溪黃草多糖含量測(cè)定論文
時(shí)間:2022-12-21 05:22:00
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【摘要】目的研究溪黃草多糖含量及其對(duì)羥自由基的清除作用和抑菌作用。方法從溪黃草中提取精制多糖,測(cè)定出溪黃草多糖對(duì)葡萄糖的換算因子,用蒽酮硫酸法比色測(cè)定計(jì)算多糖的含量;采用Fenton反應(yīng)體系為模型,研究多糖對(duì)羥自由基的抑制作用;采用濾紙片法研究多糖的體外抑菌作用。結(jié)果溪黃草多糖含量為4.18%,重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和回收率較好;活性測(cè)試結(jié)果表明溪黃草多糖對(duì)羥自由基有較好的清除作用,對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌有一定的抑菌效果。結(jié)論溪黃草多糖含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單可行,具有一定清除自由基和抑菌活性。
【關(guān)鍵詞】溪黃草;多糖;含量測(cè)定;羥自由基;抑菌作用
Abstract:ObjectiveTostudythecontentofpolysaccharidefromRabdosiaserra(Maxim.)Haraanditseffectonhydroxylfreeradicalandantibacteriostaticeffect.MethodsPolysaccharidewasextractedfromRabdosiaserra(Maxim.)Hara,anditscontentwasmeasuredbywayofanthronesulphuricacid.ItsinhibitoryeffectonhydroxylfreeradicalwasstudiedbyFentonreactionsystemasamodel.Itsantibacteriostaticeffectwasalsostudied.ResultsTheresearchshowedthatpolysaccharidecontentofRabdosiaserra(Maxim.)Harareached4.18%.Ithadinhibitoryeffectonhydroxylfreeradical,staphylococcusaureusandB.subtili.ConclusionThemethodofmeasuringpolysaccharidecontentissimpleandreliable.Thepolysaccharidehassomeactivities.
Keywords:Rabdosiaserra(Maxim.)Hara;Polysaccharide;Contentdetermination;Hydroxylfreeradical;Antibacteriostaticeffect
溪黃草Rabdosiaserra(Maxim.)Hara為唇形科香茶菜屬植物,是一種多年生小草本。具有清熱袪濕、涼血散淤之功效,民間用于治療急性肝炎、急性膽囊炎、跌打淤腫等癥[1]。多糖是一類(lèi)免疫活性物質(zhì),具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲(chóng)、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老等作用[2~5]。目前對(duì)溪黃草多糖的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文建立石油醚去脂80%乙醇去雜熱水提取氯仿、正丁醇去蛋白質(zhì)活性炭去色素乙醇沉淀的提取工藝,從溪黃草中提取多糖,測(cè)得溪黃草多糖對(duì)葡萄糖的換算因子,用蒽酮硫酸比色法測(cè)定并計(jì)算出溪黃草多糖含量,根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件研究了其對(duì)羥自由基的清除作用和體外抑菌作用,期望為肇慶山區(qū)中藥材的綜合開(kāi)發(fā)利用提供一些參考。
1器材
1.1儀器DJ10A傾倒式粉碎機(jī)、A2004N和FA2004N電子天平、RE52AA旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋、低溫冰柜、脂肪抽出裝置、電熱恒溫真空干燥箱、752分光光度計(jì)、UVProbe2550型紫外可見(jiàn)光光度計(jì)、電熱手提壓力蒸氣消毒器、水式熱恒溫培養(yǎng)箱。
1.2材料溪黃草購(gòu)于肇慶中藥材市場(chǎng);大腸桿菌(Escherichiacoil)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Stapphylocacusaureus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、酵母菌(Yeastfungus)均由肇慶學(xué)院生物學(xué)系微生物室提供。(細(xì)菌于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上活化(37℃,24h);霉菌于查氏培養(yǎng)基上活化(28℃,48h);酵母菌于無(wú)菌水中活化(28℃,4h)。
