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摘要】本研究觀察激活的供、受者NK細(xì)胞能否減輕骨髓移植后gvhd和增加移植成活率。以C57BL/6小鼠作為供者，將接受6.5Gy60COγ射線全身照射的BALB/c受鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照1組（無(wú)任何處理）、對(duì)照2組（骨髓移植）、實(shí)驗(yàn)1組（骨髓移植同時(shí)輸注激活的受者NK細(xì)胞）和實(shí)驗(yàn)2組（骨髓移植同時(shí)輸注激活的供者NK細(xì)胞），觀察每組小鼠的活存期、嵌合率、GVHD臨床和病理改變。結(jié)果表明：對(duì)照1組全部活存，實(shí)驗(yàn)1組比對(duì)照2組活存期短（P<0.05），實(shí)驗(yàn)2組比對(duì)照2組活存期延長(zhǎng)（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)1組GVHD臨床及病理評(píng)分高于對(duì)照2組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)2組GVHD臨床及病理評(píng)分明顯低于對(duì)照2組（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組嵌合率均較對(duì)照2組高（P<0.05），實(shí)驗(yàn)2組的嵌合率比實(shí)驗(yàn)1組明顯增加（P<0.01）。結(jié)論：激活的供者NK細(xì)胞能延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠的活存期，降低GVHD嚴(yán)重程度，增加移植成活率；而激活的受者NK細(xì)胞卻縮短實(shí)驗(yàn)小鼠的活存期，加重GVHD嚴(yán)重程度。受者NK細(xì)胞也增加移植成活率，但比供者NK細(xì)胞作用小。

【關(guān)鍵詞】骨髓移植;NK細(xì)胞;GVHD;移植成活率

ExperimentalStudyofDonorNaturalKillerCellsReducingGraft-versus-hostDiseaseandEnhancingEngraftment

AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatewhetherpretransplantinfusionofreactivenaturalkillercells（NKcells）fromdonororrecipientcanreducegraft-versus-hostdisease（GVHD）andenhanceengraftmentinbonemarrowtransplantation（BMT）.RecipientBALB/cmiceweredividedinto4groupsafterreceived6.5Gytotal-bodyirradiation(TBI):controlgroup1wastreatedwithnothing,controlgroup2receivedBMTalone,experimentgroup1receivedBMTandautoreactiveNKcells,experimentgroup2receivedBMTandalloreactiveNKcells.Lifespan,clinicalandpathologicchangesofGVHDandchimerismrateofeachgroupwereevaluated.Theresultsshowedthatallmiceweresurvivalincontrolgroup1.Thelifespanwasshorterinexperimentgroup1thanthatincontrolgroup2（P<0.05）andlongerinexperimentgroup2thanthatincontrolgroup2（P<0.01）.GVHDwashigherinscoreofexperimentgroup1thanincontrolgroup2（P<0.05）butlowerinexperimentgroup2thanthatincontrolgroup2（P<0.01）.Thedonorchimerismrateinbothtwoexperimentgroupswerehigherthanthatincontrolgroup2（P<0.05）,however,thedonorchimerismratewashigherinexperimentgroup2thanthatinexperimentgroup1（P<0.01）.ItisconcludedthatpretransplantinfusionofalloreactivedonorNKcellscanprolonglifespan,reducethedegreeofGVHDandenhanceengraftment.ButautoreactiverecipientNKcellscanshortenlifespan,aggravatethedegreeofGVHDandalsoenhanceengraftment,whichisweakerthanthatusingalloreactivedonorNKcells.

Keywordsbonemarrowtransplantation;naturalkillercell;GVHD;engraftment

骨髓移植是目前根治惡性血液腫瘤的主要方法，但其主要致死性并發(fā)癥——移植物抗宿主病（graft-versus-hostdisease,GVHD）卻制約著其應(yīng)用?；仡櫺?a href="http://www.yuanjingfilm.com/lunwen/jiaoyue/yixue/200903/170572.html" target="_blank">研究發(fā)現(xiàn),在骨髓移植中受者體內(nèi)天然殺傷細(xì)胞（naturalkillercells,NK）增加的同時(shí)GVHD發(fā)生率降低，移植成活率增加，復(fù)發(fā)率減少［1］。我們利用動(dòng)物模型分別研究了供、受者來(lái)源的NK細(xì)胞能否減輕GVHD和增加移植成活率，探索NK細(xì)胞在骨髓移植中的應(yīng)用及機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6（H-2b）小鼠作為供者，BALB/c（H-2d）小鼠作為受者，均為雄性，鼠齡8周，體重18-20g，均為清潔級(jí)動(dòng)物（四川大學(xué)華西校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)）。

