勻散在分布、強度不一的陽性顆粒，再結(jié)合上皮細胞的鏡下特點(典型的多邊鵝卵石狀，細胞間相連緊密)，證實培養(yǎng)的細胞是腎小管上皮細胞。

腎小管上皮細胞的原代培養(yǎng)較難，各方面要求較高，通過多次培養(yǎng)，在實驗過程中我們體會到以下幾點的重要性：(1) 腎小管節(jié)段的獲取必須嚴(yán)格無菌。(2) 腎小管細胞的消化盡量選用Ⅰ型膠原酶，效果佳。對于使用胰蛋白酶，沒有明確的推薦濃度。國內(nèi)王東等提出胰蛋白酶的濃度為0.2%～0.25%時對腎小管細胞消化較好[12]。而廖曉星等報道0.2%以上的濃度將明顯影響腎小管細胞的貼壁和生長，并建議以0.15%為宜[13]。(3) 在分離培養(yǎng)后的前3 d內(nèi)，由于組織塊粘貼不牢，盡量不要移動培養(yǎng)瓶。(4) 72 h后首次換液，若細胞貼壁不理想可以半換液，但在操作中注意動作輕巧，避免因液體震蕩對細胞的沖擊引起其漂浮。以后依據(jù)細胞生長情況及時換液，一般每兩天1次，否則漂浮物會對細胞有毒性作用。(5) 使用一次性塑料培養(yǎng)瓶的腎小管細胞貼壁所需時間比用玻璃培養(yǎng)瓶短，且生長更好。

本實驗證明，采用機械研磨、Ⅰ型膠原酶消化法分離腎小管節(jié)段，結(jié)合使用含EpicGs的上皮細胞培養(yǎng)基原代培養(yǎng)腎小管上皮細胞是一種理想的方法，為進一步研究泌尿系結(jié)石的病因及機制奠定了實驗基礎(chǔ)。

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篇6

[關(guān)鍵詞] 呼吸道上皮細胞；纖毛擺動頻率；培養(yǎng)模式；纖毛分化

[中圖分類號] R56 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（b）-0040-04

[Abstract] Respiratory epithelial cell plays an important role in the development of respiratory diseases. The respiratory epithelial surface of mammalian airway were covered with cilia. The beat of the cilia can protect the respiratory system from bacteria， virus and other harmful factors. Therefore， cilia beat frequency （CBF） became a crucial element of regulating the progress of many kinds of respiratory diseases. It can be used to research inflammation， smoke， infection and respiratory tumor. The technologies of respiratory epithelial cell culture and separation of epithelium in vivo were applied to research CBF. These culture methods， however， had many problems which include low differentiation of cilia and many mixed cells. With the culture mode developed continuously， this paper focused on the major culture mode of respiratory epithelial cells and the culture methods which were improved constantly under relevant culture mode. It also summarized the detection of differentiation of cilia and the CBF， defined the influence on the culture cycle， culture process， especially the differentiation of cilia which were subject to the culture mode， laid the foundation of improving the technology of respiratory epithelial cell culture.

[Key words] Respiratory epithelial cells； Cilia beat frequency； culture mode； Cilia differentiation

呼吸道上皮是呼吸系統(tǒng)的重要組成部分，是抵御外界環(huán)境中細菌、病毒、小分子粉塵等有害危險致病因素的首道防線，一旦呼吸道上皮受到損傷，各種有害微生物以及其他危險致病因素很快就侵入到下呼吸道，直接引發(fā)各類急性呼吸系統(tǒng)疾病，除此之外，在失去具有正常功能的呼吸道上皮保護下，危險致病因素也可對呼吸系統(tǒng)深部組織呈現(xiàn)慢性刺激，導(dǎo)致發(fā)生諸如慢性阻塞性氣道疾病、腫瘤、硅肺、慢性氣道炎癥等各類呼吸系統(tǒng)慢性疾病的可能性升高。呼吸道上皮組織學(xué)結(jié)構(gòu)主要由包括以呼吸道上皮細胞為主的各類細胞所構(gòu)成，在鼻黏膜以及諸如氣管、主支氣管、段支氣管等呼吸道，呼吸道上皮層被密集的纖毛所覆蓋，這主要是由于構(gòu)成呼吸道上皮的氣道上皮細胞多為具有纖毛分化能力的纖毛上皮細胞，覆蓋在細胞表面的纖毛擺動可以保護深部呼吸系統(tǒng)免于各類細菌、病毒、粉塵、煙霧的在呼吸道的滯留引發(fā)的慢性損傷，同時纖毛的定向節(jié)律運動也可以推動呼吸道分泌黏液排除體外[1-2]，纖毛的擺動快慢及其密度與呼吸道的黏液運輸系統(tǒng)密切相關(guān)[3]，纖毛每秒的擺動次數(shù)稱之為纖毛擺動頻率（CBF），是判斷呼吸道上皮纖毛排除異物，保護呼吸系統(tǒng)的重要指標(biāo)之一，CBF的調(diào)控是許多呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵因素，其中研究發(fā)現(xiàn)鈣離子在調(diào)節(jié)纖毛運動中被認為發(fā)揮了很大的作用[4]，同時在臨床上也有研究表明鼻部藥物的給藥方式及藥物溶解方式對CBF的影響很大[5]，在過敏性鼻炎的急性期，組胺能夠調(diào)節(jié)呼吸道纖毛的擺動頻率[6]，近期也有研究表明，生物的年齡是影響呼吸道上皮纖毛擺動的一個重要因素，且受到蛋白激酶Cε（PKCε）的調(diào)節(jié)[7]。因此，基于以上原因，在體外構(gòu)建呼吸道上皮細胞纖毛擺動模型顯得至關(guān)重要，體外研究呼吸道上皮細胞以及CBF的方法主要是借助于呼吸道上皮細胞的原代培養(yǎng)以及活體急性分離呼吸道組織體外培養(yǎng)，但由于呼吸道上皮細胞的培養(yǎng)本身具有雜細胞多，細胞培養(yǎng)周期短，細胞表面不易分化纖毛等特點，隨著其培養(yǎng)模式不斷發(fā)展，眾多學(xué)者不斷探索更好的培養(yǎng)模式，以便于培養(yǎng)的細胞純度以及細胞功能與在人體呼吸道的上皮細胞更具相似性，能夠更好地分化纖毛，觀測到纖毛的擺動，檢測到CBF。至今為止，關(guān)于呼吸道纖毛上皮細胞的培養(yǎng)模式的研究并不多，本文簡述了呼吸道上皮細胞兩種主要的原代培養(yǎng)模式及各自的主要培養(yǎng)方法及改進發(fā)展情況，同時介紹并總結(jié)了呼吸道上皮細胞纖毛分化的鑒定及其擺動頻率的檢測，明確了各類培養(yǎng)模式對操作流程、培養(yǎng)周期，尤其是纖毛分化及擺動頻率的影響，為在現(xiàn)有培養(yǎng)模式下改進技術(shù)得到能夠誘導(dǎo)纖毛分化的有效培養(yǎng)方法奠定了基礎(chǔ)。

1 呼吸道上皮細胞的原代培養(yǎng)模式

雖然在以往的研究中眾多學(xué)者建立的培養(yǎng)方式有很多，但根據(jù)其培養(yǎng)原理的差異性，呼吸道上皮細胞的培養(yǎng)可以歸納起來分為兩大類，一類是借助呼吸道組織活性，利用快速處理過的急性分離的呼吸道組織，培養(yǎng)呼吸道細胞，這類方法的特點是爬出的細胞具有高度的組織活性，根據(jù)技術(shù)手段的不同，操作時間一般在數(shù)十分鐘至兩小時之內(nèi)，但根據(jù)處理方式及培養(yǎng)條件的各異，培養(yǎng)的上皮細胞可能含有較多的雜細胞甚至雜細胞含量過高抑制了上皮細胞的生長，這一類方法可歸納為活性組織培養(yǎng)模式。另一類培養(yǎng)模式是借助不同種類的蛋白酶將呼吸道上皮表面的細胞從呼吸道骨架上消化下來，將消化下來的細胞處理后重懸浮培養(yǎng)，這一類培養(yǎng)方法由于采用了各種不同的蛋白酶，氣道上皮細胞的活性受到了破壞，細胞的分化功能會受到損傷，細胞的純度也會根據(jù)所使用酶的種類不同也有所區(qū)別，且細胞培養(yǎng)周期一般較長，操作過程根據(jù)酶消化的條件不同可達2～24 h不等，這一類方法被歸納為酶消化細胞培養(yǎng)模式，也是目前報道較多的一類培養(yǎng)模式。

