GVHD移植研究論文

時(shí)間:2022-03-18 01:15:00

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GVHD移植研究論文

摘要】本研究觀察激活的供、受者NK細(xì)胞能否減輕骨髓移植后gvhd和增加移植成活率。以C57BL/6小鼠作為供者,將接受6.5Gy60COγ射線全身照射的BALB/c受鼠隨機(jī)分為4組,對(duì)照1組(無(wú)任何處理)、對(duì)照2組(骨髓移植)、實(shí)驗(yàn)1組(骨髓移植同時(shí)輸注激活的受者NK細(xì)胞)和實(shí)驗(yàn)2組(骨髓移植同時(shí)輸注激活的供者NK細(xì)胞),觀察每組小鼠的活存期、嵌合率、GVHD臨床和病理改變。結(jié)果表明:對(duì)照1組全部活存,實(shí)驗(yàn)1組比對(duì)照2組活存期短(P<0.05),實(shí)驗(yàn)2組比對(duì)照2組活存期延長(zhǎng)(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)1組GVHD臨床及病理評(píng)分高于對(duì)照2組(P<0.05),實(shí)驗(yàn)2組GVHD臨床及病理評(píng)分明顯低于對(duì)照2組(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組嵌合率均較對(duì)照2組高(P<0.05),實(shí)驗(yàn)2組的嵌合率比實(shí)驗(yàn)1組明顯增加(P<0.01)。結(jié)論:激活的供者NK細(xì)胞能延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠的活存期,降低GVHD嚴(yán)重程度,增加移植成活率;而激活的受者NK細(xì)胞卻縮短實(shí)驗(yàn)小鼠的活存期,加重GVHD嚴(yán)重程度。受者NK細(xì)胞也增加移植成活率,但比供者NK細(xì)胞作用小。

【關(guān)鍵詞】骨髓移植;NK細(xì)胞;GVHD;移植成活率

ExperimentalStudyofDonorNaturalKillerCellsReducingGraft-versus-hostDiseaseandEnhancingEngraftment

AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatewhetherpretransplantinfusionofreactivenaturalkillercells(NKcells)fromdonororrecipientcanreducegraft-versus-hostdisease(GVHD)andenhanceengraftmentinbonemarrowtransplantation(BMT).RecipientBALB/cmiceweredividedinto4groupsafterreceived6.5Gytotal-bodyirradiation(TBI):controlgroup1wastreatedwithnothing,controlgroup2receivedBMTalone,experimentgroup1receivedBMTandautoreactiveNKcells,experimentgroup2receivedBMTandalloreactiveNKcells.Lifespan,clinicalandpathologicchangesofGVHDandchimerismrateofeachgroupwereevaluated.Theresultsshowedthatallmiceweresurvivalincontrolgroup1.Thelifespanwasshorterinexperimentgroup1thanthatincontrolgroup2(P<0.05)andlongerinexperimentgroup2thanthatincontrolgroup2(P<0.01).GVHDwashigherinscoreofexperimentgroup1thanincontrolgroup2(P<0.05)butlowerinexperimentgroup2thanthatincontrolgroup2(P<0.01).Thedonorchimerismrateinbothtwoexperimentgroupswerehigherthanthatincontrolgroup2(P<0.05),however,thedonorchimerismratewashigherinexperimentgroup2thanthatinexperimentgroup1(P<0.01).ItisconcludedthatpretransplantinfusionofalloreactivedonorNKcellscanprolonglifespan,reducethedegreeofGVHDandenhanceengraftment.ButautoreactiverecipientNKcellscanshortenlifespan,aggravatethedegreeofGVHDandalsoenhanceengraftment,whichisweakerthanthatusingalloreactivedonorNKcells.