實(shí)驗(yàn)分組

將接受6.5Gy60COγ射線全身照射的BALB/c受鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照1組（不予以任何處理）、對(duì)照2組（予以骨髓移植）、實(shí)驗(yàn)1組（骨髓移植同時(shí)輸注激活的受者NK細(xì)胞），實(shí)驗(yàn)2組（骨髓移植同時(shí)輸注激活的供者NK細(xì)胞）。每組用10只小鼠觀察生存期和GVHD，用20只小鼠檢測(cè)嵌合率。

NK細(xì)胞分離、純化、檢測(cè)及體外活化

分別取供、受鼠脾臟和骨髓細(xì)胞，用抗CD49b（DX5）MicroBeads（MiltenyiBiotec公司產(chǎn)品）分離NK細(xì)胞，用rhIL-2體外培養(yǎng)及激活，標(biāo)記CD49b抗體（BioLegend公司產(chǎn)品），用流式細(xì)胞儀（Coulter公司產(chǎn)品）檢測(cè)NK細(xì)胞含量。LAC-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞，MTT法檢測(cè)培養(yǎng)后的NK細(xì)胞殺傷活性。

小鼠骨髓移植模型

參照Ruggeri等［2］的方法，各組受鼠在移植前飲用含慶大霉素滅菌水（32×104U/L），移植前1天行亞致死劑量60COγ射線全身照射（TBI6.5Gy）。照射后4小時(shí)在無(wú)菌條件下，用頭皮針沿受鼠鼠尾靜脈輸注含量大于90%、活細(xì)胞數(shù)大于95%、殺傷活性大于90％的NK細(xì)胞（5×105/只）。照射后1天，無(wú)菌條件下摘眼處死供鼠，取股骨，用無(wú)菌培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞沖洗液，溶解紅細(xì)胞后，作為移植的骨髓細(xì)胞。取供鼠脾臟，研磨后用200目篩網(wǎng)制成單個(gè)細(xì)胞懸液，溶解紅細(xì)胞后，作為輸注的供鼠淋巴細(xì)胞。在無(wú)菌條件下，用頭皮針沿受鼠鼠尾靜脈輸注供鼠骨髓細(xì)胞（1×107/只）和供鼠淋巴細(xì)胞（1×107/只）。術(shù)后于二級(jí)動(dòng)物房層流床飼養(yǎng)。

存活期和GVHD臨床表現(xiàn)的觀察

活存超過(guò)30天為長(zhǎng)期活存［3］。移植后，每周稱重1次，觀察小鼠有無(wú)體重下降、腹瀉和脫毛，有無(wú)弓背、聳毛、活動(dòng)度差等精神表現(xiàn)。GVHD臨床評(píng)分（0-10分）由體重下降、活動(dòng)度、姿勢(shì)、聳毛、皮膚潰瘍5項(xiàng)相加組成。體重下降＜10％為0分，下降10％-25％為1分，下降＞25％為2分。無(wú)活動(dòng)度下降、姿勢(shì)異常、聳毛為0分，輕度活動(dòng)度下降、聳毛、姿勢(shì)異常判為1分，重度活動(dòng)度下降、聳毛、姿勢(shì)呈弓背樣改變?yōu)?分。皮膚完整無(wú)脫毛為0分，小片淺潰瘍、輕度潰瘍?yōu)?分，大片潰瘍、脫毛為2分［4］。

GVHD病理學(xué)觀察

對(duì)死亡小鼠及活存超過(guò)30天處死的小鼠，取肝、脾、腸和皮膚組織，用4％的多聚甲醛液固定，石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。GVHD病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（0-10分）：肝臟根據(jù)匯管區(qū)有無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、膽管有無(wú)炎癥、阻塞分為Ⅰ-Ⅴ級(jí)；小腸按有無(wú)隱窩細(xì)胞壞死、粘膜缺失分為Ⅰ-Ⅴ級(jí)［5］。

