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【關(guān)鍵詞】血管瘤；核轉(zhuǎn)錄因子；

摘要：目的：探討NFκBp65在血管瘤發(fā)生、發(fā)展及退化過程中的表達(dá)狀況及其意義。方法：采用免疫組織化學(xué)方法（SP法）和原位雜交的方法，檢測人皮膚血管瘤增生期、退化期及正常皮膚組織及內(nèi)皮中nfκBp65的表達(dá)水平，并利用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)測量不同時(shí)期血管瘤組織和正常皮膚組織NFκBp65表達(dá)的平均光密度和平均陽性面積。結(jié)果：增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞NFκBp65表達(dá)水平高于退化期，差異有顯著性(P＜0.01)；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞NFκBp65表達(dá)水平與正常皮膚組織相比，差異無顯著性(P＞0.05)。結(jié)論：NFκBp65可能通過調(diào)控血管生成因子的表達(dá)而促進(jìn)血管瘤的形成。

關(guān)鍵詞：血管瘤；核轉(zhuǎn)錄因子；

血管生成因子皮膚血管瘤是嬰幼兒常見的良性腫瘤，是以毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生為主要特征。在血管瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中，血管生成被公認(rèn)為是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在眾多血管生成因子中，已證明TGFβ、TNFα、IL1α、IL8、ICAM1等含有NFκB的特異性結(jié)合位點(diǎn)，其表達(dá)受NFκB的調(diào)控，而這其中的一些因子，例如TGFβ、ICAM1等，已被證實(shí)與血管瘤的病理演變過程有關(guān)。為此我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)和原位雜交的方法檢測了同時(shí)期人皮膚血管瘤組織中以及正常皮膚組織中NFκBp65蛋白的表達(dá)，以探討NFκBp65在血管瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制。

1材料與方法

11材料

111材料來源收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科1996~2001年皮膚血管瘤存檔蠟塊49例。其中男性26例，女性23例；最小年齡2月，最大年齡68歲，平均年齡30.3歲。這些血管瘤所在的部位有頭皮、前額、眼瞼、耳背、頸部、背部、上臂、大腿、手和足的皮膚等?；颊咝g(shù)前均未做任何輔助性治療。

112材料分組蠟塊切片厚5μm，常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)SP法檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA，proliferatingcellnuclearantigen），按Mulliken分類標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合PCNA的表達(dá)進(jìn)行分組。增生期血管瘤27例，退化期血管瘤22例，另取瘤組織周圍正常皮膚組織5例作對照。

12試劑與儀器

121主要試劑NFκBp65mRNA原位雜交檢測試劑盒；濃縮型鼠抗人NFκBp65單克隆抗體；即用型鼠抗人PCNA單克隆抗體；即用型兔抗人第Ⅷ因子相關(guān)抗原單克隆抗體；即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸。

122主要儀器YWY781型醫(yī)用微波儀(250W，50Hz)；家用高壓鍋。

13方法

131常規(guī)HE染色。

132免疫組織化學(xué)SP法檢測PCNA和第Ⅷ因子相關(guān)抗原及NFκBp65主要步驟：5μm組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫處理10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，PCNA、NFκBp65采用高壓抗原修復(fù)，第Ⅷ因子相關(guān)抗原采用胃酶消化修復(fù)抗原，正常羊血清處理10min以減少非特異性背景，一抗(NFκB，1:200)37℃孵育1h，生物素標(biāo)記的二抗處理10min，鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶復(fù)合物處理10min，DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照組，作為NFκBp65的陽性對照組，人正常皮膚組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞作為PCNA的陽性對照組。

133原位雜交檢測NFκBp65mRNA的表達(dá)主要步驟：組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫處理10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。切片上滴加胃蛋白酶，37℃消化25min。按每張切片加20μl含寡核苷酸探針的原位雜交液，37℃恒溫過夜進(jìn)行雜交。洗脫后滴加封閉液37℃，20min。滴加SAHRP37℃處理20min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替含寡核苷酸探針的原位雜交液作為陰性對照組，人扁桃體作為陽性對照組。

14結(jié)果判斷

141PCNA和第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷PCNA以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，第Ⅷ因子相關(guān)抗原以胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

142NFκBp65免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷NFκBp65以胞核和胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)對NFκBp65mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（×400),測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。

143NFκBp65mRNA原位雜交檢測結(jié)果判斷細(xì)胞膜或胞漿呈藍(lán)色為NFκBp65mRNA陽性，陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無藍(lán)色反應(yīng)物。定量分析方法同上。

15統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對各組NFκBp65免疫組織化學(xué)及原位雜交化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

2結(jié)果

21HE染色

增生期血管瘤組織中可見條索狀或片狀內(nèi)皮細(xì)胞增生，其間有不規(guī)則的內(nèi)皮間隙和完整的血管腔，內(nèi)皮細(xì)胞核肥大而淡染。退化期血管瘤組織中可見內(nèi)皮細(xì)胞減少，血管腔增大，血管間結(jié)締組織增多，內(nèi)皮細(xì)胞核扁平。

22PCNA的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核肥大，核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒，PCNA表達(dá)強(qiáng)；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核扁平，大多數(shù)細(xì)胞核被蘇木精染成藍(lán)色，少數(shù)胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒，PCNA弱表達(dá)。