Keywordsbonemarrowtransplantation;naturalkillercell;GVHD;engraftment

骨髓移植是目前根治惡性血液腫瘤的主要方法,但其主要致死性并發(fā)癥——移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease,GVHD)卻制約著其應(yīng)用?;仡櫺?a href="http://www.yuanjingfilm.com/lunwen/jiaoyue/yixue/200903/170572.html" target="_blank">研究發(fā)現(xiàn),在骨髓移植中受者體內(nèi)天然殺傷細(xì)胞(naturalkillercells,NK)增加的同時(shí)GVHD發(fā)生率降低,移植成活率增加,復(fù)發(fā)率減少[1]。我們利用動(dòng)物模型分別研究了供、受者來(lái)源的NK細(xì)胞能否減輕GVHD和增加移植成活率,探索NK細(xì)胞在骨髓移植中的應(yīng)用及機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6(H-2b)小鼠作為供者,BALB/c(H-2d)小鼠作為受者,均為雄性,鼠齡8周,體重18-20g,均為清潔級(jí)動(dòng)物(四川大學(xué)華西校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng))。

實(shí)驗(yàn)分組

將接受6.5Gy60COγ射線全身照射的BALB/c受鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照1組(不予以任何處理)、對(duì)照2組(予以骨髓移植)、實(shí)驗(yàn)1組(骨髓移植同時(shí)輸注激活的受者NK細(xì)胞),實(shí)驗(yàn)2組(骨髓移植同時(shí)輸注激活的供者NK細(xì)胞)。每組用10只小鼠觀察生存期和GVHD,用20只小鼠檢測(cè)嵌合率。

NK細(xì)胞分離、純化、檢測(cè)及體外活化

分別取供、受鼠脾臟和骨髓細(xì)胞,用抗CD49b(DX5)MicroBeads(MiltenyiBiotec公司產(chǎn)品)分離NK細(xì)胞,用rhIL-2體外培養(yǎng)及激活,標(biāo)記CD49b抗體(BioLegend公司產(chǎn)品),用流式細(xì)胞儀(Coulter公司產(chǎn)品)檢測(cè)NK細(xì)胞含量。LAC-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞,MTT法檢測(cè)培養(yǎng)后的NK細(xì)胞殺傷活性。

小鼠骨髓移植模型

參照Ruggeri等[2]的方法,各組受鼠在移植前飲用含慶大霉素滅菌水(32×104U/L),移植前1天行亞致死劑量60COγ射線全身照射(TBI6.5Gy)。照射后4小時(shí)在無(wú)菌條件下,用頭皮針沿受鼠鼠尾靜脈輸注含量大于90%、活細(xì)胞數(shù)大于95%、殺傷活性大于90%的NK細(xì)胞(5×105/只)。照射后1天,無(wú)菌條件下摘眼處死供鼠,取股骨,用無(wú)菌培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,收集細(xì)胞沖洗液,溶解紅細(xì)胞后,作為移植的骨髓細(xì)胞。取供鼠脾臟,研磨后用200目篩網(wǎng)制成單個(gè)細(xì)胞懸液,溶解紅細(xì)胞后,作為輸注的供鼠淋巴細(xì)胞。在無(wú)菌條件下,用頭皮針沿受鼠鼠尾靜脈輸注供鼠骨髓細(xì)胞(1×107/只)和供鼠淋巴細(xì)胞(1×107/只)。術(shù)后于二級(jí)動(dòng)物房層流床飼養(yǎng)。

存活期和GVHD臨床表現(xiàn)的觀察

活存超過(guò)30天為長(zhǎng)期活存[3]。移植后,每周稱重1次,觀察小鼠有無(wú)體重下降、腹瀉和脫毛,有無(wú)弓背、聳毛、活動(dòng)度差等精神表現(xiàn)。GVHD臨床評(píng)分(0-10分)由體重下降、活動(dòng)度、姿勢(shì)、聳毛、皮膚潰瘍5項(xiàng)相加組成。體重下降<10%為0分,下降10%-25%為1分,下降>25%為2分。無(wú)活動(dòng)度下降、姿勢(shì)異常、聳毛為0分,輕度活動(dòng)度下降、聳毛、姿勢(shì)異常判為1分,重度活動(dòng)度下降、聳毛、姿勢(shì)呈弓背樣改變?yōu)?分。皮膚完整無(wú)脫毛為0分,小片淺潰瘍、輕度潰瘍?yōu)?分,大片潰瘍、脫毛為2分[4]。

