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1儀器與試藥

1.1儀器精密天平BS224S（德國(guó)塞多利斯）；UV-4501S紫外分光光度計(jì)(天津市港東科技發(fā)展有限公司)；超聲清洗機(jī)SK8210LHC（上?？茖?dǎo)超聲有限公司）。

1.2試藥知母（產(chǎn)地河北，河南，安徽）；芒果苷為對(duì)照品（中國(guó)生物制品檢驗(yàn)所，批號(hào)111607－200301）；乙醇、甲醇均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)條件與方法的建立

2.1.1對(duì)照品的選擇很多文獻(xiàn)報(bào)道中藥制劑中總黃酮的含量測(cè)定多數(shù)采用蘆丁作為對(duì)照品。采用蘆丁作為對(duì)照品，解決了部分中藥或中藥制劑中本身缺少黃酮對(duì)照品的問(wèn)題，在沒(méi)有合適的對(duì)照品情況下，也不失一種測(cè)量總黃酮的可行的方法。芒果苷是知母中含量較高的黃酮類(lèi)化合物，是其清熱作用的有效成分，同時(shí)還具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫抑制、利尿、預(yù)防肥胖等作用。因此，用知母中含量較高且具有抗病毒作用的專(zhuān)屬性活性成分作為對(duì)照品來(lái)測(cè)定知母總黃酮的含量更加有意義。

2.1.2最大吸收波長(zhǎng)的選擇NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法測(cè)定總黃酮的原理［6］，是黃酮母核所含有的游離羥基在NaNO2-Al（NO3）3存在的條件下與金屬鋁離子形成絡(luò)合物而顯色，在波長(zhǎng)500nm左右有最大吸收。本實(shí)驗(yàn)中所用的對(duì)照品是知母中主要黃酮類(lèi)成分芒果苷對(duì)知母總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定。因此將芒果苷溶液及知母總黃酮提取液顯色后在200～400nm處用可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)掃描，知母總黃酮和芒果苷均在258nm有最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖1。故選擇含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)為258nm。

Ⅰ知母總黃酮紫外吸收波譜圖Ⅱ芒果苷的紫外吸收波譜圖

圖1知母總黃酮、芒果苷的最大紫外吸收波譜圖

2.2對(duì)照品溶液的制備取芒果苷適量，于60℃減壓干燥至恒重，精密稱(chēng)定，加70％乙醇溶解，制成每毫升含32μg溶液，即得。

2.3線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液貯備液1，2，5，10，15，25ml，分別置于50ml量瓶中，加70％乙醇稀釋到刻度，搖勻，即得。分別取上述溶液，進(jìn)行測(cè)定，以溶液濃度與吸收度比值進(jìn)行回歸，分別得到回歸方程為：芒果苷：Y=0.2309X-0.0031（r=0.9993），表明芒果苷在0.26～3.57μg/ml，范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，芒果苷線性關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖2芒果苷線性關(guān)系圖

2.4提取方法的選擇

2.4.1回流提取法取知母粗粉1g，精密稱(chēng)定，置100ml圓底燒瓶中，加甲醇80ml，水浴回流提取3h，濾過(guò)，用少量甲醇洗滌藥渣及容器，濾液置于同一100ml量瓶中，放冷，用甲醇補(bǔ)足至刻度，搖勻，取溶液5ml，置于50ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.4.2超聲提取法取知母粗粉1g，精密稱(chēng)定，置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，超聲提取30min，放冷，用甲醇補(bǔ)足至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)液5ml，置于50ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按“2.3項(xiàng)下分別取上述溶液”起，依法操作，測(cè)定各供試品溶液的吸收度。結(jié)果見(jiàn)表1。表1不同提取方法對(duì)知母總黃酮含量的影響

表1表明以上兩種提取方法差別不大，回流提取法方法繁瑣，耗時(shí)，能耗大；而且知母含有較多的黏液質(zhì)，提取液較難過(guò)濾。而超聲提取法的方法更方便、簡(jiǎn)單、快速，易于過(guò)濾。因此,選擇超聲提取法提取知母總黃酮。

2.5提取溶劑的考察按照上述優(yōu)選的方法，分別以甲醇和70％乙醇作為提取溶劑，提取知母總黃酮，并進(jìn)行含量測(cè)定，（見(jiàn)表2）。表2表明甲醇、70％乙醇提取知母總黃酮差別不大，由于甲醇有毒，對(duì)環(huán)境有污染，選擇70％乙醇作為知母總黃酮提取溶劑。表2不同溶劑對(duì)知母總黃酮含量的影響