1.1 酶消化細胞培養(yǎng)模式

酶消化細胞培養(yǎng)是首例呼吸道上皮細胞原代培養(yǎng)，其上皮組織取材來源于人的主支氣管，研究者利用型蛋白酶溶解在磷酸鹽緩沖液中，在4℃環(huán)境下對主支氣管的上皮細胞進行消化，消化時間為24 h，結(jié)果通過透射電鏡與免疫組化等方法對培養(yǎng)的細胞的纖毛分化進行檢測，該方法培養(yǎng)的氣道上皮細胞纖毛分化較好，但由于過夜消化使得操作時間較長，且消化的細胞貼壁生長不好，對細胞的纖毛分化功能有一定的影響[8]。在此培養(yǎng)模式的基礎(chǔ)上，眾多學(xué)者在操作流程及培養(yǎng)材料及細節(jié)上進行了修改，有學(xué)者使用人的主支氣管以及小鼠的鼻黏膜作為取材來源，同時采用了改良的氣液相聯(lián)合培養(yǎng)的方法，在使用相似的蛋白酶消化后，將消化下的細胞離心后重懸浮置于氣液相培養(yǎng)皿裝置中，該裝置模擬哺乳動物氣道上皮層的生理解剖學(xué)環(huán)境，裝置中加入適量的上皮細胞培養(yǎng)基，使得細胞浸沒在含有上皮細胞培養(yǎng)基的溶液中，而同時又可以暴露在空氣環(huán)境中，這種模擬人體氣道上皮層的氣液相環(huán)境可以有效地在體外刺激并誘導(dǎo)上皮細胞的纖毛分化[9-10]。近期又有國內(nèi)學(xué)者利用類似的方法使用特殊培養(yǎng)基和鼠尾膠原包被的培養(yǎng)器皿成功培養(yǎng)了人鼻黏膜以及小鼠呼吸道上皮細胞，并詳細記錄了其生長情況，同時使用免疫組化和高速數(shù)碼攝像機檢測了纖毛的分化，培養(yǎng)的上皮細胞的CBF對ATP刺激的反應(yīng)性很好，特殊培養(yǎng)基和膠原包被的培養(yǎng)器皿可以增強上皮細胞的貼壁能力，對細胞的生長和分化起到促進作用[11-13]。不僅如此，該方法在改進后還可以建立纖毛運動障礙模型，用以研究原發(fā)性纖毛運動障礙（primary ciliary dyskinesia，PCD）等疾病[14]。氣液相培養(yǎng)結(jié)合酶消化細胞培養(yǎng)模式可以在體外快速獲取大量上皮細胞并且容易建立細胞的生長以及細胞表面纖毛分化的模型，但該方法培養(yǎng)的上皮細胞的纖毛分化也能受到多種因素的調(diào)控，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)諸如4-Methylnitrosamino-1-3-pyridyl-1-butanone（NNK）的化學(xué)試劑對于體外氣液相培養(yǎng)氣道上皮具有重要的調(diào)控作用，能在短時間內(nèi)影響細胞的正常生長與纖毛分化[15]，以上這些研究也為如何精準(zhǔn)調(diào)控體外酶消化法培養(yǎng)的細胞生長及纖毛分化墊定了基礎(chǔ)。

1.2 活性組織培養(yǎng)模式

運用活性組織法培養(yǎng)模式的學(xué)者最早可追溯到1995年Dirksen ER，在他的研究中采用了分離的活性氣道上皮組織，并依靠其組織活性進行體外培養(yǎng)，同時使用鼠尾膠原作為其培養(yǎng)的鋪墊底物，利用了特殊的上皮細胞培養(yǎng)基，成功在體外培養(yǎng)出呼吸道上皮細胞，該方法雖然能獲得大量氣道上皮細胞，但操作過程繁瑣且精細，需要在顯微操作下完成氣道上皮層的分離，培養(yǎng)者在一定的訓(xùn)練后方能完成[16]。國內(nèi)部分學(xué)者在此方法的基礎(chǔ)上加以改進，分別從兔、人的主支氣道及鼻黏膜取材，使用鼠尾膠原包被培養(yǎng)器皿，將有活性的氣道上皮組織或鼻黏膜組織剪碎，使其固定在培養(yǎng)器皿上，在培養(yǎng)的第4～7天，上皮細胞爬出并融合，可觀察到纖毛分化及穩(wěn)定的節(jié)律性擺動[17-18]，研究者同時對纖毛的特定標(biāo)記蛋白黏蛋白5AC（mucin-5AC，MUC5AC）進行了檢測，其表達呈陽性，掃描電鏡也可以觀察到濃密的纖毛分化[19]，充分肯定了這種培養(yǎng)模式可成功誘導(dǎo)有纖毛分化的細胞從組織周圍爬出。在近期，又有學(xué)者比較了采用呼吸道組織體外直接種植培養(yǎng)以及在體外培養(yǎng)后將組織分離開，發(fā)現(xiàn)前者培養(yǎng)的氣道上皮細胞纖毛分化豐富，但后者纖毛分化較少，細胞在第7～10天時生長達到最佳狀態(tài)，且二者分化的纖毛擺動頻率也較好，且對ATP的刺激反應(yīng)性也均較好[20]，這些研究為如何在體外選擇性構(gòu)建研究所需要的模型提供了基礎(chǔ)；與此同時，研究者檢測了纖毛上皮細胞的特定標(biāo)志物β-tubulin Ⅳ以及ZO-1的表達，表達呈陽性，結(jié)果顯示了培養(yǎng)的細胞纖毛分化豐富，且密度較高。活性組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵主要在于取材的離體組織上皮活性是否完好，組織取下后能否在顯微鏡下直接觀察到組織上纖毛的擺動；除此以外，培養(yǎng)器皿的膠原包被、特殊培養(yǎng)基的使用，這些都是誘導(dǎo)具有纖毛分化細胞爬出的關(guān)鍵因素。

2 呼吸道上皮細胞的纖毛分化

在通過以上培養(yǎng)模式獲取了大量的呼吸道上皮細胞或是活體取出了具有纖毛的氣道組織后，要檢測細胞的纖毛分化或組織的纖毛分化情況，目前常用的檢測方法包括免疫組織化學(xué)檢測上皮細胞特定蛋白表達、掃描電子顯微鏡（SEM）觀察細胞或組織表面纖毛的生長密度及高度，以及采用高速顯微攝像技術(shù)觀察CBF并直接記錄纖毛擺動情況。免疫組織化學(xué)法檢測的特定標(biāo)記蛋白主要包括前面所提到的β-tubulin Ⅳ以及mucin-5AC，這兩種蛋白為纖毛上皮細胞所特定的表達，而ZO-1則是用來反映上皮細胞融合程度的標(biāo)志物，除此以外，角蛋白也可以作為上皮細胞的特定表達蛋白用以檢測細胞的生長情況。SEM則可以通過掃描上皮細胞表面或氣道組織表面的超微結(jié)構(gòu)，直接觀察上皮細胞或組織表面纖毛的生長情況，但SEM樣本的制樣過程繁瑣，且樣本經(jīng)固定脫水后，細胞及表面的纖毛均已死亡，不能在活體狀態(tài)下反映出纖毛的運動狀態(tài)。相比之下，高速顯微攝像技術(shù)則可以讓研究人員通過連接高速電荷耦合元件（CCD）的顯微鏡，并通過可視化的視頻分析軟件直接地觀察到纖毛的擺動，是判斷細胞纖毛分化以及檢測CBF最直接可靠的方法，然而由于哺乳動物CBF較快，且不同種屬來源的呼吸道上皮纖毛擺動有所區(qū)別，小鼠的擺動頻率最高，而人的相對較慢，但均高達8～15次/s，因此需要使用專門的儀器設(shè)備以及軟件系統(tǒng)才可以記錄并檢測其擺動頻率。隨著呼吸道上皮細胞培養(yǎng)模式的發(fā)展以及光學(xué)數(shù)碼顯微技術(shù)的進步，纖毛擺動的記錄及檢測方法也不斷發(fā)生變化。在記錄纖毛高速擺動時，高速影像系統(tǒng)是記錄纖毛高速擺動所必須的，為保證其客觀提交相同，其記錄條件一般在標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)溫度37℃，將細胞或組織浸沒在磷酸鹽緩沖液中；而影像系統(tǒng)的采集幀數(shù)多為60～100幀/s，這樣可以保證上皮細胞纖毛的有效擺動均被記錄下來[21]。對于采集的圖像信息，利用Hcimage等圖像分析軟件，詳細分析纖毛擺動區(qū)域的灰度值，由于纖毛的定向節(jié)律擺動，引起了區(qū)域內(nèi)灰度值的變化，因此通過分析單位時間幀數(shù)內(nèi)灰度曲線的周期變化情況，可以準(zhǔn)確地反映出纖毛每秒擺動的次數(shù)[22]。