GVHD病理學(xué)觀察

對(duì)死亡小鼠及活存超過(guò)30天處死的小鼠,取肝、脾、腸和皮膚組織,用4%的多聚甲醛液固定,石蠟切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。GVHD病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(0-10分):肝臟根據(jù)匯管區(qū)有無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、膽管有無(wú)炎癥、阻塞分為Ⅰ-Ⅴ級(jí);小腸按有無(wú)隱窩細(xì)胞壞死、粘膜缺失分為Ⅰ-Ⅴ級(jí)[5]。

嵌合體檢查

從死亡小鼠以及移植前和移植后1、2、3、4周各組處死的小鼠中,取出脾臟并研磨,溶解去掉紅細(xì)胞。用FITC連接的供鼠MHCⅠ單克隆抗體(H-Kb抗體)和PE連接的受鼠MHCⅠ單克隆抗體(H-Kd抗體)標(biāo)記,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)嵌合率。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示,計(jì)數(shù)資料用百分率(%)表示。用單因素方差分析(one-wayANOVA)對(duì)各組均數(shù)作顯著性檢驗(yàn),如多組比較有顯著性差異,進(jìn)一步采用Student-Newmen-Keulstest作各樣本之間的兩兩比較。等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)。對(duì)小鼠生存期繪制Kaplan-Meier存活曲線,用時(shí)序檢驗(yàn)和log-ranktest檢驗(yàn)比較生存期及死亡率。

結(jié)果

生存期及死亡率觀察

對(duì)照1組全部存活,對(duì)照2組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組存活期分別為25.6±1.2天、19.4±1.8天和33.7±1.5天,30天死亡率分別為100%、100%和20%。各組Kaplan-Meier生存率曲線見圖1。實(shí)驗(yàn)2組和對(duì)照2組差異顯著(χ2=13.5,P=0.0002)。實(shí)驗(yàn)1組和對(duì)照2組差異顯著(χ2=4.94,P=0.03)。

GVHD臨床表現(xiàn)

對(duì)照1組沒(méi)有GVHD臨床表現(xiàn)。對(duì)照2組和實(shí)驗(yàn)1組出現(xiàn)明顯GVHD臨床表現(xiàn):體重下降明顯(下降10%-25%)、活動(dòng)度降低、弓背體位、聳毛、脫毛、腹瀉等現(xiàn)象,評(píng)分分別為7.2±1.3和8.5±1.0分;兩組比較有差異(H值=-2.09,P=0.037)。實(shí)驗(yàn)2組GVHD出現(xiàn)晚(25天后才出現(xiàn))、程度輕,表現(xiàn)為輕度體重下降(下降<10%)、輕度脫毛和弓背體位,活動(dòng)度輕度降低,沒(méi)有腹瀉,評(píng)分3.1±1.2分,與對(duì)照2組比較有顯著差異(H值=-3.766,P=0.0000)(表1)。Table1.ScoredseverityofGVHDmanifestationingroups(略)

GVHD病理表現(xiàn)

對(duì)照1組小鼠肝、脾、腸和皮膚組織均正常。對(duì)照2組和實(shí)驗(yàn)1組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)被破壞,肝細(xì)胞索排列紊亂,肝細(xì)胞彌漫性大片壞死,中央靜脈和肝血竇擴(kuò)張、淤血,膽小管增生、淤膽,壞死區(qū)由增生的結(jié)締組織所取代,伴大量枯否氏細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。小腸粘膜層被覆上皮壞死脫落,為一層紅染的壞死組織、變性的白細(xì)胞和纖維素交織成的假膜所覆蓋;粘膜和粘膜下層明顯水腫、充血,伴大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。脾臟萎縮,正常結(jié)構(gòu)破壞,有巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。皮膚結(jié)構(gòu)破壞,局部有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),有纖維細(xì)胞增生。評(píng)分分別7.5±1.1和8.8±1.0分,兩組比較有差異(H值為-2.330,P=0.020)。實(shí)驗(yàn)2組小鼠肝細(xì)胞排列整齊,形態(tài)完整,肝血竇和匯管區(qū)有少量枯否氏細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),中央靜脈輕度淤血。小腸各層結(jié)構(gòu)完整,沒(méi)有壞死脫落,粘膜和粘膜下層伴少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。脾臟結(jié)構(gòu)正常,沒(méi)有巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。皮膚僅見真皮層毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張,未見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。評(píng)分2.5±1.1分,與對(duì)照2組比較差異顯著(H值為-3.808,P=0.0000)(表2和圖2)。Table2.ScoredseverityofGVHDpathologyfeatureingroups(略)

