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【論文關(guān)鍵詞】缺血再灌注；凋亡；丹參；中藥；綜述

【論文摘要】細胞過度凋亡參與了缺血再灌注損傷(Ischimiareperfusioninjury,IRI)的發(fā)生。我國傳統(tǒng)中藥丹參可在細胞、分子、基因水平調(diào)控IRI時細胞凋亡的發(fā)生，從而對IRI具有良好的防治作用。

在肝、腎、腦等器官缺血再灌注損傷(Ischimiareperfusioninjury,IRI)造成的細胞死亡形式中，凋亡也是一種常見而重要的形式[1-4]。組織細胞一旦壞死，目前人們尚無辦法干預；但細胞凋亡是受一系列程序控制的過程，人們有可能通過干預死亡程序加以挽救。丹參經(jīng)現(xiàn)代實驗技術(shù)證實，對IRI時細胞過度凋亡有抑制作用，本文就此方面的內(nèi)容予以綜述。

1丹參對IRI時細胞凋亡的抑制作用

Wu.W等[5]利用原位細胞凋亡標記(terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateduridinenucleotideendlabeling,TUNEL)實驗觀察到：左大腦中動脈結(jié)扎后24h大鼠大腦皮層、尾狀核、豆狀核缺血區(qū)出現(xiàn)大量凋亡細胞，24~48h達到高峰；預先給予丹參則在相應部位只見到少量凋亡細胞；且與對照組比較，24h時間段組織損傷明顯減輕。提示丹參可能通過減少神經(jīng)細胞凋亡對腦IRI發(fā)揮保護作用。丹參是否對其他器官也有類似作用目前尚未明了。

2丹參抑制IRI時細胞凋亡的作用機制

2．1減少蛋白酶表達

細胞發(fā)生凋亡的中心環(huán)節(jié)是激活以蛋白酶-白介素-1轉(zhuǎn)化酶(interleukin-1β-convertingenzyme,ICE)組成的級聯(lián)反應。ICE可在天冬氨酸殘基之后將33KD的IL-1前體裂解為17．5KD的IL-1β，屬于ICE蛋白酶超家族。

目前已發(fā)現(xiàn)13個成員，根據(jù)其序列同源性分為3個亞家族：ICE-樣、ICE-1樣和CPP32樣蛋白酶。它們具有保守的底物結(jié)合和酶促序列，在天冬氨酸后將底物降解，故該酶現(xiàn)被稱為半胱天冬蛋白酶(cysteineapartate-specificproteinase,caspase)，并把上述三個亞家族分別稱為caspase-1、caspase-2和caspase-3亞家族。它們的過度表達將導致細胞凋亡的發(fā)生[6]。

張金濤等[7]利用S-P免疫組化法發(fā)現(xiàn)，前腦IRI后1d，大鼠海馬CA1、CA4區(qū)出現(xiàn)明顯的ICE免疫陽性反應，第3天達高峰，第5天后明顯減少；腦皮質(zhì)也呈現(xiàn)出與海馬區(qū)類似的現(xiàn)象，ICE免疫陽性反應細胞散在分布。與此相反，丹參組ICE的表達明顯減少，特別是大腦皮層區(qū)和海馬CA1區(qū)。因此，作者認為ICE在腦缺血中可能發(fā)揮重要的凋亡調(diào)節(jié)作用；丹參能下調(diào)腦缺血區(qū)ICE表達，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。

2．2阻斷誘導細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導

大多數(shù)情況下，來自于細胞外的誘導因素，如自由基、細菌、病毒等作用于細胞后轉(zhuǎn)化為細胞凋亡信號，并通過胞內(nèi)不同的信號轉(zhuǎn)導途徑最終激活細胞死亡程序，導致細胞凋亡。因此，凋亡信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)是連接凋亡誘導因素與核DN段化斷裂及細胞結(jié)構(gòu)蛋白降解的中間環(huán)節(jié)[6]。丹參經(jīng)實驗證實，可干預下列已知的凋亡相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路，從而實現(xiàn)其抗凋亡作用。

2．2．1死亡因子及其受體介導的信號轉(zhuǎn)導

腫瘤壞死因子(TNF)家族中的TNF、Fas配體、TNF-相關(guān)凋亡誘導性配體(TNF-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL或Apo2L)和Apo3L能誘導細胞凋亡，因此被稱為死亡因子[6]。介導它們誘導凋亡的受體為死亡受體。在體內(nèi)，TNF主要由巨噬細胞(Mφ)分泌。大量體內(nèi)外實驗證明，丹參不僅可有效抑制Mφ分泌TNF-α，還可以在基因水平抑制TNF-α在肝、腎、心等組織中的蛋白表達[8,9,10,18]。所以，丹參可能通過抑制TNF-α的生成和釋放，減少IRI時細胞凋亡。但其具體受體后途徑是抑制NF-κB還是JNF/AP-1則目前尚無文獻報道。