3 小結(jié)與展望

呼吸道上皮的纖毛擺動及其調(diào)控和呼吸道黏液運輸、臨床給藥以及多種呼吸系統(tǒng)重大疾病的發(fā)生發(fā)展均具有密不可分的關(guān)系，在體外構(gòu)造簡便快速可靠的培養(yǎng)模式以誘導(dǎo)氣道上皮細胞的纖毛分化并檢測其擺動頻率在分析氣道上皮細胞功能上顯得至關(guān)重要。但由于氣道上皮細胞培養(yǎng)以及檢測的復(fù)雜性，目前對這方面的研究相對較少，在目前主要的兩種培養(yǎng)模式下，操作流程及培養(yǎng)周期均較長，但各自的操作流程及對誘導(dǎo)細胞纖毛分化的能力均各具特點，最可靠的檢測方法主要是通過連接高速CCD的顯微鏡直接記錄纖毛擺動情況并間接分析纖毛擺動導(dǎo)致的圖像灰度變化從而計算CBF。但隨著細胞生物學(xué)以及光學(xué)顯微攝像技術(shù)的進一步發(fā)展，在未來，將會探索出更加便捷可靠的培養(yǎng)模式，為研究呼吸系統(tǒng)重大疾病、尋找呼吸道上皮纖毛擺動參與的呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

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篇7

[關(guān)鍵詞] 2-脫氧葡萄糖；常染色體顯性多囊腎??；腎囊腫襯里上皮細胞；增殖

[中圖分類號] R692 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of 2-DG on the proliferation of cyst lining epithelial cells WT9-12 and its possible action mechanism. Methods Cyst lining epithelial cells WT9-12 in vitro were divided into control group and 2-DG treatment group with different concentrations （5， 10， 20， 40 mmol/L）. CCK-8 method was used to screen the optimal concentration and the best time for the growth inhabition of polycystic kidney epithelial cells after drug treatment for different concentrations and different time （12， 24， 36， 48 h）. EdU Imaging Kit and Western blot were used to observe the proliferation rate and the levels of metabolism-related phosphorylated AMPKα， and proliferation-related phosphorylated mTOR， phosphorylated p70S6K， phosphorylated 4E-BP1 in the mTOR signal pathway of cyst lining epithelial cells exposed to 15 mmol/L 2-DG for 48 h. Flow cytometry and Caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit were used to detect the apoptosis rate of cyst lining epithelial cells treated by 2-DG of different concentrations for 48 h. Results The results showed that 2-DG can significantly inhibit the proliferation of polycystic kidney epithelial cells， compared with the control group， and the anti-proliferative effects in time-dependent and dose-dependent modes （P < 0.05）. The level of metabolic related molecule P-AMPKα was obviously increased （P < 0.05）， but the expression activity of the proliferation related molecule P-mTOR， P-p70S6K and P-4E-BP1 were markedly decreased （P < 0.05）. Compared with the control group， the early apoptosis rate of polycystic kidney cells was promoted by the different concentrations of 2-DG， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion 2-DG may inhibit the growth of WT9-12 cyst lining epithelial cells through regulate the AMPK-mTOR signal pathway and promote apoptosis.

[Key words] 2-deoxyglucose； Autosomal dominant polycystic kidney disease； Cystic lining epithelial cells；Proliferation

常染色體顯性多囊腎?。╝utosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是一種常見的遺傳性腎臟疾病[1]。由于具體的發(fā)病機制仍未明確，目前尚無能夠阻止囊泡形成和生長的有效藥物[2]。研究發(fā)現(xiàn)，多囊腎上皮細胞與腫瘤細胞類似，主要通過糖酵解產(chǎn)生ATP，且細胞中ATP/AMP比值升高，能量感受器AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性下降，雷帕霉素哺乳靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性增加，細胞增殖顯著增強[3]。2-脫氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG）是一種人工合成的葡萄糖類似物，可抑制糖酵解、減少ATP產(chǎn)生，已被用于腫瘤的治療研究[4-5]。本研究觀察了2-DG對多囊腎上皮細胞增殖的抑制作用及其可能的作用機制。

1 對象與方法

1.1 試劑

人ADPKD 囊腫襯里上皮細胞系WT9-12與DMEM完全培養(yǎng)基，購自ATCC公司；胎牛血清購自Gibco公司；2-脫氧葡萄糖購自Med Chem Express（MCE）公司；Cell Counting Kit-8購自DOJINDO公司；Click-iTEdU Imaging Kits購自InvitrogenTM Thermo Fisher Scientific公司；Caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit購自BioVision公司；Annexin V/PI雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自Bender公司；抗Phospho-（AMPKα、mTOR、p70S6K、4E-BP1）抗體購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 分組方法

配制含10%胎牛血清（FBS）的DMEM完全培養(yǎng)基。多囊腎上皮細胞復(fù)蘇后，在37℃ 5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，隔天換液，每2～3天傳代，細胞呈貼壁生長狀態(tài)。2-DG溶解于去離子水中配置為1 mol/L的終濃度。將傳代好的細胞分為5組：對照組，2-DG處理組（5、10、20、40 mmol/L），行CCK-8細胞增殖檢測實驗和細胞凋亡檢測實驗。選取2-DG濃度為15 mmol/L進行EdU核酸標(biāo)記實驗及Western blot檢測實驗。

1.3. CCK-8法檢測2-DG對多囊腎上皮細胞增殖的影響

將多囊腎上皮細胞懸液濃度調(diào)整為3×107/L，每孔100 μL接種于96孔板，分為6組：空白組、對照組和2-DG處理組（5、10、20、40 mmol/L），每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，換液為含0.1% FBS的完全培養(yǎng)基同步化24 h，之后每組給予不同濃度2-DG（空白對照無細胞只加培養(yǎng)基）培養(yǎng)12、24、36、48 h后，每孔加入10 μL Cell Couning Kit-8試劑，在37℃孵箱中孵育4 h，使用酶標(biāo)儀讀取 450 nm波長下每孔的吸光度值（A）。增殖抑制率（%）=（A對照-A實驗）/（A對照-A空白）×100%。

1.4 EdU法檢測2-DG對多囊腎上皮細胞增殖的影響

選擇15 mmol/L濃度2-DG治療的多囊腎上皮細胞作為處理組，培養(yǎng)48 h后，在培養(yǎng)基中加入0.02 μmol EdU，孵育4 h，按EdU核酸標(biāo)記試劑盒實驗步驟操作后用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料）試劑染細胞核，最后用激光共聚焦顯微鏡采集圖片，其中藍色代表所有細胞核，粉色代表新增殖的細胞核。

1.5 Western blot 檢測蛋白表達

收集對照組與處理組（15 mmol/L 2-DG干預(yù)48 h的多囊腎上皮細胞）細胞的蛋白，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取50 μg樣本蛋白按順序加樣，SDS-PAGE電泳后，I=250 mA恒流轉(zhuǎn)移至NC膜，5%BSA封閉1 h，分別予以不同的一抗孵育24 h，HRP標(biāo)記的二抗（1∶1000）常溫孵育1.5 h，ECL顯影，Image-J 凝膠圖像分析軟件對各組蛋白條帶進行灰度分析。

1.6 流式細胞儀及Caspase-3試劑盒檢測多囊腎上皮細胞的凋亡情況

1.6.1 Annexin V/PI雙染色流式法 用0、5、10、20、40 mmol/L的2-DG處理多囊腎上皮細胞48 h后，收集細胞，制備為單細胞懸液，用細胞計數(shù)器調(diào)整每組細胞數(shù)為1×106/mL。每組取100 μL細胞懸液于流式小管，加入200 μL Annexin V/PI Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后室溫避光孵育15 min后上機檢測各藥物處理組與對照組中細胞的壞死和晚期凋亡率（D1、D2：PI+/Annexin V-FITC+）、活細胞率（D3：PI-/Annexin V-FITC-）和早期凋亡率（D4：PI-/Annexin V-FITC+）。