嵌合體檢查

對(duì)照1組沒(méi)有供者嵌合體,對(duì)照2組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組在第2周供者嵌合率最高,分別為63.2%、81.7%、96.4%,以后逐漸下降,第4周供者嵌合率分別為3.7%、29.4%、52%(P<0.05)(圖3)。

討論

單純照射組全部存活,說(shuō)明我們使用的是亞致死劑量照射,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均能耐受預(yù)處理,其他組小鼠死亡可以排除照射原因。由于沒(méi)有移植供鼠骨髓,單純照射組病理檢測(cè)無(wú)GVHD改變,也沒(méi)有供者嵌合體。我們采用骨髓移植聯(lián)合輸注供鼠淋巴細(xì)胞,在單純骨髓移植組均出現(xiàn)了嚴(yán)重的GVHD臨床和病理改變,構(gòu)建了異基因骨髓移植GVHD模型;由于使用的是亞致死劑量照射預(yù)處理,其嵌合率最高為63.2%,4周時(shí)下降到3.7%,移植物被排斥。該模型被用于進(jìn)一步研究NK細(xì)胞對(duì)GVHD的作用。輸入激活的供者NK細(xì)胞能克服移植物被排斥,使嵌合率高達(dá)96.4%,4周時(shí)保持52%,增加了移植成活率。同時(shí)GVHD并沒(méi)有加重,反而明顯減輕,從7.2分降到3.1分,生存期從25.6天延長(zhǎng)到33.7天,該結(jié)果與國(guó)外研究結(jié)果一致[2],說(shuō)明激活的供者NK細(xì)胞能延長(zhǎng)生存期,降低GVHD臨床及病理程度,增加嵌合率,為臨床減少GVHD和提高移植成活率提供了切實(shí)可行的新思路和新方法。NK細(xì)胞具有兩種不同的受體,一種是激活NK細(xì)胞殺傷作用的受體(KAR),另一種是抑制NK細(xì)胞殺傷作用的受體(KIR)。如果KIR與其配體MHCⅠ不匹配,NK細(xì)胞將破壞含有這種配體的細(xì)胞[6]。我們使用C57BL/6(H-2b)和BALB/c(H-2d)兩個(gè)不同品系的近交系小鼠,它們的NK細(xì)胞KIR基因和MHCⅠ基因是不同的,供鼠KIR與受鼠MHCⅠ不匹配,供鼠NK細(xì)胞會(huì)殺傷受者細(xì)胞,比如殺傷受者抗原遞呈細(xì)胞等。因?yàn)樽泽wNK細(xì)胞和自身MHCⅠ是匹配的,不會(huì)殺死自身細(xì)胞,所以我們將自體NK細(xì)胞設(shè)為異體NK細(xì)胞的對(duì)照。結(jié)果激活的自體NK細(xì)胞加重GVHD,小鼠死亡時(shí)間從25.6天縮短到19.4天,但嵌合率卻增加,對(duì)此,目前還沒(méi)有類似結(jié)果報(bào)道。這些結(jié)果不能完全用KIR-MHCⅠ的匹配關(guān)系解釋。是否自體NK細(xì)胞激活后其KAR功能和活性發(fā)生了變化,KAR殺傷作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于KIR的抑制作用,誤殺了自身正常組織,從而加重GVHD。有報(bào)道體外NK細(xì)胞能溶解同源性未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)[7],由于iDC起免疫抑制作用,自體NK細(xì)胞溶解自體iDC,也可以解釋自體NK細(xì)胞加重GVHD。我們的研究結(jié)果顯示,采用供鼠激活的NK細(xì)胞能夠減輕急性GVHD的嚴(yán)重程度,并且促進(jìn)供鼠骨髓植入。其原理可能與供鼠NK細(xì)胞對(duì)受鼠體內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞的殺傷和抑制作用有關(guān),供鼠NK細(xì)胞在GVHD發(fā)病中對(duì)抗原識(shí)別和細(xì)胞效應(yīng)階段的這種生物調(diào)控作用,值得進(jìn)一步深入研究。

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