導(dǎo)語(yǔ)：溪黃草多糖含量測(cè)定論文一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢(xún)客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的研究溪黃草多糖含量及其對(duì)羥自由基的清除作用和抑菌作用。方法從溪黃草中提取精制多糖，測(cè)定出溪黃草多糖對(duì)葡萄糖的換算因子，用蒽酮硫酸法比色測(cè)定計(jì)算多糖的含量；采用Fenton反應(yīng)體系為模型，研究多糖對(duì)羥自由基的抑制作用；采用濾紙片法研究多糖的體外抑菌作用。結(jié)果溪黃草多糖含量為4.18%，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和回收率較好；活性測(cè)試結(jié)果表明溪黃草多糖對(duì)羥自由基有較好的清除作用，對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌有一定的抑菌效果。結(jié)論溪黃草多糖含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單可行，具有一定清除自由基和抑菌活性。

【關(guān)鍵詞】溪黃草；多糖；含量測(cè)定；羥自由基；抑菌作用

Abstract：ObjectiveTostudythecontentofpolysaccharidefromRabdosiaserra(Maxim.)Haraanditseffectonhydroxylfreeradicalandantibacteriostaticeffect.MethodsPolysaccharidewasextractedfromRabdosiaserra(Maxim.)Hara,anditscontentwasmeasuredbywayofanthronesulphuricacid.ItsinhibitoryeffectonhydroxylfreeradicalwasstudiedbyFentonreactionsystemasamodel.Itsantibacteriostaticeffectwasalsostudied.ResultsTheresearchshowedthatpolysaccharidecontentofRabdosiaserra(Maxim.)Harareached4.18%.Ithadinhibitoryeffectonhydroxylfreeradical，staphylococcusaureusandB.subtili.ConclusionThemethodofmeasuringpolysaccharidecontentissimpleandreliable.Thepolysaccharidehassomeactivities.

Keywords：Rabdosiaserra(Maxim.)Hara；Polysaccharide；Contentdetermination;Hydroxylfreeradical；Antibacteriostaticeffect

溪黃草Rabdosiaserra(Maxim.)Hara為唇形科香茶菜屬植物，是一種多年生小草本。具有清熱袪濕、涼血散淤之功效，民間用于治療急性肝炎、急性膽囊炎、跌打淤腫等癥［1］。多糖是一類(lèi)免疫活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲(chóng)、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老等作用［2～5］。目前對(duì)溪黃草多糖的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文建立石油醚去脂80%乙醇去雜熱水提取氯仿、正丁醇去蛋白質(zhì)活性炭去色素乙醇沉淀的提取工藝，從溪黃草中提取多糖，測(cè)得溪黃草多糖對(duì)葡萄糖的換算因子，用蒽酮硫酸比色法測(cè)定并計(jì)算出溪黃草多糖含量，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件研究了其對(duì)羥自由基的清除作用和體外抑菌作用，期望為肇慶山區(qū)中藥材的綜合開(kāi)發(fā)利用提供一些參考。

1器材

1.1儀器DJ10A傾倒式粉碎機(jī)、A2004N和FA2004N電子天平、RE52AA旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋、低溫冰柜、脂肪抽出裝置、電熱恒溫真空干燥箱、752分光光度計(jì)、UVProbe2550型紫外可見(jiàn)光光度計(jì)、電熱手提壓力蒸氣消毒器、水式熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.2材料溪黃草購(gòu)于肇慶中藥材市場(chǎng)；大腸桿菌（Escherichiacoil）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、金黃色葡萄球菌（Stapphylocacusaureus）、黑曲霉（Aspergillusniger）、酵母菌(Yeastfungus)均由肇慶學(xué)院生物學(xué)系微生物室提供。（細(xì)菌于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上活化（37℃，24h）；霉菌于查氏培養(yǎng)基上活化（28℃，48h）；酵母菌于無(wú)菌水中活化（28℃，4h）。

1.3試劑蒽酮、濃硫酸、硫脲、水楊酸、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、無(wú)水乙醇、丙醇、石油醚、乙醚、氯仿、正丁醇等為國(guó)產(chǎn)分析純。