1.6.2 Caspase-3比色測定法 不同濃度（0、5、10、20、40 mmol/L）的2-DG處理多囊腎上皮細胞48 h后收集蛋白，測定每組蛋白的濃度，調(diào)整各組蛋白為相同濃度，每組取50 μL蛋白，加入50 μL Reaction Buffer和5 μL DEVD-pNA（caspase-3探針）后在37℃孵箱內(nèi)避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測405 nm波長的吸光度值（A）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗均重復(fù)3次，采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2-DG對多囊腎上皮細胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示：在同一時間內(nèi)，隨著2-DG濃度的增加，存活細胞數(shù)逐漸減少（P < 0.05），提示2-DG對多囊腎上皮細胞增殖的抑制作用具有劑量依賴性，其中40 mmol/L濃度的2-DG對多囊腎上皮細胞增殖的抑制作用最強；對同一濃度而言，隨著時間的延長，2-DG對多囊腎上皮細胞的增殖抑制效果也逐漸增強，具有時間依賴性，48 h的抑制率最高，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（見圖1A）。使用不同濃度（5、10、20、40 mmol/L）的2-DG處理細胞48 h后，細胞的增殖抑制率分別是（30.7±2.3）%、（46.5±2.5）%、（54.8±1.9）%、（68.5±1.7）%，計算得到半數(shù)抑制濃度（IC50）為（14.61±2.1）mmol/L。故在后續(xù)的增殖實驗中設(shè)定2-DG的最適給藥濃度為15 mmol/L（見圖1B）。

EdU核酸標(biāo)記技術(shù)檢測結(jié)果顯示：15 mmol/L 2-DG處理組中EdU陽性細胞率為（45.36±4.26）%，而對照組中EdU陽性細胞率為（16.12±1.26）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2（封三）。

2.2 2-DG對多囊腎上皮細胞中代謝相關(guān)分子AMPK及增殖相關(guān)信號通路分子活化的影響

多囊腎上皮細胞內(nèi)代謝相關(guān)信號通路活化型分子P-AMPKα的表達升高（P < 0.05）；增殖相關(guān)信號通路活化型分子P-mTOR、P-p70S6K和P-4E-BP1的表達降低（P < 0.05）。見圖3。

2.3 2-DG對多囊腎上皮細胞凋亡的影響

與對照組比較，各濃度2-DG處理組的多囊腎上皮細胞早期凋亡率（D4）均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與對照組比較，20 mmol/L 2-DG處理組細胞晚期凋亡率（D2）明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。各組壞死率及活細胞率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1、圖4。

2.4 2-DG對多囊腎上皮細胞中凋亡執(zhí)行酶caspase-3活性的影響

與對照組比較，2-DG各處理組中caspase-3酶活性均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖5。

3 討論

ADPKD是人類常見的遺傳性疾病，發(fā)病率為1/1000～1/500，85%的ADPKD由于PKD1基因突變導(dǎo)致，而15%的患者由于PKD2基因突變所致[6]。其病變特點為雙腎充滿多個進行性增長的液性囊泡，隨著病變的進展，囊泡逐漸增多增大，壓迫正常腎組織，最終發(fā)展為終末期腎臟病。臨床中除對癥治療及應(yīng)用腎移植和透析治療終末期腎臟病外，尚無有效的靶向治療藥物[7-8]。近年來，在多種PKD嚙齒動物模型中的研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制劑雷帕霉素、PPAR-γ激動劑羅格列酮、生長抑素類似物奧曲肽、加壓素V2受體拮抗劑托伐普坦等藥物可以抑制多囊腎上皮細胞異常增殖及囊液過度分泌，顯示出良好的療效。但是，之后的臨床研究結(jié)果顯示，雷帕霉素、奧曲肽和托伐普坦在人體中的治療效果并不理想[9-12]，因此急需新的治療方法。

研究發(fā)現(xiàn)，PKD1突變小鼠模型中多囊腎上皮細胞的代謝方式與腫瘤細胞相似，存在瓦氏效應(yīng)，即在氧氣充足的條件下，也主要依賴有氧糖酵解途徑產(chǎn)生ATP，而正常細胞主要通過線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP[3，13]。根據(jù)瓦氏效應(yīng)學(xué)說，腫瘤細胞能量代謝調(diào)控失常影響了細胞增殖和凋亡等生物學(xué)過程[14]。AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種細胞內(nèi)能量代謝感受器，是調(diào)節(jié)能量代謝的關(guān)鍵分子。當(dāng)細胞內(nèi)ATP/AMP比例降低時，可以激活A(yù)MPK，從而激活一系列能量代謝相關(guān)基因的表達，促進ATP合成。反之，當(dāng)ATP升高時，可抑制AMPK的活性。在腫瘤細胞中，通過糖酵解途徑大量消耗葡萄糖產(chǎn)生高水平ATP，AMP/ATP 比例下降，AMPK活性被明顯抑制[15]。在多囊腎上皮細胞中發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)ATP/AMP的比例升高，AMP相對下降，AMPK的活性被明顯抑制[3]。雷帕霉素哺乳靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）不僅在調(diào)控能量代謝方面發(fā)揮重要作用，而且是調(diào)控細胞生長與增殖的一個關(guān)鍵性蛋白激酶，mTOR下游信號通路分子包括p70S6K和4E-BP1，可促進細胞增殖。研究表明AMPK可特異性抑制mTOR的活性[16-17]。

2-DG是一種可競爭性抑制糖酵解過程的新型化學(xué)藥物，目前用于腫瘤的實驗治療研究。在多個腫瘤動物模型中發(fā)現(xiàn)2-DG都具有良好的抗增殖效應(yīng)[18-20]。

本研究使用CCK-8及EdU核酸標(biāo)記技術(shù)（DNA合成過程中，EdU可取代胸腺嘧啶整合到DNA鏈中，體外螯合熒光染料的疊氮化鈉與EdU中乙炔基反應(yīng)后，使新合成的DNA在激光照射下發(fā)出熒光）檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度的2-DG對多囊腎上皮細胞有明顯的抗增殖作用，且抗增殖效應(yīng)具有時間和劑量依賴性。Western blot結(jié)果顯示在2-DG處理后的多囊腎上皮細胞內(nèi)，P-AMPKα表達上調(diào)，P-mTOR、P-p70S6K和P-4E-BP1的表達均明顯下調(diào)。

細胞凋亡是細胞的程序性死亡，其最終的共同途徑都是激活凋亡執(zhí)行酶Caspase-3。本研究通過Annexin V-FITC/PI雙染法及Caspase-3/CPP32比色測定法，發(fā)現(xiàn)2-DG能促進多囊腎上皮細胞發(fā)生凋亡，提示凋亡也可能參與了多囊腎上皮細胞的生長抑制作用。

本研究提示，2-DG可能主要通過靶向抑制多囊腎上皮細胞的糖代謝，使多囊腎上皮細胞內(nèi)ATP/AMP比值降低，AMP相對升高，激活能量感受器AMPK，從而抑制增殖相關(guān)的mTOR信號通路分子的活化，進而抑制多囊腎上皮細胞的增殖，提示2-DG今后可能作為多囊腎臟病的潛在治療藥物。

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篇8

【摘要】 目的 制作去細胞肌肉組織工程支架，并檢測其與人羊膜上皮細胞的生物相容性。方法 采用三硝基甲苯和十二烷基磺酸鈉結(jié)合的化學(xué)萃取方法制作去細胞肌肉組織工程支架，冰凍切片觀察其結(jié)構(gòu)。將人羊膜上皮細胞種入支架培養(yǎng)7 d后，用免疫組化檢測羊膜上皮細胞的增殖活性、NT3及BDNF的表達，掃描電子顯微鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 支架中細胞去除完全，其主要結(jié)構(gòu)為平行排列的管狀結(jié)構(gòu)。細胞外基質(zhì)的主要成分彈性纖維和膠原纖維保持完好。羊膜上皮細胞在支架里有增殖活性，并呈現(xiàn)NT3、BDNF免疫反應(yīng)陽性。掃描電鏡顯示，羊膜上皮細胞在支架中分布均勻，生長良好。結(jié)論 成功的制作了去細胞肌肉組織工程支架，其與人羊膜上皮細胞有良好的相容性。

【關(guān)鍵詞】 去細胞肌肉;人羊膜上皮細胞;生物相容性

【Abstract】 Objective To produce the acellular muscle as biomaterial scaffold and to observe its biocompatibility with the human amniotic epithelial cell.　Methods The acellular muscle scaffolds were made by extraction with 3% Triton X100 and 1% sodium dodecyl sulfate. The histological structure of acellular muscle was observed in frozen section. Then the cultured human amniotic cells were implanted into acellular muscle scaffolds. After cultured 1 w， the scaffolds with cells were sectioned， and BrdU，NT3 and BDNF immunohistochemical staining were performed to observe the proliferating capacity and the expressions of NT3 and BDNF of amniotic cells in scaffold. SEM was performed to examine the distribution of human amniotic epithelial cells growing in scaffold.　Results The cells in scaffold completely disappeared after the muscle had been extracted. The scaffold of acellular muscle was arranged in parallel tubules composed of collagen fibers and elastic fibers which were left intact. In scaffold the human amnion cells could proliferate and synthesize NT3 and BDNF. Scanning electron microscopy demonstrated a uniform distribution of cells in scaffold.　Conclusions The cells in rat skeletal muscle are successfully removed by chemical extraction. The acellular muscle scaffold made in this way possess good compatibility with human amniotic cells.

