導(dǎo)語(yǔ)：細(xì)菌快速裂解方法探究論文一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

16S-23SrRNA基因是位于16SrRNA基因和23SrRNA基因之間的區(qū)間序列，具有較好的保守性和相對(duì)的可變性，被認(rèn)為是細(xì)菌鑒定的合適部位［1，2］。我們認(rèn)為能否快速有效地?cái)U(kuò)增該區(qū)間，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增前的標(biāo)本處理是關(guān)鍵。故比較了3種裂解細(xì)菌的方法。

一、材料和方法

1.菌株、人類基因組DNA及病毒株來(lái)源摘要：革蘭陽(yáng)性6個(gè)菌種，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等共19株；革蘭陰性21個(gè)菌種，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、綠膿假單胞菌等共40株。以上菌株由浙江省臨床檢驗(yàn)中心及結(jié)核病防治中心提供，保存于我院細(xì)菌室。人類基因組DNA、新型隱球菌、巨細(xì)胞病毒由本院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

2.臨床標(biāo)本摘要：1999年6月～2000年3月本院新生兒住院患兒，部分為普通病房住院患兒。敗血癥血標(biāo)本42份，腦脊液標(biāo)本6份。對(duì)照組15份，為本院新生兒病房非感染患兒康復(fù)期待出院者的血標(biāo)本。

3.16S-23SrRNA基因區(qū)間序列引物設(shè)計(jì)摘要：在細(xì)菌的16SrRNA基因的3′端及23SrRNA基因的5′端的保守序列內(nèi)，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件查閱自行設(shè)計(jì)引物。

4.臨床標(biāo)本處理摘要：血標(biāo)本摘要：0.5ml的肝素抗凝血置室溫約10min以沉淀血細(xì)胞，在血清和血細(xì)胞的交界面（即白細(xì)胞層）吸取200μl，注入1.5ml滅菌的Eppendorf管中。加入0.87%的NH4Cl1ml，搖勻，放入37℃水浴箱中。15min后，取出，1000r/min離心5min，去上清液，在沉淀物中加NH4Cl1ml，重復(fù)上述步驟2次。最后在沉淀物中加5%Chelex100緩沖液（含0.03%SDS，1%吐溫20，1%NP40）200μl和蛋白酶K2μl（20mg/ml），56℃孵育60min后煮沸15min，稍加離心后，取上清液做PCR擴(kuò)增。

腦脊液標(biāo)本摘要：0.5ml～1ml腦脊液1000r/min離心1min，去上清液，在沉淀物中加5%Chelex100緩沖液200μl和蛋白酶K2μl，56℃孵育60min后再煮沸15min，稍加離心后，取上清液做PCR擴(kuò)增。

二、結(jié)果

1.Chelex100改良裂解法能裂解所探究的所有菌種，且擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清楚，效果滿足。用經(jīng)典的酚氯仿抽提法擴(kuò)增細(xì)菌，效果同Chelex100改良法，但步驟繁瑣［3］。

2.臨床標(biāo)本的裂解摘要：42例新生兒敗血癥血培養(yǎng)15例陽(yáng)性，血標(biāo)本經(jīng)改良Chelex100裂解，PCR擴(kuò)增后27例陽(yáng)性，其陽(yáng)性率明顯高于血培養(yǎng)，差異有顯著性意義（P＜0.01）。血培養(yǎng)陽(yáng)性的15例PCR檢測(cè)均陽(yáng)性，且檢測(cè)結(jié)果和血培養(yǎng)一致。另1組單純用水煮裂解，只有5份陽(yáng)性。6份腦脊液培養(yǎng)2例陽(yáng)性，腦脊液PCR檢測(cè)4例陽(yáng)性，培養(yǎng)陽(yáng)性的2例和PCR結(jié)果相符。15份對(duì)照組血標(biāo)本血培養(yǎng)及PCR檢測(cè)均陰性。

3.敏感性及引物特異性試驗(yàn)摘要：取潘尼變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株放入1ml的ddH2O中，用麥?zhǔn)媳葷岱ù_定起始濃度為108CFU，用ddH2O1∶10定量稀釋，濃度范圍為2.5×104～2.5×10-3CFU，取2μl模板在50μl的PCR體系中擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增下限。Chelex100緩沖液裂解法得PCR的最小檢出量為2.5CFU/ml。本對(duì)引物只能擴(kuò)增細(xì)菌，和人基因組DNA、新型隱球菌、巨細(xì)胞病毒無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明本對(duì)引物擴(kuò)增細(xì)菌16s-23srRNA基因有較好的特異性。

三、討論

本探究首次在Chelex100的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，加上其他一些試劑配成一種適合不同菌種（包括葡萄球菌在內(nèi)）PCR擴(kuò)增的裂解液。并發(fā)現(xiàn)用Chelex100改良法裂解細(xì)菌后所擴(kuò)增的條帶較明亮清楚，效果滿足，可檢測(cè)2.5CFU/ml的細(xì)菌，敏感性比水煮法提高了100倍。用經(jīng)典的酚/氯仿抽提細(xì)菌DNA再行PCR擴(kuò)增，效果和Chelex100改良法相同。但經(jīng)典的方法步驟較繁瑣，DNA經(jīng)常從1管轉(zhuǎn)移到另1管，且還要使用多種試劑，這都增加了PCR污染的可能性。故Chelex100改良裂解法是一簡(jiǎn)便有效的方法，適合于不同菌株的擴(kuò)增。

總之，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床標(biāo)本的初步應(yīng)用，證實(shí)本探究建立的用Chelex100改良法一步擴(kuò)增細(xì)菌的16S-23SrRNA基因區(qū)間具有準(zhǔn)確、敏感、簡(jiǎn)便、快速的特征，若經(jīng)大量臨床標(biāo)本的進(jìn)一步證實(shí)，可成為一理想的診斷技術(shù)。

參考文獻(xiàn)

1，RothA,FischerM,HamidME,etal.Differentiationofphylogeneticallyrelatedslowlygrowingmycobacteriabasedon16S-23SrRNAgeneinternaltranscribedspacersequences.JClinMicrobiol,1998,36摘要:139-147.

2，傅君芬，洪文瀾.16S-23SrRNA區(qū)間序列——一種分型及鑒別細(xì)菌的新方法《國(guó)外醫(yī)學(xué)》流行病.傳染病分冊(cè),1998,25摘要：245-249.

3，尚世強(qiáng)，洪文瀾，俞惠民，等.細(xì)菌DNA的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增及反相雜交初步分型.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,1998,21摘要：281-284.