23第Ⅷ因子相關(guān)抗原的表達(dá)

增生期和退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒。

24NFκBp65的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和部分內(nèi)皮細(xì)胞胞核內(nèi)有較多棕黃色顆粒，NFκBp65表達(dá)強(qiáng)；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有少許或無棕黃色顆粒沉積，胞核內(nèi)無棕黃色顆粒沉積，NFκBp65表達(dá)極弱或無表達(dá)；正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有少許或無棕黃色顆粒沉積，胞核內(nèi)無棕黃色顆粒沉積，NFκBp65表達(dá)極弱或無表達(dá)。經(jīng)單因素方差分析，各組間的差異有顯著性意義(P＜0.05)。經(jīng)q檢驗(yàn)，增生期組與退化期組、增生期組與正常皮膚組之間平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P＜0.01)；退化期組與正常皮膚組之間平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P＞0.05)。見表1。表1血管瘤不同時(shí)期NFκBp65表達(dá)的平均光密度和陽性面積率

25原位雜交檢測NFκBp65mRNA的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞膜和胞漿有較密集藍(lán)色顆粒；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞膜和胞漿內(nèi)無藍(lán)色顆粒沉積；正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜和胞漿無藍(lán)色顆粒沉積。圖像分析結(jié)果顯示：增生期血管瘤NFκBp65mRNA表達(dá)的平均光密度為0.1563化期血管瘤表達(dá)NFκBp65mRNA的平均光密度為0.0617，正常皮膚組織NFκBp65mRNA表達(dá)的平均光密度為0.0516；增生期血管瘤表達(dá)的NFκBp65mRNA陽性面積率為0.2881，退化期血管瘤NFκBp65mRNA表達(dá)的陽性面積率為0.1250，正常皮膚組織NFκBp65mRNA表達(dá)的陽性面積率為0.1289。經(jīng)單因素方差分析，增生期組與退化期組，正常皮膚組與增生期組的差異有顯著性意義（P＜0.05)。經(jīng)q檢驗(yàn)，退化期組與增生期組、增生期組與正常皮膚組之間平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義（P＜0.05)。退化期組與正常皮膚組差異無顯著性意義。見表2。表2血管瘤不同時(shí)期NFκBp65mRNA表達(dá)的平均光密度和陽性面積

3討論

血管瘤是一種良性腫瘤，內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖和凋亡、血管迅速生長是血管瘤病理組織學(xué)的最大特點(diǎn)。近年來研究表明［1~2］，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管形成（angiogenesis）在血管瘤病理演變過程中起重要作用。體外組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)血管瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞比正常組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞更易生長，還能攝取3H胸苷,并可見到血管形成現(xiàn)象，提示血管瘤是一種血管形成性疾?。?］。目前，有關(guān)血管瘤形成過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖的研究報(bào)道較少。核轉(zhuǎn)錄因子NFκB是1986年由美國麻省理工學(xué)院癌癥研究中心的Baltimore和麻省Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究所的Sen［4］在成熟B細(xì)胞和漿細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的這種能與免疫球蛋白κ輕鏈輕鏈基因的增強(qiáng)子κB序列（5''''GGGACTTTCC3''''）特異結(jié)合蛋白，并能促進(jìn)κ輕鏈基因的表達(dá)，并將其命名為NFκB（NuclearfactorofkappaB）。后來的研究發(fā)現(xiàn)，NFκB是由各種同源和異源NFκB/Rel蛋白質(zhì)亞基組成的二聚體，正常情況下，NFκB/Rel二聚體與抑制性蛋白質(zhì)IκB的亞基結(jié)合形成三聚體，以無活性形式存在于胞漿內(nèi)［5～7］。許多因素例如IL1、TNFα、LPS、病毒感染、雙鏈RNA和PKC的激活等均可活化NFκB，NFκB被活化后，IκB從NFκB復(fù)合體上脫落，IκB迅速被分解，活化的NFκB進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)特定的靶基因的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，引起相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法對NFκBp65在49例人血管瘤組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測，并結(jié)合PCNA的表達(dá)對血管瘤進(jìn)行比較準(zhǔn)確的分期。另外由于血管瘤組織中細(xì)胞成分較多，本實(shí)驗(yàn)通過檢測第Ⅷ因子相關(guān)抗原的表達(dá)證實(shí)了血管瘤組織中表達(dá)NFκBp65的細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和胞核均有不同程度NFκBp65表達(dá)，退化期血管瘤組織和正常皮膚組織中NFκBp65主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中。而且增生期血管瘤NFκBp65表達(dá)水平高于退化期，差異有顯著性(P＜0.01)；退化期血管瘤NFκBp65表達(dá)水平與正常皮膚組織相比，差異無顯著性(P＞0.05)。NFκBp65在血管瘤增生期的表達(dá)處于較高水平，而在血管瘤的退化期，NFκBp65的表達(dá)降低。國外有研究發(fā)現(xiàn)，用NFκB反義核苷酸能夠抑制TNFα誘導(dǎo)的血管生成，同時(shí)能抑制TNFα介導(dǎo)的堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，提示NFκB對bFGF和VEGF的表達(dá)也存在潛在的調(diào)節(jié)作用。故推測，處于增生期的血管瘤組織中NFκBp65處于活化的狀態(tài)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以及血管瘤的形成。

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