導(dǎo)語：醫(yī)學(xué)生社會(huì)實(shí)踐論文：辛基酚對(duì)MDA一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】,細(xì)胞增殖;,,乳腺癌;,辛基酚；細(xì)胞周期蛋白D1;細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶類

EffectsofoctylphenoloncellcycleandcyclinexpressionofmdaMB231breastcancercells

【Abstract】AIM:Toobservetheeffectsofoctylphenol(OP)oncellcycleandcyclinexpressionofMDAMB231breastcancercellsandtoprobethemolecularmechanismsofOPinhibitingMDAMB231breastcancercellproliferation.METHODS:Thechangesofcellproliferation,cellcycle,cyclinD1mRNA,cyclinD3mRNA,CDK2mRNA,CDK4mRNAandcyclinD1proteinexpressionsofMDAMB231cellstreatedwithOPwereobservedbyusingMTTtest,flowcytometry,immunocytochemistryandRTPCR.RESULTS:WhenMDAMB231breastcancercellsweretreatedwith4or8μmol/LOPfor48h,thecellinhibitionrateswere(17.13±4.1)%,(40.25±8.7)%,andthefluorescencevaluesofcyclinD1were55.1±10.2,41.4±11.2,significantlydecreasedascomparedwithcontrolgroup(89.9±11.2,P<0.05).WhenMDAMB231breastcancercellsweretreatedwith8μmol/LOPfor24and72h,thecellratiosintheG0/G1phasewere(67.0±17.6)%and(44.4±11.9)%，significantlyincreasedascomparedwithcontrolgroup［(46.6±12.8)%at24h,(15.3±3.1)%at72h,P<0.05］.OPinhibitedthemRNAexpressionsofcyclinD1,cyclinD3,CDK2andCDK4andtheproteinexpressionofcyclinD1.CONCLUSION：OPcaninhibittheproliferationofMDAMB231breastcancercells,whichmayberelatedtodownregulatingtheexpressionsofcyclinD1,cyclinD3,CDK2andCDK4mRNAandcyclinD1protein.

【Keywords】cellproliferation;breastneoplasms;octylphenol;cyclinD1；cylindependentkinases

【摘要】目的:觀察辛基酚(OP)對(duì)細(xì)胞周期及周期蛋白表達(dá)的影響，探討OP抑制MDAMB231乳腺癌細(xì)胞增殖的可能分子機(jī)制.方法：以MTT試驗(yàn)、流式細(xì)胞分析、免疫細(xì)胞化學(xué)和RTPCR等方法觀察OP對(duì)MDAMB231乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3表達(dá)的影響.結(jié)果：4,8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細(xì)胞48h時(shí)，其抑制率為(17.1±4.1)%,(40.3±8.7)%，cyclinD1表達(dá)量熒光值為55.1±10.2，41.4±11.2，比對(duì)照組(89.9±11.2)明顯降低(P<0.05).8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細(xì)胞24h和72h，G0/G1期細(xì)胞為(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%，G0/G1期細(xì)胞比對(duì)照組［24h，(46.6±12.8)%；72h，(15.3±3.1)%］明顯增高(P<0.05).OP導(dǎo)致MDAMB231乳腺癌細(xì)胞中CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3mRNA的表達(dá)降低，且cyclinD1蛋白的表達(dá)也降低.結(jié)論：OP能抑制MDAMB231乳腺癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與OP能降低乳腺癌細(xì)胞中CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3mRNA及其蛋白的表達(dá)有關(guān).

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞增殖;乳腺癌;辛基酚；細(xì)胞周期蛋白D1;細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶類

0引言

辛基酚（octylphenols,OP）是一種環(huán)境雌激素，近年來對(duì)它的雌激素活性檢測及其生殖毒性效應(yīng)研究較多［1］.OP能促進(jìn)ERα+MCF7乳腺癌細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)雌激素活性，卻抑制ERα-MDAMB231乳腺癌細(xì)胞的增殖［2］.細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期密切相關(guān)，本研究將OP作用于MDAMB231乳腺癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞的增殖和CDK2,CDK4,cyclinD1，cyclinD3表達(dá)的改變，探討OP影響MDAMB231乳腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制.

1材料和方法

1.1材料試劑中，OP純度>98%，sigma產(chǎn)品.cyclinD1抗體為兔抗人抗體，使用濃度為1∶75倍稀釋，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔抗體，北京中杉產(chǎn)品.RTPCR試劑盒，上海sangon產(chǎn)品.二甲亞砜(DMSO)，純度>98%，進(jìn)口分裝試劑，用于配制OP.MDAMB231乳腺癌細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞所提供.實(shí)驗(yàn)前將MDAMB231乳腺癌細(xì)胞在無酚紅的DMEM/F12中培養(yǎng)24h以耗盡細(xì)胞的內(nèi)源性雌激素，然后以該培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組，給予DMSO；4μmol/LOP組；8μmol/LOP組.