2.6提取時(shí)間的考察分別取知母粗粉1g，精密稱(chēng)定，置于100ml量瓶中，加70％乙醇，稀釋到刻度，分別超聲20，30，40min，分別按“2.4.2項(xiàng)下放冷處理”起，依法操作,分別制備供試品溶液，并分別測(cè)定（見(jiàn)表3）。表3表明超聲30min，知母總黃酮含量不再提高，因此，選擇超聲提取時(shí)間為30min。

表3超聲時(shí)間對(duì)知母總黃酮的影響

時(shí)間t/min吸收度A202.0076302.1388402.1387

n＝3

2.7供試品溶液的制備按照上述優(yōu)選的工藝參數(shù)制備供試品溶液，取知母粗粉1g，精密稱(chēng)定，置100ml圓底燒瓶中，加70％乙醇至刻度，超聲提取30min，放冷，用70％乙醇補(bǔ)足至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)液5ml，置于50ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.8精密度實(shí)驗(yàn)取“2.7”項(xiàng)下溶液，在258nm波長(zhǎng)下，連續(xù)測(cè)定5次，其吸收度的RSD=0.09％，表明儀器精密度良好。

2.9樣品溶液穩(wěn)定性考查取“2.7”項(xiàng)下溶液，每隔2h測(cè)定1次，測(cè)定5次，其吸收度的RSD=0.09％，表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.10重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取同一批的知母粉末5份，分別按“2.7”項(xiàng)下制備樣品溶液，并按樣品測(cè)定方法，測(cè)定5次，芒果苷含量9.57mg/g，RSD=1.72%，表明樣品重現(xiàn)性良好。

2.11加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知含量的供試品5份，分別精密加芒果苷一定量，依法制備供試品溶液，照含量測(cè)定法測(cè)定，加樣回收率為101.01％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.27%。結(jié)果見(jiàn)表4。表4芒果苷回收率實(shí)驗(yàn)

2.12樣品的測(cè)定按上述方法，對(duì)3個(gè)不同產(chǎn)地知母藥材進(jìn)行了總黃酮的含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表5。表5不同知母總黃酮的含量測(cè)定

從表2可以看出，不同的產(chǎn)地知母總黃酮含量有較大的差異，其功效也必然有一定的差別，河北知母是道地藥材，其功效差別是由于內(nèi)在的化學(xué)成分引起的，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了河北知母的有效成分含量較高。

3討論

在研究知母總黃酮含量測(cè)定方法時(shí)，最初選用蘆丁為對(duì)照品，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不好，而且未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道知母中含有蘆丁。由于知母中黃酮類(lèi)成分較多，同時(shí)芒果苷是知母中含量較高的一種黃酮類(lèi)化合物，且芒果苷紫外吸收波譜圖和知母總黃酮的紫外吸收波譜圖呈現(xiàn)一致性，因此用其作為知母藥材中總黃酮含量測(cè)定的對(duì)照品更有意義，同時(shí)也更能真實(shí)反應(yīng)總黃酮的含量。在知母總黃酮和芒果苷最大紫外吸收波譜圖，二者最大吸收波長(zhǎng)分別在240，258nm呈一致性。原則上，二者均可作為知母總黃酮最大吸收波長(zhǎng)，但是由于波長(zhǎng)越長(zhǎng)，其他雜質(zhì)干擾就越小，故本次最大吸收波長(zhǎng)選定為258nm。在知母總黃酮的提取方法上，還考察了以甲醇為溶劑，索氏提取知母總黃酮，結(jié)果其提取效果和超聲提取相差不大，但是其耗時(shí)、方法也很繁瑣。因此，所選定的知母總黃酮的提取方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可以作為知母總黃酮的提取方法及含量測(cè)定方法。

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【摘要】目的建立知母中總黃酮提取工藝，為知母總黃酮開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。方法對(duì)提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間進(jìn)行研究，采用紫外分光光度法測(cè)定知母中總黃酮含量。結(jié)果知母中總黃酮較佳提取工藝為：70%乙醇超聲提取30min。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可作為知母中總黃酮提取及含量測(cè)定方法。

【關(guān)鍵詞】知母；紫外分光光度法；總黃酮；芒果苷