1.3試劑蒽酮、濃硫酸、硫脲、水楊酸、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、無(wú)水乙醇、丙醇、石油醚、乙醚、氯仿、正丁醇等為國(guó)產(chǎn)分析純。
2方法與結(jié)果
2.1溪黃草多糖的提取與精制稱(chēng)取溪黃草粉末60g,置脂肪抽出裝置中,加入石油醚(60~90℃)250ml,回流脫脂。濾渣揮干溶劑后,加入80%乙醇回流提取2次(1.5h/次)。將濾渣揮干溶劑后加蒸餾水400ml,回流提取1h。取濾液,濾渣再加蒸餾水300ml提1次,將兩次所得濾液合并,減壓濃縮至一定體積。加入氯仿正丁醇液(4∶1)輕搖,靜置取多次,除去蛋白質(zhì)。水溶液中加入適量活性碳60℃保溫30min,過(guò)濾,濾液冷卻后加入乙醇,使乙醇濃度達(dá)85%,放置4℃冰箱中過(guò)夜。抽濾,沉淀依次用95%乙醇、丙醇、乙醚各洗3次,真空干燥至恒重,即得精制溪黃草多糖,密封保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2樣品中溪黃草多糖含量測(cè)定
2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.2000g,置100ml容量瓶中,加蒸餾水溶解并稀釋至刻度;搖勻,制成2.000mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后分別移取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。置于10ml容量瓶中,以蒸餾水定容至刻度,搖勻、配成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2.2.2蒽酮
硫酸試液的配制稱(chēng)取0.2000g蒽酮和1.000g硫脲,加入100ml濃硫酸,置于棕色瓶中,混合搖勻至暗處備用(現(xiàn)配現(xiàn)用)。
2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別準(zhǔn)確移取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml于具塞試管中(各平行3份),以1ml蒸餾水作空白,各加入5ml蒽酮試劑(立即搖勻,置冰水浴中),加完后一起沸水浴8min,取出流水冷卻,室溫靜置10min,于620nm處測(cè)定吸光值,以吸光值(A)對(duì)葡萄糖濃度(C)作回歸處理,得回歸方程:A=3.359C-0.01119,r=0.9998。
2.2.4換算因子的測(cè)定精密稱(chēng)取2.1項(xiàng)下所得精制多糖10mg,置100ml容量瓶中,加蒸餾水溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密吸取此液1.0ml置10ml容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度搖勻作貯備液。精密吸取貯備液2.0ml,用標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)的方法測(cè)吸光值,從回歸方程中求出多糖供試液中葡萄糖濃度,按下式計(jì)算,測(cè)得換算因子F=5.364。
換算因子F=w/c×d[w為多糖含量(mg),c為多糖稀釋液中葡萄糖濃度mg/ml,d為多糖的稀釋因素]
2.2.5樣品溶液的制備精密稱(chēng)取溪黃草粉末0.5g(過(guò)60目篩、平行3份)置三角瓶中,加80%乙醇30ml,回流提取1h,趁熱過(guò)濾,殘?jiān)脽嵋掖枷礈欤?ml×3次)。殘?jiān)B同濾紙置三角瓶中,加入40ml蒸餾水回流提取1h,趁熱過(guò)濾,殘?jiān)脽崴礈欤?ml×3次),洗液并入濾液中,置冷后定容于100ml容量瓶中,搖勻備用。
2.2.6樣品中溪黃草多糖含量測(cè)定精密吸取樣品溶液2.0ml同
2.2.3項(xiàng)方法操作,測(cè)定供試液中葡萄糖含量。按下式計(jì)算樣品中多糖的含量:多糖含量(%)=C.D.F/W×100[C為供試液中葡萄糖濃度(mg/ml),D為供試液的稀釋因素,F(xiàn)為換算因子,W為供試樣品重量(mg)]。其結(jié)果見(jiàn)表1。表1溪黃草中多糖含量測(cè)定結(jié)果(略)
2.2.7重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)
精密稱(chēng)取過(guò)60目篩的溪黃草粉末0.5g5份,按2.2.5項(xiàng)方法制取5份樣品溶液。精密吸取樣品液2.0ml,同2.2.3項(xiàng)方法測(cè)定吸光值,計(jì)算其多糖含量。結(jié)果見(jiàn)表2。表2溪黃草多糖含量測(cè)定重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(略)