1.2方法

1.2.1MTT試驗(yàn)以492nm波長測定活細(xì)胞的吸光度（A），抑制率（PR）=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%，每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行孔，試驗(yàn)重復(fù)3次［3］.

1.2.2細(xì)胞周期相及凋亡檢測實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞處理24,48和72h，收獲細(xì)胞，700mL/L冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶(PI)染色，流式細(xì)胞儀檢測，每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行孔，試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.3cyclinD1表達(dá)分析細(xì)胞生長于小蓋玻片上，多聚甲醛固定，血清封閉，加一抗于37℃孵育50min，加熒光素標(biāo)記二抗孵育20min，甘油封片，LeicaNT激光共聚焦顯微鏡觀察、照相及數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次.計(jì)算熒光強(qiáng)度時(shí)每組實(shí)驗(yàn)取3張片子，每張片子取36個(gè)視野，每個(gè)視野取5個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其平均熒光強(qiáng)度.

1.2.4RTPCR檢測CDK2,CDK4,cyclinD1,cyclinD3的mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞處理24h，收獲細(xì)胞，用Trizol試劑一步法提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-80℃?zhèn)溆?引物由上海sangon合成，CDK2：F5′GCTCTCACTGGCATTCCTCCT3′，R5′5′CGAAATGAAGGCACTAGAGC3′，產(chǎn)物546bp；CDK4：F5′CTACCTCTCGATATGAGCCAGT3′，R5′CATCTGGTAGCTGTAGATTCTG3′，產(chǎn)物563bp；cyclinD1：F5′GAGGAACAGAAGTGCGAGGA3′，R5′TCTGGAGAGGAAGCGTGTGA3′，產(chǎn)物501bp；cyclinD3：F5′TGTCAGGAGCAGATCGAAGC3′，R5′CCTTTAGAAGGCACTAGAGC3′，產(chǎn)物453bp；βactin：F5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′，R5′GGCGGCACCACCATGTACCCT3′，產(chǎn)物202bp.25μL體系加樣本總cDNA，上游和下游引物各1.5μL，依次加入試劑盒其他成分.反應(yīng)條件為94℃滅活40s，60℃或61℃退火40s，72℃延伸40s，22個(gè)循環(huán)，20g/L瓊脂糖電泳，照相，半定量分析以凝膠成像系統(tǒng)的分析軟件Q1來分析其灰度值，每實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以目的條帶/βactin之比值為結(jié)果，各組間進(jìn)行單因素方差分析.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析.

2結(jié)果

2.1MDAMB231乳腺癌細(xì)胞增殖以4,8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細(xì)胞48h，細(xì)胞抑制率為(17.1±4.1)%，(40.3±8.7)%.

2.2MDAMB231乳腺癌細(xì)胞周期相分布8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細(xì)胞24h和72h，G0/G1期細(xì)胞分別為(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%，G0/G1期細(xì)胞比對(duì)照組［24h，(46.6±12.8)%；72h，(15.3±3.1)%］明顯增高(P<0.05).

2.3MDAMB231乳腺癌細(xì)胞中cyclinD1蛋白表達(dá)cyclinD1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞的胞漿中(圖1)，4,8μmol/LOP組cyclinD1表達(dá)量熒光值分別為55.1±10.2，41.4±11.2，比對(duì)照組(89.9±11.2)明顯降低(P<0.05).

A：對(duì)照組；B：4μmol/LOP組；C：μmol/LOP.

圖1OP對(duì)MDAMB231乳腺癌細(xì)胞中cyclinD1表達(dá)的影響SPFITC×400（略）

2.4MDAMB231乳腺癌細(xì)胞中CDK2,CDK4,cyclinD1,cyclinD3mRNA表達(dá)mRNA的表達(dá)以電泳條帶的亮度來判斷，亮度值越強(qiáng)，mRNA量越高，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)軟件處理，與對(duì)照組比較，OP組CDK2,CDK4,cyclinD1及cyclinD3mRNA表達(dá)均降低(圖2).

M:marker;1:8μmol/LOP;2:4μmol/LOP;3:對(duì)照.aP<0.05vs對(duì)照.