嵌合體檢查

從死亡小鼠以及移植前和移植后1、2、3、4周各組處死的小鼠中，取出脾臟并研磨，溶解去掉紅細(xì)胞。用FITC連接的供鼠MHCⅠ單克隆抗體（H-Kb抗體）和PE連接的受鼠MHCⅠ單克隆抗體（H-Kd抗體）標(biāo)記，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)嵌合率。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，計(jì)數(shù)資料用百分率（％）表示。用單因素方差分析（one-wayANOVA）對(duì)各組均數(shù)作顯著性檢驗(yàn)，如多組比較有顯著性差異，進(jìn)一步采用Student-Newmen-Keulstest作各樣本之間的兩兩比較。等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)。對(duì)小鼠生存期繪制Kaplan-Meier存活曲線，用時(shí)序檢驗(yàn)和log-ranktest檢驗(yàn)比較生存期及死亡率。

結(jié)果

生存期及死亡率觀察

對(duì)照1組全部存活，對(duì)照2組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組存活期分別為25.6±1.2天、19.4±1.8天和33.7±1.5天，30天死亡率分別為100％、100％和20％。各組Kaplan-Meier生存率曲線見圖1。實(shí)驗(yàn)2組和對(duì)照2組差異顯著（χ2＝13.5，P＝0.0002）。實(shí)驗(yàn)1組和對(duì)照2組差異顯著（χ2＝4.94，P＝0.03）。

GVHD臨床表現(xiàn)

對(duì)照1組沒(méi)有GVHD臨床表現(xiàn)。對(duì)照2組和實(shí)驗(yàn)1組出現(xiàn)明顯GVHD臨床表現(xiàn)：體重下降明顯（下降10％-25％）、活動(dòng)度降低、弓背體位、聳毛、脫毛、腹瀉等現(xiàn)象，評(píng)分分別為7.2±1.3和8.5±1.0分；兩組比較有差異（H值＝-2.09，P＝0.037）。實(shí)驗(yàn)2組GVHD出現(xiàn)晚（25天后才出現(xiàn)）、程度輕，表現(xiàn)為輕度體重下降（下降<10％）、輕度脫毛和弓背體位，活動(dòng)度輕度降低，沒(méi)有腹瀉，評(píng)分3.1±1.2分，與對(duì)照2組比較有顯著差異（H值=-3.766，P=0.0000）（表1）。Table1.ScoredseverityofGVHDmanifestationingroups(略)

GVHD病理表現(xiàn)

對(duì)照1組小鼠肝、脾、腸和皮膚組織均正常。對(duì)照2組和實(shí)驗(yàn)1組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞彌漫性大片壞死，中央靜脈和肝血竇擴(kuò)張、淤血，膽小管增生、淤膽，壞死區(qū)由增生的結(jié)締組織所取代，伴大量枯否氏細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。小腸粘膜層被覆上皮壞死脫落，為一層紅染的壞死組織、變性的白細(xì)胞和纖維素交織成的假膜所覆蓋；粘膜和粘膜下層明顯水腫、充血，伴大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。脾臟萎縮，正常結(jié)構(gòu)破壞，有巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。皮膚結(jié)構(gòu)破壞，局部有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，有纖維細(xì)胞增生。評(píng)分分別7.5±1.1和8.8±1.0分，兩組比較有差異（H值為-2.330，P＝0.020）。實(shí)驗(yàn)2組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整，肝血竇和匯管區(qū)有少量枯否氏細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，中央靜脈輕度淤血。小腸各層結(jié)構(gòu)完整，沒(méi)有壞死脫落，粘膜和粘膜下層伴少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。脾臟結(jié)構(gòu)正常，沒(méi)有巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。皮膚僅見真皮層毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張，未見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。評(píng)分2.5±1.1分，與對(duì)照2組比較差異顯著（H值為-3.808，P＝0.0000）(表2和圖2)。Table2.ScoredseverityofGVHDpathologyfeatureingroups(略)

嵌合體檢查

對(duì)照1組沒(méi)有供者嵌合體，對(duì)照2組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組在第2周供者嵌合率最高，分別為63.2％、81.7％、96.4％，以后逐漸下降，第4周供者嵌合率分別為3.7％、29.4％、52％（P<0.05）（圖3）。