2．2．2第二信使鈣誘導的凋亡

Ca2+是細胞凋亡發(fā)生過程中重要的信息分子。［Ca2+］i持續(xù)升高可使核酸內(nèi)切酶激活，DN段化。應用膜聯(lián)蛋白熒光素(Annexin-V-Fluos)、碘化丙啶(PI)雙標記及流式細胞術(shù)、全細胞膜片鉗放大系統(tǒng)顯微熒光測定術(shù)同步觀察H2O2誘導人類肝細胞(LO2細胞)、內(nèi)皮細胞(EVC304)凋亡時不同時限Ca2+流變化和丹參提取物Rxa的影響時發(fā)現(xiàn)：①H2O2作用后0．5h即出現(xiàn)Ca2+躍升現(xiàn)象；當［Ca2+］i>400nmol/L后1h出現(xiàn)典型的細胞凋亡膜翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象，即磷脂酰絲氨酸從細胞膜內(nèi)層轉(zhuǎn)移到外層；此后，［Ca2+］i持續(xù)升高，早期凋亡細胞(Annexia-V+)、死亡細胞(PI+)指數(shù)均上升；熒光顯微鏡下出現(xiàn)大量綠色熒光的早期凋亡細胞和胞漿或胞核紅染的死亡細胞。同時［Ca2+］i上升了一個數(shù)量級；②在Rax處理組H2O2作用8h后［Ca2+］i尚未超過400nmol/L，與對照組比較差異顯著(P<0．01)。其余各指標也相應降低，細胞凋亡數(shù)減少[11]。這一實驗表明，H2O2誘導的細胞凋亡可能主要是Ca2+依賴性的，且［Ca2+］i>400nmol/L很可能是細胞凋亡啟動的早期信號。Rax有效阻抑了第二信使Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運，由此可能減少其在核內(nèi)促進凋亡基因信號傳遞中的作用及其后引起的細胞凋亡，減輕細胞損傷。分析其機理可能是：①作為咖啡?？s酚酸衍生物之一的Rax富含酚羥基，可和H2O2發(fā)生氧化反應，接受O-生成羧基-COOH，從而直接減輕H2O2對細胞膜及細胞器膜的損傷，減少Ca2+經(jīng)細胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滲漏入細胞內(nèi)；②因肝細胞Ca2+內(nèi)流由鈣-鈣調(diào)蛋白復合物和IP3敏感鈣池共同調(diào)節(jié)。故Rax對LO2極顯著的Ca2+阻滯作用可能是直接作用于鈣-鈣調(diào)節(jié)蛋白受體，阻止受體操縱性鈣通道開放所致[11]。

2．2．3由線粒體損傷后啟動的細胞凋亡新近的研究證實，由活性氧(ROS)、細胞內(nèi)Ca2+超載或缺血缺氧等病理因素也是誘發(fā)細胞凋亡的重要觸發(fā)機制[11,12]。當這些死亡信號到達線粒體后，首先引起線粒體滲透性轉(zhuǎn)換并釋放凋亡相關(guān)蛋白，包括細胞色素C(cyt-C)及caspase-3等，cyt-C而后參與激活凋亡激活因子與caspase-9的結(jié)合及caspase-9的激活，后者繼而激活caspase-3，從而導致細胞凋亡。IRI時ROS生成過多，細胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體受損，誘導細胞過度凋亡[6]。丹參具有強大的清除自由基、減輕鈣超載、保護線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整等作用，因而可切斷上述誘導因素的產(chǎn)生，阻斷了此通路啟動的細胞凋亡[13-15,17]。

2．3調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達

細胞凋亡是級聯(lián)式基因表達的結(jié)果。目前已知細胞凋亡相關(guān)基因多達數(shù)十種，根據(jù)功能不同分為三類：抑制凋亡基因，如EIB、ZAP、Bcl-2，其中對Bcl-2的研究最為詳細而系統(tǒng)；促進凋亡基因，如Fas、Bax、ICE、P53等；雙向調(diào)控基因，如J-myc、Bclk等。正常情況下，促進凋亡基因與抑制凋亡基因處于協(xié)調(diào)的對立統(tǒng)一狀態(tài)，IRI時這種平衡被打破，組織細胞凋亡增多[2]。