2方法與結(jié)果

2.1溪黃草多糖的提取與精制稱(chēng)取溪黃草粉末60g，置脂肪抽出裝置中，加入石油醚（60～90℃）250ml，回流脫脂。濾渣揮干溶劑后，加入80%乙醇回流提取2次（1.5h/次）。將濾渣揮干溶劑后加蒸餾水400ml，回流提取1h。取濾液，濾渣再加蒸餾水300ml提1次，將兩次所得濾液合并，減壓濃縮至一定體積。加入氯仿正丁醇液（4∶1）輕搖，靜置取多次，除去蛋白質(zhì)。水溶液中加入適量活性碳60℃保溫30min，過(guò)濾，濾液冷卻后加入乙醇，使乙醇濃度達(dá)85%，放置4℃冰箱中過(guò)夜。抽濾，沉淀依次用95%乙醇、丙醇、乙醚各洗3次，真空干燥至恒重，即得精制溪黃草多糖，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2樣品中溪黃草多糖含量測(cè)定

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.2000g，置100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度；搖勻，制成2.000mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。置于10ml容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻、配成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2蒽酮

硫酸試液的配制稱(chēng)取0.2000g蒽酮和1.000g硫脲，加入100ml濃硫酸，置于棕色瓶中，混合搖勻至暗處備用（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別準(zhǔn)確移取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml于具塞試管中（各平行3份），以1ml蒸餾水作空白，各加入5ml蒽酮試劑（立即搖勻，置冰水浴中），加完后一起沸水浴8min，取出流水冷卻，室溫靜置10min，于620nm處測(cè)定吸光值，以吸光值（A）對(duì)葡萄糖濃度（C）作回歸處理，得回歸方程：A=3.359C－0.01119，r=0.9998。

2.2.4換算因子的測(cè)定精密稱(chēng)取2.1項(xiàng)下所得精制多糖10mg，置100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取此液1.0ml置10ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度搖勻作貯備液。精密吸取貯備液2.0ml，用標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)的方法測(cè)吸光值，從回歸方程中求出多糖供試液中葡萄糖濃度，按下式計(jì)算，測(cè)得換算因子F＝5.364。

換算因子F=w/c×d［w為多糖含量（mg），c為多糖稀釋液中葡萄糖濃度mg/ml，d為多糖的稀釋因素］

2.2.5樣品溶液的制備精密稱(chēng)取溪黃草粉末0.5g（過(guò)60目篩、平行3份）置三角瓶中，加80%乙醇30ml，回流提取1h，趁熱過(guò)濾，殘?jiān)脽嵋掖枷礈欤?ml×3次）。殘?jiān)B同濾紙置三角瓶中，加入40ml蒸餾水回流提取1h，趁熱過(guò)濾，殘?jiān)脽崴礈欤?ml×3次），洗液并入濾液中，置冷后定容于100ml容量瓶中，搖勻備用。

2.2.6樣品中溪黃草多糖含量測(cè)定精密吸取樣品溶液2.0ml同

2.2.3項(xiàng)方法操作，測(cè)定供試液中葡萄糖含量。按下式計(jì)算樣品中多糖的含量：多糖含量（%）＝C.D.F/W×100［C為供試液中葡萄糖濃度（mg/ml），D為供試液的稀釋因素，F(xiàn)為換算因子，W為供試樣品重量（mg）］。其結(jié)果見(jiàn)表1。表1溪黃草中多糖含量測(cè)定結(jié)果（略）

2.2.7重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取過(guò)60目篩的溪黃草粉末0.5g5份，按2.2.5項(xiàng)方法制取5份樣品溶液。精密吸取樣品液2.0ml，同2.2.3項(xiàng)方法測(cè)定吸光值，計(jì)算其多糖含量。結(jié)果見(jiàn)表2。表2溪黃草多糖含量測(cè)定重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）

2.2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取2.2.5項(xiàng)中樣品溶液2.0ml于具塞試管中，按2.2.3項(xiàng)方法測(cè)定吸光值，每隔1h測(cè)定1次，連續(xù)4次考察其穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表3。表3溪黃草多糖穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）