討論

單純照射組全部存活，說(shuō)明我們使用的是亞致死劑量照射，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均能耐受預(yù)處理，其他組小鼠死亡可以排除照射原因。由于沒(méi)有移植供鼠骨髓，單純照射組病理檢測(cè)無(wú)GVHD改變，也沒(méi)有供者嵌合體。我們采用骨髓移植聯(lián)合輸注供鼠淋巴細(xì)胞，在單純骨髓移植組均出現(xiàn)了嚴(yán)重的GVHD臨床和病理改變，構(gòu)建了異基因骨髓移植GVHD模型；由于使用的是亞致死劑量照射預(yù)處理，其嵌合率最高為63.2％，4周時(shí)下降到3.7％，移植物被排斥。該模型被用于進(jìn)一步研究NK細(xì)胞對(duì)GVHD的作用。輸入激活的供者NK細(xì)胞能克服移植物被排斥，使嵌合率高達(dá)96.4％，4周時(shí)保持52％，增加了移植成活率。同時(shí)GVHD并沒(méi)有加重，反而明顯減輕，從7.2分降到3.1分，生存期從25.6天延長(zhǎng)到33.7天，該結(jié)果與國(guó)外研究結(jié)果一致［2］，說(shuō)明激活的供者NK細(xì)胞能延長(zhǎng)生存期，降低GVHD臨床及病理程度，增加嵌合率，為臨床減少GVHD和提高移植成活率提供了切實(shí)可行的新思路和新方法。NK細(xì)胞具有兩種不同的受體，一種是激活NK細(xì)胞殺傷作用的受體（KAR），另一種是抑制NK細(xì)胞殺傷作用的受體（KIR）。如果KIR與其配體MHCⅠ不匹配，NK細(xì)胞將破壞含有這種配體的細(xì)胞［6］。我們使用C57BL/6（H-2b）和BALB/c（H-2d）兩個(gè)不同品系的近交系小鼠，它們的NK細(xì)胞KIR基因和MHCⅠ基因是不同的，供鼠KIR與受鼠MHCⅠ不匹配，供鼠NK細(xì)胞會(huì)殺傷受者細(xì)胞，比如殺傷受者抗原遞呈細(xì)胞等。因?yàn)樽泽wNK細(xì)胞和自身MHCⅠ是匹配的，不會(huì)殺死自身細(xì)胞，所以我們將自體NK細(xì)胞設(shè)為異體NK細(xì)胞的對(duì)照。結(jié)果激活的自體NK細(xì)胞加重GVHD，小鼠死亡時(shí)間從25.6天縮短到19.4天，但嵌合率卻增加，對(duì)此，目前還沒(méi)有類似結(jié)果報(bào)道。這些結(jié)果不能完全用KIR-MHCⅠ的匹配關(guān)系解釋。是否自體NK細(xì)胞激活后其KAR功能和活性發(fā)生了變化，KAR殺傷作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于KIR的抑制作用，誤殺了自身正常組織，從而加重GVHD。有報(bào)道體外NK細(xì)胞能溶解同源性未成熟樹突狀細(xì)胞（iDC）［7］，由于iDC起免疫抑制作用，自體NK細(xì)胞溶解自體iDC，也可以解釋自體NK細(xì)胞加重GVHD。我們的研究結(jié)果顯示，采用供鼠激活的NK細(xì)胞能夠減輕急性GVHD的嚴(yán)重程度，并且促進(jìn)供鼠骨髓植入。其原理可能與供鼠NK細(xì)胞對(duì)受鼠體內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞的殺傷和抑制作用有關(guān)，供鼠NK細(xì)胞在GVHD發(fā)病中對(duì)抗原識(shí)別和細(xì)胞效應(yīng)階段的這種生物調(diào)控作用，值得進(jìn)一步深入研究。

【參考文獻(xiàn)】

1DaviesSM,RuggieriL,DeForT,etal.EvaluationofKIRligandincompatibilityinmismatchedunrelateddonorhematopoietictransplants.Blood,2002;100:3825-3827

2RuggeriL,CapanniM,UrbaniE,etal.Effectivenessofdonornaturalkillercellalloreactivityinmismatchedhematopoietictransplants.Science,2002;295:2097-2100

3段連寧，郭坤元，袁進(jìn)等．同種異基因Th2細(xì)胞移植對(duì)GVHD和GVL效應(yīng)的作用.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2000;8：57-60

4BrysonJS,JenningsCD,LoweryDM,etal.RejectionofanMHCclassIInegativetumorfollowinginductionofmurinesyngeneicgraft-versus-hostdisease.BoneMarrowTransplant,1999;23:363-72

5CookeKR,KobzikL,MartinTR,etal.Anexperimentalmodelofidiopathicpneumoniasyndromeafterbonemarrowtransplantation:I.therolesofminorHantigensandendotoxin.Blood,1996;8:3230-3239

6YoungNT.Immunobiologyofnaturalkillerlymphocytesintransplantation.Transplantation,2004;15,78:1-6

7CooperMA,FehnigerTA,FuchsA,etal.NkcellandDCinteractions.TrendsImmunol,2004;25:47-52.