2.2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取2.2.5項(xiàng)中樣品溶液2.0ml于具塞試管中,按2.2.3項(xiàng)方法測(cè)定吸光值,每隔1h測(cè)定1次,連續(xù)4次考察其穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表3。表3溪黃草多糖穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(略)
2.2.9回收率的測(cè)定精密稱(chēng)取溪黃草粉末0.5g3份,各加入精制多糖20mg,按2.2.5項(xiàng)樣品溶液的制備和2.2.3項(xiàng)方法測(cè)定吸光值。計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表4。表4加樣回收率測(cè)定(略)
2.3溪黃草多糖活性研究
2.3.1溪黃草多糖對(duì)羥自由基的清除作用將2.1項(xiàng)下溪黃草多糖配制成不同濃度的水溶液,采用固定反應(yīng)時(shí)間法,在相同體積的反應(yīng)體系(8.8mmol/LH2O21ml,9mmol/LFe2+1ml,9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1ml)中分別加入一系列不同濃度的多糖液。并以蒸餾水為參比,與試劑空白液比較,在λ=510nm處測(cè)量各濃度下的吸光度。計(jì)算被測(cè)物對(duì)羥自由基的清除作用。結(jié)果見(jiàn)圖1。
清除率(%)=(A0-Ax)/A0×100
2.3.2溪黃草多糖的抑菌作用采用濾紙片法:將濾紙片滅菌、烘干,放到不同濃度的溪黃草多糖水溶液中浸泡2h。將活化好的各供試菌種用無(wú)菌水分別稀釋制成含菌數(shù)約1000cfu/ml菌懸液,于固體培養(yǎng)基上制成含菌平皿,放置10min,待菌液稍滲入培養(yǎng)基后,每個(gè)平皿呈“+”形對(duì)稱(chēng)放置5片圓濾紙片,正中間的濾紙片浸雙蒸水作為參照,其余4片浸多糖水溶液,每個(gè)濃度每種菌平行做4個(gè)樣,每個(gè)皿做3次重復(fù)。然后把培養(yǎng)皿放到培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定各供試菌的抑菌圈直徑大小。結(jié)果見(jiàn)表5。表5溪黃草多糖水溶液的抑菌效果(略)
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基pH為7.0;麥?zhǔn)檄傊囵B(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基pH為自然;表中數(shù)據(jù)為3次(每次4個(gè)樣)重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)的平均值。
3討論
實(shí)驗(yàn)2.1項(xiàng)中醇沉下來(lái)的白色物質(zhì),經(jīng)紫外光譜檢測(cè)在260~280nm處未見(jiàn)到核酸和蛋白質(zhì)的吸收峰;在280nm處吸光值低于0.03,說(shuō)明所提物中基本不含蛋白質(zhì)雜質(zhì)。經(jīng)硫酸苯酚顏色反應(yīng)為棕紅色,與硫酸-蒽酮試劑反應(yīng)呈深綠色,證明所提物質(zhì)為多糖。實(shí)驗(yàn)2.2.5項(xiàng)中首先用80%乙醇回流以除去醇溶性的干擾成分防止其成為多糖中的雜質(zhì),再用水提取多糖成分,提取效果較好。
多糖是中草藥的有效成分之一,而多糖多無(wú)法直接測(cè)定。本文利用多糖在硫酸的作用下水解成單糖分子,并迅速脫水生成糖醛衍生物,然后與蒽酮生成深綠色化合物,以比色法測(cè)定其含量。結(jié)果表明,此方法簡(jiǎn)便,供試液顯色穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。
在羥自由基產(chǎn)生體系中加入多糖溶液時(shí),有色產(chǎn)物的生成量會(huì)隨著多糖濃度的增大而不斷減少,即隨著多糖濃度的增大清除率也增大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溪黃草多糖對(duì)羥自由基有一定清除作用,且與溪黃草多糖的濃度成正相關(guān)性。由于本文所采用的自由基模型體系所產(chǎn)生的自由基濃度遠(yuǎn)大于體內(nèi)該自由基的濃度,可見(jiàn)它是良好的自由基清除劑。
采用濾紙片法研究不同濃度的溪黃草多糖水溶液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、酵母菌和黑曲霉的抑菌作用。從表5中可以看出該多糖水溶液對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌有一定的作用,并且濃度越高抑菌效果越好;5.0%濃度時(shí)對(duì)大腸桿菌有作用,2.5%濃度時(shí)對(duì)面包酵母有作用,5.0%濃度時(shí)對(duì)黑曲霉有作用。
【參考文獻(xiàn)】
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