【Key words】 Acellular muscle; Human amniotic cell; Biocompatibility

近年來組織工程研究的重要進展之一就是采用自體或異體移植物制作天然生物降解材料的組織工程支架。其中去細胞移植物與機體有良好的生物相容性。去細胞肌肉支架可作為生物工程支架支持神經(jīng)細胞軸突再生。Mligiliche等〔1〕把去細胞肌肉移植入大鼠坐骨神經(jīng)缺損處，4 w后發(fā)現(xiàn)有大量神經(jīng)軸突長入去細胞肌肉支架中。由于單獨應(yīng)用去細胞肌肉支架治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的效果有限，去細胞肌肉支架要發(fā)揮更大的作用往往需要向支架中植入種子細胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮細胞可分泌多種神經(jīng)因子〔4，5〕，促進神經(jīng)元軸突的生長，是一種良好的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種子細胞。本研究利用化學(xué)去細胞的方法制成去細胞肌肉支架，并把羊膜上皮細胞種入去細胞肌肉支架內(nèi)，探究兩者的相容性，為開展組織工程治療神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Wistar 大鼠由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 IMDM培養(yǎng)基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 單克隆抗體購自Neomarker公司;神經(jīng)營養(yǎng)素(NT)3，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德公司，SABC免疫組化試劑盒購自福州邁新生物公司。人羊膜上皮細胞株為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 去細胞肌肉支架的制備 參考 Brown等〔6〕去細胞膀胱的制作方法制備去細胞肌肉支架，簡述如下：取Wistar大鼠腹鋸肌，放入蒸餾水中，在搖床中以37℃、50 r/min搖48 h后，轉(zhuǎn)入3%的TritonX100溶液，搖床中37℃、50 r/min搖48 h。然后放入蒸餾水中，搖床37℃、50 r/min搖48 h。換成1% SDS溶液，搖床37℃，50 r/min搖48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 支架形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察及成分鑒定 肉眼觀察去細胞肌肉的形態(tài)。去細胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖過夜以梯度脫水，OCT包埋，冷丙酮速凍，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片機切片，HE 染色，觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。此外對切片進行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)檢測支架的細胞外基質(zhì)成分。

1.2.3 人羊膜上皮細胞的培養(yǎng) 人羊膜上皮細胞在DMEM培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml鏈霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待單層培養(yǎng)細胞生長至80%匯合后，傳代培養(yǎng)。

1.2.4 人羊膜上皮細胞與去細胞肌肉支架相容性的鑒定

1.2.4.1 取生長良好的人羊膜上皮細胞，80%細胞接近融合，棄去培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化，當(dāng)胞體回縮，細胞間隙變寬時，用血清終止消化，反復(fù)輕吹瓶壁細胞，制成單細胞懸液于離心管中，1 000 r/min，離心3 min。用DMEM重懸細胞。用1 ml注射器吸入細胞懸液，以2×106/ml 密度注入去細胞肌肉支架中分裝至24孔板中，在37℃、5 % CO2及飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，培養(yǎng)1 w。摻入Brdu(終濃度為10 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)1 d后，恒冷箱切片機切片(方法同前)。切片經(jīng)PBS 洗后，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min，血清封閉20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀釋)單克隆抗體，BDNF和NT3多克隆抗體(1∶100稀釋)4℃孵育過夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB顯色。光鏡下觀察。

1.2.4.2 掃描電子顯微鏡鑒定羊膜上皮細胞在去細胞肌肉支架上的生長情況 取生長良好的人羊膜上皮細胞，80%細胞接近融合時，用上述方法消化下來后，把羊膜上皮細胞種植到去細胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脫水，CO2臨界點干燥，鍍膜，采用掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 支架的組織結(jié)構(gòu)與成分 去細胞肌肉外觀呈乳白色，半透明，質(zhì)地柔軟。從大體上看，肌肉去細胞前后整體大小與形狀無顯著變化。支架縱切面的HE染色觀察可見骨骼肌細胞成分消失，而纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)保持完整，支架內(nèi)主要為平行管道。VG+ET染色證明支架成分主要為膠原纖維和彈力纖維等細胞外基質(zhì)成分，膠原纖維為紅色波浪狀結(jié)構(gòu)，彈性纖維為藍色絲狀結(jié)構(gòu)，見圖1。

2.2 羊膜上皮細胞與去細胞肌肉支架的兼容性 見圖2，HE染色顯示人羊膜上皮細胞在支架中生長良好，分布均勻(圖

圖1 去細胞肌肉支架大體與組織切片染色

圖2 去細胞肌肉支架的病理圖片2A)。免疫組化染色顯示，BrdU陽性細胞數(shù)目多，提示支架中的人羊膜上皮細胞有增殖能力(圖2B)?？筃T3和BDNF染色顯示，支架中的人羊膜上皮細胞含有NT3、BDNF陽性顆粒，呈棕褐色分布在細胞質(zhì)中(圖2C，2D)。JSM5600LV掃描電子顯微鏡顯示，在支架內(nèi)部分布有大量細胞，細胞在支架中分布比較均勻，生長狀態(tài)良好(圖2E)。

3 討 論

理想的支架材料應(yīng)與細胞外基質(zhì)類似，與活體細胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去細胞肌肉作為治療神經(jīng)損傷的生物工程支架材料有如下優(yōu)勢：(1)去細胞肌肉的細胞外基質(zhì)成分對組織細胞的遷移、黏附、生長代謝都有重要作用，研究表明再生的軸突可以很好的黏附在去細胞肌肉支架上〔9〕。(2)去細胞肌肉的排列結(jié)構(gòu)與神經(jīng)膜管類似，僅在直徑上略大于神經(jīng)膜管〔10〕，它們提供了軸突可生長穿過的足夠空間〔9〕，該結(jié)構(gòu)對于誘導(dǎo)神經(jīng)軸突再生是十分重要的。 Fansa等比較了接種施萬細胞的不同去細胞生物材料(肌肉，靜脈，神經(jīng)外膜)橋接缺損的外周神經(jīng)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)缺乏神經(jīng)膜管樣結(jié)構(gòu)的去細胞肌肉支架(靜脈和神經(jīng)外膜支架)中的再生軸突是無序和排列混亂的，而有神經(jīng)膜管樣結(jié)構(gòu)的去細胞肌肉支架中的再生軸突是有序排列的〔11〕。這種軸突再生的有序性對神經(jīng)損傷的軸突再生同樣也是十分重要的。(3)去細胞肌肉引起的免疫排斥反應(yīng)較小〔9，12〕。這些優(yōu)勢都說明去細胞肌肉可作為治療神經(jīng)損傷的理想的材料。本研究采用的制作去細胞肌肉的方法主要用來減少異種移植材料的免疫排斥反應(yīng)。該方法能有效的去除脂膜和膜相關(guān)抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留細胞外基質(zhì)成分的原始空間結(jié)構(gòu)。肌細胞正常呈平行分布，其細胞外基質(zhì)成分也是平行分布的，從支架縱切面的結(jié)果看支架的纖維成分也是平行排布的，VG+ET染色結(jié)果顯示細胞外基質(zhì)的主要成分膠原纖維和彈性纖維保持完好。這些結(jié)果進一步證實此方法可成功制備去細胞肌肉支架。

由于單獨應(yīng)用去細胞肌肉支架治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的效果有限〔13〕，去細胞肌肉的生物相容性也有待驗證。本研究用人羊膜上皮細胞作為種子細胞種入去細胞肌肉支架以探討其相容性。研究表明，羊膜上皮細胞中含有多種生物活性因子，包括胰島素樣生長因子、層黏蛋白、轉(zhuǎn)移生長因子、前列腺素E、表皮生長因子樣物質(zhì)，IL1，IL8 等因子，另外，還可分泌BDNF和NT3等重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子〔4〕。其中層黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子對神經(jīng)損傷的治療具有十分重要的作用。羊膜上皮細胞可作為一種較理想的種子細胞，與去細胞肌肉支架結(jié)合可能成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個理想的組織工程材料。本實驗觀察到人羊膜上皮細胞在去細胞肌肉支架中分布均勻，抗BrdU、BDNF及NT3免疫組化顯示去細胞肌肉支架中羊膜上皮細胞有良好的增殖能力，并能表達BDNF和NT3，說明羊膜上皮細胞在去細胞肌肉支架中保持了良好的生物學(xué)活性。以上結(jié)果一方面證明了本研究制作的去細胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面為應(yīng)用羊膜上皮細胞和去細胞肌肉支架結(jié)合治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了理論和實驗基礎(chǔ)。