圖2OP對(duì)MDAMB231乳腺癌細(xì)胞中cyclinD3,cyclinD1,CDK2,CDK4mRNA表達(dá)的影響（略）

3討論

雌激素是哺乳動(dòng)物體內(nèi)分泌的一種性激素，起著調(diào)節(jié)動(dòng)物生長、分化和生殖的作用.OP是一種苯環(huán)類化合物，能與ERα結(jié)合，顯示出雌激素活性.OP主要用于生產(chǎn)非離子表面活性劑、增塑劑、熱穩(wěn)定劑、光穩(wěn)定劑等，廣泛存在于生活、工作環(huán)境的水體、淤泥、土壤和食物如魚類、貝類及飲用水中［4］.MDAMB231乳腺癌細(xì)胞是一株ERα-的細(xì)胞，>15μmol/LOP對(duì)MCF7乳腺癌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性作用，1~10μmol/LOP會(huì)對(duì)MDAMB231乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)，抑制MDAMB231乳腺癌細(xì)胞的增殖［1］.以植物雌激素三羥異黃酮作用184B5/HER細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞數(shù)量減少，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，同時(shí)G0/G1期細(xì)胞增高，細(xì)胞凋亡也增多.本研究結(jié)果顯示4，8μmol/LOP均能抑制MDAMB231乳腺癌細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng).

細(xì)胞增殖依賴于細(xì)胞周期的順利進(jìn)行，該過程受G1/S，G2/M兩個(gè)關(guān)健點(diǎn)調(diào)控.植物雌激素三羥異黃酮能將MDAMB231乳腺癌細(xì)胞阻滯于G2/M期，細(xì)胞凋亡增加［5］，超二倍體增加.本研究結(jié)果顯示OP作用MDAMB231乳腺癌細(xì)胞24h，G0/G1期細(xì)胞(凋亡峰)明顯增加(P<0.05)，表明OP具有急性毒性作用，細(xì)胞迅速凋亡.OP引起MDAMB231乳腺癌細(xì)胞周期阻滯與三羥異黃酮不同，這可能與三羥異黃酮具有多種生物活性有關(guān).

細(xì)胞增殖依賴于細(xì)胞周期的順利進(jìn)行，細(xì)胞周期的正常進(jìn)行又依賴于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白如cyclinD，cyclinA，cyclinE等及細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)的正常表達(dá).cyclinDCDK4是G0/G1期的限速步驟，過度表達(dá)G1期的周期蛋白如cyclinD，cyclinE能加速細(xì)胞快速通過G1期.cyclinD1蛋白表達(dá)與細(xì)胞周期運(yùn)行有關(guān)［6］，抑制腫瘤組織生長與P53的高表達(dá)及cyclinD1低表達(dá)相關(guān)［7］.以17羥雌二醇作用雌性Wistar大鼠60d，發(fā)現(xiàn)雌二醇通過減少CDK2，CDK4的表達(dá)以及降低CDK2活性，將細(xì)胞阻滯于G1/S期［8］.本研究結(jié)果表明，OP作用MDAMB231乳腺癌細(xì)胞后，能降低CDK2,CDK4,cyclinD1及cyclinD3mRNA的表達(dá)，降低cyclinD1蛋白的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞阻滯于G1/S期，導(dǎo)致MDAMB231乳腺癌細(xì)胞的增殖受抑，并呈劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng).

【參考文獻(xiàn)】

［1］YoshidaM,TakenakaA,KatsudaS,etal.NeonatalexposuretoptertoctylphenolcausesabnormalexpressionofestrogenreceptoralphaandsubsequentalterationofcellproliferatingactivityinthedevelopingDonryuratuterus［J］.ToxicolPathol,2002,30(3):357-364.

［2］VermaSP,GoldinBR.EffectsofsoyderivedisoflavonoidsontheinducedgrowthofMCF7cellsbyestrogenicenvironmentalchemicals［J］.NutrCancer,1998,30(3):232-239.

［3］艾金霞，劉良，王冰梅.SBHL對(duì)Hela細(xì)胞生長抑制作用的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,25(19):1791-1793.

［4］彭俊華，張峰.辛基酚對(duì)機(jī)體健康的影響及其機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2004,25(6):445-446.

［5］PoLS,ChenZY,TsangDS,etal.Baicaleinandgenisteindisplaydifferentialactionsonestrogenreceptor(ER)transactivationandapoptosisinMCF7cells［J］.CancerLett,2002,187(12):33-40.

［6］黃安湯,章翔,曹云新,等.cyclinD1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)分布模式初步［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003,24(22):2024-2026.

［7］UmemuraS,TakekoshiS,SuzukiY,etal.Estrogenreceptornegativeandhumanepidermalgrowthfactorreceptor2negativebreastcancertissuehavethehighestKi67labelingindexandEGFRexpression:geneamplificationdoesnotcontributetoEGFRexpression［J］.OncolRep,2005,14(2):337-343.

［8］KoroxenidouL,OhlsonLC,PorschHallstromI.Longterm17alphaethinylestradioltreatmentdecreasescyclinEandcdk2expression,reducescdk2kinaseactivityandinhibitsSphaseentryinregeneratingratliver［J］.JHepatol,2005,43(3):478-484.