2.2.9回收率的測(cè)定精密稱(chēng)取溪黃草粉末0.5g3份，各加入精制多糖20mg，按2.2.5項(xiàng)樣品溶液的制備和2.2.3項(xiàng)方法測(cè)定吸光值。計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。表4加樣回收率測(cè)定（略）

2.3溪黃草多糖活性研究

2.3.1溪黃草多糖對(duì)羥自由基的清除作用將2.1項(xiàng)下溪黃草多糖配制成不同濃度的水溶液，采用固定反應(yīng)時(shí)間法，在相同體積的反應(yīng)體系（8.8mmol/LH2O21ml，9mmol/LFe2+1ml,9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1ml）中分別加入一系列不同濃度的多糖液。并以蒸餾水為參比，與試劑空白液比較，在λ=510nm處測(cè)量各濃度下的吸光度。計(jì)算被測(cè)物對(duì)羥自由基的清除作用。結(jié)果見(jiàn)圖1。

清除率（%）=（A0-Ax）/A0×100

2.3.2溪黃草多糖的抑菌作用采用濾紙片法：將濾紙片滅菌、烘干，放到不同濃度的溪黃草多糖水溶液中浸泡2h。將活化好的各供試菌種用無(wú)菌水分別稀釋制成含菌數(shù)約1000cfu/ml菌懸液，于固體培養(yǎng)基上制成含菌平皿，放置10min，待菌液稍滲入培養(yǎng)基后，每個(gè)平皿呈“+”形對(duì)稱(chēng)放置5片圓濾紙片，正中間的濾紙片浸雙蒸水作為參照，其余4片浸多糖水溶液，每個(gè)濃度每種菌平行做4個(gè)樣，每個(gè)皿做3次重復(fù)。然后把培養(yǎng)皿放到培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定各供試菌的抑菌圈直徑大小。結(jié)果見(jiàn)表5。表5溪黃草多糖水溶液的抑菌效果（略）

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基pH為7.0；麥?zhǔn)檄傊囵B(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基pH為自然；表中數(shù)據(jù)為3次（每次4個(gè)樣）重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

3討論

實(shí)驗(yàn)2.1項(xiàng)中醇沉下來(lái)的白色物質(zhì)，經(jīng)紫外光譜檢測(cè)在260～280nm處未見(jiàn)到核酸和蛋白質(zhì)的吸收峰；在280nm處吸光值低于0.03，說(shuō)明所提物中基本不含蛋白質(zhì)雜質(zhì)。經(jīng)硫酸苯酚顏色反應(yīng)為棕紅色，與硫酸－蒽酮試劑反應(yīng)呈深綠色，證明所提物質(zhì)為多糖。實(shí)驗(yàn)2.2.5項(xiàng)中首先用80%乙醇回流以除去醇溶性的干擾成分防止其成為多糖中的雜質(zhì)，再用水提取多糖成分，提取效果較好。

多糖是中草藥的有效成分之一，而多糖多無(wú)法直接測(cè)定。本文利用多糖在硫酸的作用下水解成單糖分子，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與蒽酮生成深綠色化合物，以比色法測(cè)定其含量。結(jié)果表明，此方法簡(jiǎn)便，供試液顯色穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。

在羥自由基產(chǎn)生體系中加入多糖溶液時(shí)，有色產(chǎn)物的生成量會(huì)隨著多糖濃度的增大而不斷減少，即隨著多糖濃度的增大清除率也增大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溪黃草多糖對(duì)羥自由基有一定清除作用，且與溪黃草多糖的濃度成正相關(guān)性。由于本文所采用的自由基模型體系所產(chǎn)生的自由基濃度遠(yuǎn)大于體內(nèi)該自由基的濃度，可見(jiàn)它是良好的自由基清除劑。

采用濾紙片法研究不同濃度的溪黃草多糖水溶液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、酵母菌和黑曲霉的抑菌作用。從表5中可以看出該多糖水溶液對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌有一定的作用,并且濃度越高抑菌效果越好；5.0%濃度時(shí)對(duì)大腸桿菌有作用，2.5%濃度時(shí)對(duì)面包酵母有作用，5.0%濃度時(shí)對(duì)黑曲霉有作用。

【參考文獻(xiàn)】

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