張金濤等[7]報道BcL-2在前腦缺血2h就有表達，于6h達高峰，其后減少。此變化以海馬CA1區(qū)最為顯著。說明BcI-2主要在細胞凋亡早期發(fā)揮作用。丹參在缺血30min給予后，BcL-2的表達明顯增加。趙明中等[15]采用心肌IRI模型，以TUNEL及S-P免疫組化法進一步證實復方丹參滴丸不僅可以使BcL-2蛋白的陽性表達數(shù)(PEI)明顯增加，還可使心肌細胞凋亡指數(shù)及Fas蛋白PEI下降。且隨著復方丹參滴丸的劑量加大而進一步降低(P<0．05；P<0．01),說明丹參可恢復各凋亡基因之間的平衡，從而發(fā)揮其保護作用。

綜上所述，丹參作用廣泛，對IRI細胞凋亡各環(huán)節(jié)都有調(diào)節(jié)作用，從細胞、分子及基因水平阻斷了IRI發(fā)生發(fā)展過程中因細胞凋亡引起的一系列“惡性循環(huán)”，從而表現(xiàn)出對IRI顯著的保護作用。因此，丹參對減輕IRI來說是一種十分理想的藥物，在臨床上具有廣闊的應用前景；同時丹參的抗凋亡作用也為臨床上治療因凋亡過度引起的疾病提供了一條新思路。

參考文獻

1冷靜,彭韜,馮振卿,等.大鼠缺血再灌注后腎小管上皮細胞凋亡的研究.江蘇醫(yī)藥,1998，24(12):865.

2趙明中,陳運貞,李媛媛,等.大鼠心肌再灌注時心肌細胞的凋亡、Fas基因表達及缺血預處理對其影響.中華內(nèi)科雜志,1999，38(11):753.

3陳敏，郭仁壽，陳重義，等.腎缺血再灌注損傷中氧自由基與細胞凋亡.實用兒科臨床雜志,1999，14(5):283.

4廖洪軍，陳香美，崔世維，等.缺血性腎損傷中細胞凋亡的初步觀察.中華醫(yī)學雜志,1994，74(10).620.

5WuW,KuangP,LiZ.Protectiveeffectofradixsalviaemiltiorrhizaeonapoptosisofneuronesduringfocalcorebralischemiaandreperfusioninjury.JTraditChinMed,1997，17(3):220.

6吳其文，余應年，盧建.新編病理生理學.中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社,1999:69.

7張金濤,李義召,趙書平,等.腦缺血再灌注后ICE、BcI-2的表達及丹參的神經(jīng)保護作用研究.卒中與神經(jīng)疾病,2001,8(1):26.

8王文俊,吳咸中,姚智,等.大黃素、丹參素對單核細胞分泌炎性細胞因子的調(diào)節(jié).中國免疫學雜志,1995,11(6):370.

9虎曉岷,尹文,梁繼何,等.丹參對創(chuàng)傷性急性肺損傷治療作用的實驗研究.中國危重病急救醫(yī)學,2000,12(9):515.

10王文俊,吳咸中,姚智,等.丹參素對單核I巨噬細胞功能影響的體外實驗.實用中西醫(yī)結(jié)合雜志,1995,8(7):390.

11盧綺平,田磊,吳在德.H2O2誘導人類肝細胞、內(nèi)皮細胞凋亡時Ca2+流變化的對比研究.中華實驗外科雜志,1999,16(2):147.

12ThompsonCB.Apoptosisinthepathogenesisandtreatmentofdisease.science,1995,267:1456.

13閻福嶺,王建平,韓雄,等.兔缺血腦組織病理改變光量子液療的影響.中國急救醫(yī)學,1998,18(5):9.

14中國科學院藥物研究所.中草藥現(xiàn)代研究.北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,1996:509.

15柯示勝,趙振東.鼠缺血心肌細胞跨膜信息傳遞功能及藥物干預的影響.天津醫(yī)學,1996,24(12):715.

16趙明中,王家瑞,魏嘉平,等.復方丹參滴丸對大鼠心肌缺血再灌注時心肌細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達的影響.中國臨床藥理學雜志,1999,15(4):288.

17崔小鵬,李厚祥,等.丹參對大鼠肝細胞凋亡及相關(guān)基因表達的影響.南通醫(yī)學院學報,2004，23(4):410-413.

18羅云，戴立里,等.丹參誘導大鼠肝星狀細胞凋亡作用研究.重慶醫(yī)學,2003，32(12)1701-1702.