總之 ，本研究成功制備了去細胞肌肉支架，并證實人羊膜上皮細胞在去細胞肌肉支架中能分泌重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，人羊膜上皮細胞與去細胞肌肉支架橋接體為神經(jīng)缺損再生提供了基底膜、神經(jīng)營養(yǎng)因子等種種有利因素，構(gòu)成了良好的神經(jīng)再生微環(huán)境，有利于使神經(jīng)缺損得到較好地修復(fù)，為進一步研究羊膜上皮細胞與去細胞肌肉支架橋接體治療神經(jīng)損傷奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。

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11 Fansa H，Keilhoff G.Comparison of different biogenic matrices seeded with cultured Schwann cells for bridging peripheral nerve defects〔J〕. Neurol Res，2004;26(2):16773.

篇9

[關(guān)鍵詞]c-Met;外泌汗腺;上皮細胞;增殖

[中圖分類號]Q813.1[文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)09-1324-03

Inhibitory effects of knockdown of c-Met by Adenovirus-delivered siRNA on growth of human eccrine sweat gland epithelial cells

LEI Xia1, LIU Bo2, WU Jin-jin1, LU Yuan-gang1, Yang Ya-dong1

(1. Department of Dermatology, Daping Hospital,Third Military Medical University, Chongqing, 400042,China;2. Department of Orthopadics, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University)

Abstract: ObjectiveTo investigate the effect of siRNA c-Met adenovirus on proliferation of cultured hESGc.Methods The recombinant adenoviral vector containing siRNA targeting c-Met gene was successfully constructed. Adenovirus with high titer was harvested. Fluorescence microscope observation and westernblot test were used to confirm the effectiveness of adenovirus. MTT assay was used to detect the growth of the cells.ResultsRed fluorescence was observed in hESGc infected with siRNA c-Met adenovirus under fluorescence microscopy.The infected cells were harvested for westernblot test. It is observed that c-Met was inhibited in siRNA c-Met adenovirus infected cell group. The transfection of siRNA c-Met adenovirus can inhibit the growth of hESGc by MTT assay.The inhibition rate were 16.8% in 2 days and 34.5% in 4 days.ConclusionThe transfection of siRNA c-Met adenovirus can inhibit the growth of hESGc.

Key words:c-Met; eccrine sweat gland; epithelial cell; proliferation

C-Met是至今唯一被認識的肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor,HGF)高親和力受體,由c-Met基因編碼,HGF與c-Met結(jié)合后,可誘導(dǎo)其發(fā)生構(gòu)像變化,進而激活磷酸化通路,逐級放大信號,從而發(fā)揮HGF的生物學(xué)效應(yīng)。不少實驗表明,HGF/c-Met信號通路與多種細胞增殖,器官發(fā)生,腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有關(guān)[1]。已有實驗表明,人外泌汗腺上皮細胞(Human Eccrine Sweat Gland Epithelial Cells,hESGc)上存在c-Met受體,加入HGF能促進hESGc增殖[2],但下調(diào)c-Met表達對hESGc的影響尚不明確。RNA干擾是一種新興的基因抑制技術(shù),原理是通過設(shè)計小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA),介導(dǎo)序列高度同源的靶基因mRNA降解,下調(diào)靶基因表達[3]。本文擬利用重組腺病毒介導(dǎo)的siRNA技術(shù)下調(diào)c-Met表達對hESGc體外增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑:無血清角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基(keratinocyte serum free medium,KSFM)和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司, FITC-Annexin V試劑盒購自美國Trevigen公司,抗Marker 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品和兔抗c-Met多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司,鼠抗β-actin 抗體購自美國Novus 公司,其他分子生物學(xué)試劑購自美國Sigma 公司,pSES-HUS及腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1, 由美國芝加哥大學(xué)分子腫瘤實驗室TC. He教授惠贈;限制性內(nèi)切酶Sfi I, EcoRV, KanI, PmeI,PacI和T4 DNA連接酶 購自美國TaKaRa 公司和New England Biolabs(NEB)公司,Wizard Plus質(zhì)粒純化系統(tǒng)購自美國Promega 公司;Bio-Tek多功能讀板機購自美國Bio-Tek Synergy HT公司,CKX41-32PH 型倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)購自日本Olympus 公司,BioImaging Systems購自美國UVP 公司,FACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):hESGc在KSFM 中按我科已經(jīng)建立的方法培養(yǎng)和鑒定[2],取第1代細胞備用。

1.2.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建:從GenBank中檢索到c-Met的cDNA序列(登錄號:NM-000245),按照siRNA設(shè)計的原則選取靶序列。正義鏈5'-AGGACAATGATGGCAAGAAATTTT-3',反義鏈5'-ATTTCTTGCCATCATTGTCCTTTT--3'。參照He等[4-5]的方法先構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pSES-siRNA-c-Met,經(jīng)Pme I 酶切線性化后,與病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中進行同源重組,再經(jīng)Pac I酶切純化后轉(zhuǎn)染HEK293細胞包裝出重組腺病毒,經(jīng)熒光顯微鏡下觀察紅色熒光表達,即為構(gòu)建成功,命名為AdR-siRNA c-Met,于HEK293細胞中擴增。取僅含有紅色熒光蛋白RFP的空病毒(Ad-RFP)做對照。

1.2.3 SiRNA met腺病毒轉(zhuǎn)染hESGc細胞:第1代的hESGc細胞接種于6孔板,KSFM培養(yǎng),細胞的密度約60%～80%時,測定hESGc細胞的最適感染復(fù)數(shù),每孔分別加入AdR-siRNA c-Met 0μl、2μl、4μl、8μl、16μl、48h后,在熒光顯微鏡下觀察,統(tǒng)計表達RFP的細胞百分比(感染效率),取感染效率80%以上,同時細胞沒有明顯由病毒本身引起的細胞毒現(xiàn)象的病毒量,最終確定為4μl AdR-siRNA c-Met病毒液/孔。同理對照組Ad-RFP合適的病毒量亦為4μl Ad-RFP病毒液/孔。由于培養(yǎng)hESGc細胞時,6孔板每孔中培養(yǎng)基約1ml,故適合用于轉(zhuǎn)染的病毒濃度為4μl病毒原液/ml培養(yǎng)基。

1.2.4 Westernblot檢測: 培養(yǎng)14h后,細胞用PBS洗兩遍后,加入新鮮的KSFM培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染后48h,取細胞做westernblot檢驗,明確AdR-siRNA c-Met的有效性。設(shè)置對照組(無影響因素),陽性對照組(Ad-RFP轉(zhuǎn)染)和實驗組(AdR-siRNA c-Met轉(zhuǎn)染),在轉(zhuǎn)染后48h收集各組細胞,加入RIPA細胞裂解液,超聲破碎細胞,提取各組細胞總蛋白并采用BCA定量,取等量總蛋白(40μg)上樣,電泳,電轉(zhuǎn), 5%脫脂牛奶封閉3h, 加一抗(兔抗c-Met多克隆抗體,小鼠抗β-actin 抗體),室溫孵育2h,洗膜,加二抗(抗兔IgG-HRP,抗小鼠IgG-HRP),室溫孵育1h,洗膜,化學(xué)發(fā)光法檢測,曝光,顯影,定影,記錄實驗結(jié)果,Western blot 法測得所有數(shù)據(jù)均采用UVP BioImaging Systems 采集,將X 線片掃描后的圖像數(shù)據(jù)輸入LabWork 3.0 軟件進行圖像分析,將內(nèi)參β-actin 作為標(biāo)準(zhǔn)積分吸光度(standard integral absorbance,SIA),各目的條帶相對積分吸光度值(relativeintegral absorbance,RIA)=樣本積分吸光度值(integral absorbance,IA)/ SIA。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖: 實驗分成4組,空白組,對照組,陽性對照組和實驗組?？瞻捉M不含細胞,僅于96孔板加入200μl KSFM,對照組,陽性對照組和實驗組均于96孔板按 2×103個/孔接種hESGc,對照組每孔加入200μl KSFM,陽性對照組每孔加入含4μl /mL Ad-RFP 腺病毒的KSFM 200?l,實驗組每孔加入含4μl /ml AdR-siRNA c-Met 的KSFM 200μl 。每一組每一時相點設(shè)六復(fù)孔。各組在0天,2天,4天時采用MTT法檢測細胞增殖情況。從孵箱中取出待測96 孔板,每孔加入MTT 溶液(5g/L)20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄上清,每孔加入DMSO 100μl,振蕩10min,在Bio-Tek 多功能讀板機570 nm 波長測定吸光度(A)值,并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(陽性對照組A 值-實驗組A 值)/ 陽性對照組A值×100%。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS11.0 統(tǒng)計軟件包進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析,兩兩比較采用SNK,P值

2結(jié)果

2.1 SiRNA c-Met重組腺病毒轉(zhuǎn)染hESGc:所構(gòu)建的pSES-HUS-siRNA c-Met干擾序列由美國芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心測序中心測序,包含目的基因在內(nèi)的序列正確。hESGc細胞轉(zhuǎn)染了AdR-siRNA c-Met后,熒光顯微鏡下可見紅色熒光蛋白表達(見圖1)。

2.2 Westernblot檢測:hESGc細胞轉(zhuǎn)染AdR-siRNA c-Met后48h,收集細胞進行westernblot檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),AdR-siRNA c-Met轉(zhuǎn)染能抑制hESGc細胞中c-Met蛋白的表達(見圖2),通過UVP BioImaging Systems 采集圖像后分析發(fā)現(xiàn),對細胞中c-Met蛋白的抑制能達到70%以上。

2.3 MTT 法檢測細胞活力:在加入腺病毒轉(zhuǎn)染之前,各組間A 值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。腺病毒轉(zhuǎn)染hESGc后,2天,4天均能抑制細胞的增殖,實驗組A值與陽性對照組和對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。

3討論

HGF是一個多效應(yīng)生長因子,具有多種生物活性,參與機體多種器官組織細胞生長、再生和重塑,研究表明,HGF對多種細胞均有促進增殖和運動的作用,如BMSCs、平滑肌細胞、牙髓細胞、腎小管上皮細胞、角膜上皮細胞以及視網(wǎng)膜上皮細胞等[6-8]。c-Met是HGF特異性受體,其在組織中廣泛存在,但是上皮細胞中表達濃度最高[9]。HGF與c-Met結(jié)合后,可誘導(dǎo)其發(fā)生構(gòu)像變化,激活受體胞內(nèi)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中的蛋白酪氨酸激酶(PTK) ,使受體自身的酪氨酸殘基磷酸化而激活受體[10]。除自身磷酸化外,c-Met 蛋白的酪氨酸激酶活性可導(dǎo)致多種底物蛋白的酪氨酸磷酸化,經(jīng)瀑布式磷酸化反應(yīng),將信號逐級放大,最終轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄機構(gòu),導(dǎo)致細胞的增殖、分化[11]。

汗腺起著排汗,調(diào)節(jié)體溫,物質(zhì)交換等重要作用,深入研究汗腺細胞的生物學(xué)行為的影響因素,對揭示汗腺及其他管狀系統(tǒng)的發(fā)育和功能有著重要的意義,我們既往的研究表明[12],hESGc上有HGF特異性受體c-Met表達,含40～80ng/ml的HGF的培養(yǎng)基能明顯促進hESGc的增殖,20～40ng/ml HGF可促進hESGc細胞移行(P

RNA干擾技術(shù)具有高效、穩(wěn)定且易操作等特點,Shinomiya等用腺病毒介導(dǎo)的siRNA技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)c-Met表達可抑制多種細胞的體外生長,器官發(fā)生和體內(nèi)成瘤[13]。本研究構(gòu)建了含siRNA c-Met的腺病毒,感染hESGc后能有效的抑制c-Met的表達,下調(diào)70%,能明顯抑制hESGc的增殖,2天抑制率為16.8% 4天抑制率為34.5%(P

本實驗通過基因轉(zhuǎn)染和RNA 干擾技術(shù), 將針對c-Met 基因的靶向siRNA轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的hESGc,探討其對細胞c-Met的表達及細胞增殖能力的影響,為汗腺疾病的基因治療和汗腺發(fā)生發(fā)育研究提供新的思路和理論依據(jù)。

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篇10

目的：探討羊膜培養(yǎng)液對角膜上皮細胞中血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達的影響。方法：刮除并收集新鮮兔角膜上皮細胞，傳代培養(yǎng)接種于35mm培養(yǎng)皿及自制的羊膜培養(yǎng)皿上。實驗分為4組，Ⅰ組(對照組)：無血清的DMEM培養(yǎng)液，Ⅱ組：去上皮的羊膜培養(yǎng)液，Ⅲ組：未去上皮的羊膜培養(yǎng)液，Ⅳ組：將細胞直接接種于無上皮羊膜。作用48h后用Trizol法提取各組樣本的總RNA，進行RTPCR一步法反應(yīng)檢測各組VEGF mRNA表達并與βactin比較。結(jié)果：正常角膜上皮細胞中有VEGF基因表達，在Ⅲ，Ⅳ組中表達受到明顯抑制（P＜0.01，n=5）。結(jié)論：羊膜培養(yǎng)液明顯抑制VEGF mRNA在角膜上皮細胞中的表達。

【關(guān)鍵詞】 羊膜；角膜新生血管；血管內(nèi)皮生長因子；角膜上皮細胞

Abstract　AIM: To detect the suppression effects of culture supernatant of human amniotic membrane on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) in rabbit corneal epithelial (RCE) cells.METHODS: The normal RCE cells were cultured for 7 days until there were confluences on the cultures. The cells were subcultured to plastic(3 groups，ⅠⅢ， Ⅰ was control) and naked amniotic membrane (Ⅳ group) cultures respectively. Then one of plastic group (Ⅱ group) was cultured by culture supernatant of human amniotic membrane without epithelial layer as its medium; another plastic group (Ⅲ group) was cultured by culture supernatant of human amniotic membrane with epithelial layer as its medium; the other two groups (Ⅰand Ⅳgroup) were still cultured by DMEM (free from FBS components ).After 48 hours， the total RNAs of these cultures were extracted and detected by RTPCR.RESULTS:There were expressions of VEGF mRNA from Ⅰ group and Ⅱ group， however， the expressions were significantly suppressed in Ⅲ group(using culture supernatant of human amniotic membrane with epithelial layer as its medium) and Ⅳ group (RCE cultered directly on naked amniotic membrane) （P＜0.01， n=5）.CONCLUSION: Amniotic membrane transplantation is partly through depressing the mRNA expression of VEGF in corneal cells to reduce the corneal neovascularization of injuried corneal surface. And it may be an efficient method of curing corneal neovascularization in clinic.



KEYWORDS: amniotic membrane; corneal neovascularization; vascular endothelial growth factor; corneal epithelial cell

0　引言

正常的角膜無血管，角膜新生血管（corneal neovascularization， CNV）常由損傷及各種炎癥刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生。嚴(yán)重的角膜新生血管化會導(dǎo)致視力下降甚至視力喪失；隨著新生血管的長入，角膜的免疫赦免地位喪失。雖然目前有多種方法用于治療角膜新生血管，但均未獲得滿意療效。臨床上羊膜角膜移植及羊膜移植眼表重建，均顯示其有抑制角膜新生血管的作用[1]，雖然已知羊膜的細胞外基質(zhì)及可溶性細胞因子可能參與這一作用機制[2，3]，然而具體作用機制仍不明。最近研究表明，羊膜培養(yǎng)液可明顯地抑制角膜新生血管化[4]，為進一步理解這一作用機制，我們應(yīng)用可能釋放多種細胞因子的羊膜培養(yǎng)液，對角膜上皮細胞中血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）表達的影響進行研究。

1　材料和方法

1.1　材料

羊膜取自于健康剖腹產(chǎn)孕婦的胎盤，無菌條件下鈍性剝離羊膜，用含有抗生素的PBS液（1×105U/L青鏈霉素）清洗羊膜3次，將羊膜上皮面向上貼附于無菌的醋酸纖維素膜上，放入15cm的玻璃培養(yǎng)皿中，加入DMEM培養(yǎng)基+甘油（V/V，1∶1）混合液，80℃低溫冰箱冷凍保存。使用時，將羊膜置于室溫解凍，PBS液水化30min，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA混合液在37℃消化30min，用細胞刮刀輕輕刮除羊膜的上皮層后，用PBS液漂洗3次，剪成4cm×4cm大小備用。將35mm培養(yǎng)皿的底鉆掉，消毒后備用。將剪好的去掉上皮的羊膜的基底面向上，包于35mm培養(yǎng)皿上，用手術(shù)縫線固定。將羊膜為底的培養(yǎng)皿置于60mm培養(yǎng)皿中，加入少量DMEM培養(yǎng)基（含有150mL/L胎牛血清），于CO2細胞培養(yǎng)恒溫箱中過夜。取經(jīng)無菌處理的新鮮羊膜，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA混合液在37℃消化30min。以細胞刮刀將羊膜的上皮層細胞成分刮掉，將去上皮成分的4cm×4cm大小羊膜3塊浸泡于制備好的無血清DMEM細胞培養(yǎng)基30mL中。作用48h后取其上清液待用。取經(jīng)無菌處理的新鮮羊膜，保留其上皮層，將4cm×4cm大小羊膜3塊浸泡于制備好的無血清DMEM細胞培養(yǎng)基30mL中。作用48h后取其上清液待用。

1.2　方法

兔處死后，立即將眼球取出，共30眼。用加有雙抗的生理鹽水漂洗3次，用剪刀取下透明的角膜部分，浸于生理鹽水中，漂洗1次。用手術(shù)刀片去掉角膜的內(nèi)皮層，其余組織上皮面向上移入7.5cm玻璃平皿中，加入2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA的混合液，37℃下消化25min后，用刀片將角膜的上皮層輕輕刮下，離心收集上皮細胞接種到25mL培養(yǎng)瓶中，以含150mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，2～3d換液1次。培養(yǎng)7d致形成融合性生長，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA的混合液消化后，分別傳代接種于35mm培養(yǎng)皿和單純?nèi)ド掀ぱ蚰榈孜锏呐囵B(yǎng)皿組。用含150mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代細胞形成70%融合性生長后，將各組中的培養(yǎng)液換為無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12h，以去除其它活性成分的影響。實驗分為4組，即Ⅰ組(對照組)：無血清的DMEM培養(yǎng)液，Ⅱ組：去上皮的羊膜培養(yǎng)液，Ⅲ組：未去上皮的羊膜培養(yǎng)液，Ⅳ組：將細胞直接接種于無上皮羊膜。每組設(shè)5個平行孔。12h后，接種于35mm培養(yǎng)皿的Ⅱ組中加入去上皮的羊膜培養(yǎng)上清液作為培養(yǎng)液，向Ⅲ組中加入未去上皮的羊膜培養(yǎng)上清液作為培養(yǎng)液，其余2組仍用無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，去除各樣本中的多余培養(yǎng)液，并向每個35mm培養(yǎng)皿樣品中加入Trizol提取液1mL，最終RNA沉淀物加入DEPC水20μL充分溶解，80℃冷凍保存。PCR引物由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計并合成，用滅菌水配成20μmol/L的溶液，4℃保存。引物序列：VEGF 130bp，Sense TATTCAAGCCTTCCTGCGTG，Antisense TGAGGTTTGATCCGCAT；βactin 320bp Sense GCTGTCCCTGTACGCCTCTG，Antisense TGCCGATGGTGATGACCTGG，將RTPCR反應(yīng)產(chǎn)物各取5μL，加樣于20g/L濃度的瓊脂糖凝膠中進行電泳，80V電壓下電泳35min。照相記錄結(jié)果經(jīng)掃描通過QuantiScan分析軟件處理，以內(nèi)參照βactin為基準(zhǔn)分析計算各條帶的相對含量（圖1）。

2　結(jié)果

正常角膜上皮細胞有VEGF mRNA表達，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果顯示VEGF mRNA在無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)組（Ⅰ組）和去上皮的羊膜培養(yǎng)液組（Ⅱ組）中均有表達，在以未去上皮的羊膜培養(yǎng)液組（Ⅲ組）及單純?nèi)ド掀ぱ蚰さ孜锱囵B(yǎng)皿接種組（Ⅳ組）中表達均受到了明顯的抑制（P＜0.01，n=5）。

3　討論

角膜新生血管（neovascularization， NV）常由損傷、炎癥、感染、多次角膜眼表手術(shù)及各種病理原因所致，這包括各種熱化學(xué)燒傷及各種炎癥刺激。隨著眼表重建術(shù)的廣泛開展，一些嚴(yán)重結(jié)角膜疾病所致眼表損傷后的角膜新生血管，已經(jīng)逐漸成為困擾人們的主要問題。新生血管的形成，為創(chuàng)面的愈合提供了有利的條件，然而大量的新生血管在損傷愈合后，會使角膜失去其特有的光學(xué)特性，嚴(yán)重的角膜新生血管化會導(dǎo)致視力下降甚至視力喪失；新生血管的長入使角膜失去相對免疫赦免地位，增加了角膜移植手術(shù)排斥反應(yīng)的發(fā)生幾率。目前雖有多種治療方法，但效果均不理想。因而尋找簡單、有效的治療方法，是目前眼科面臨的課題之一。臨床上羊膜角膜移植及羊膜移植眼表重建，均顯示其有抑制角膜新生血管的作用[1]，然而具體作用機制仍不十分明確。最近，我們的研究表明[4]，培養(yǎng)羊膜的上清液可明顯地抑制角膜新生血管化，并觀察到其可能通過抑制血管內(nèi)皮細胞的生長和遷徙來抑制角膜新生血管形成。另外，Tseng等[5]的一項研究顯示，羊膜基質(zhì)可以抑制角膜和角膜緣成纖維細胞中TGF家族及其受體的表達，提示羊膜可以調(diào)控培養(yǎng)于其上角膜細胞的基因表達與行為。我們對體外培養(yǎng)的角膜上皮細胞研究發(fā)現(xiàn)，血管活化因子VEGF在正常角膜上皮細胞中均有表達，提示兔角膜上皮細胞可能參與了角膜新生血管的形成或調(diào)控。血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF可刺激多種血管內(nèi)皮細胞的生長、增殖、遷徙移行，并刺激血管基質(zhì)細胞分泌細胞外基質(zhì)，刺激新生血管增生[6]。參與調(diào)控多種新生血管形成與增殖，如角膜新生血管化、視網(wǎng)膜下新生血管化的形成及在各種腫瘤的新生血管化的形成中均起著非常重要的作用。其在活躍的新生血管組織及器官，活性也明顯增強。在臨床中，Tseng等[5]提倡使用保存的羊膜作為移植物，保存的羊膜上的上皮細胞經(jīng)過反復(fù)處理其所具有的作用會大大下降，而臨床羊膜移植物一般自然溶解可能需要2wk左右。這樣一段時間，羊膜細胞中產(chǎn)生的那些抗炎抗血管形成的物質(zhì)會被消耗掉。但據(jù)臨床觀察，用保存的羊膜進行移植一樣也可獲得較好的療效。為了說明這種現(xiàn)象，我們設(shè)計了Ⅳ組，即將兔角膜上皮細胞直接培養(yǎng)在去掉上皮層的羊膜上(羊膜已冷凍保存6mo)，考察其對角膜上皮細胞中VEGF mRNA表達影響。我們發(fā)現(xiàn)其與前幾組比較，VEGF的表達則受到了明顯的抑制。這可能與羊膜基底膜和致密層的生物學(xué)特性有很大關(guān)系。羊膜的基底膜主要由Ⅳ型膠原，Ⅶ型膠原和層粘連蛋白組成。雖然基底膜中Ⅳ型膠原的α2鏈與結(jié)膜基底膜相同，而無角膜上皮基底膜中Ⅳ型膠原的α5鏈，但層粘連蛋白1，層粘連蛋白5，纖維連接蛋白和Ⅶ型膠原的成分與角膜基質(zhì)中的成分是相同的[2]。因此，羊膜的基底膜提供了一個遠比其它媒介物質(zhì)更接近正常眼表成分的微環(huán)境，這不但可以促進角膜上皮的生長，而且基底膜中的細胞外基質(zhì)成分具有抗新生血管形成及抗炎的作用，這也可能是為什么Ⅳ組的角膜上皮細胞中VEGF的表達受到明顯抑制的原因。

由于羊膜細胞（尤其是羊膜上皮細胞）能夠產(chǎn)生大量的生長因子及抗炎、抗血管生成因子成分，具有抗炎、抗新生血管的作用，因此，我們建議可以在羊膜移植中盡量保留其上皮細胞成分，也許這更有利于羊膜移植后的眼表功能重建。另外，羊膜培養(yǎng)液對角膜新生血管的抑制作用可能為目前眼科臨床提供一種簡單，有效的治療方法。 參考文獻

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