納米抗體技術(shù)范文
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篇1
Properties and application of single domain antibody fragments
GU Kai1，ZHANG Juan1，ZHANG Cheng-hai2，WANG Min1
（1 China Pharmaceutical University， Nanjing 210009，Jiangsu，China；2.Shanghai CP Guojian，Shanghai 201203，China）
Abstract：Heavy-chain antibody （HCAb） lacking light chain exists naturally in camel. The variable domain of HCAb， the smallest functional antigen-binding fragment is referred to nanobody， which molecular weight is 15kD. They are well expressed and have a high stability and solubility. As a new type antibody in basic research， drug development and disease diagnosis ， nanobody has a broad application prospects. This mini-review offers an overview of its properties and therapeutic.
Key words：Heavy-chain antibody ；Nanobody ；Diagnose ；Therapy
由于在疾病診斷與治療方面的廣泛應(yīng)用，近20年來重組抗體技術(shù)得到迅速的發(fā)展。常規(guī)抗體是由兩條完全相同的重鏈和兩條完全相同的輕鏈組成（圖1a）。通過分子生物學的技術(shù)和手段，將抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接組成各種小分子抗體[1]如ScFv、Diabody（圖1a），不僅保留了完整的抗原結(jié)合部位，而且具有較好的親和力。但是，這些小分子抗體特別是多價形式的小分子抗體的表達很復雜。
駱駝體內(nèi)存在的缺失輕鏈的抗體，只含有重鏈，因此又叫做重鏈抗體（圖1b）。其N端結(jié)構(gòu)域（VHH或者納米抗體）能直接識別結(jié)合特異性抗原。VHH是可結(jié)合抗原的最小功能單位，其相對分子質(zhì)量僅為傳統(tǒng)抗體的1/10左右，大小為15kD，直徑2.2nm，高度4.8nm，又被稱作納米抗體。目前，通過噬菌體，酵母和核糖體展示技術(shù)，從免疫，非免疫和半合成納米抗體庫[2-4]中篩選抗原特異性納米抗體的方法已經(jīng)建立。
圖1 抗體的結(jié)構(gòu)示意圖
1納米抗體的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)
1.1納米抗體的結(jié)構(gòu) 納米抗體只有一個結(jié)構(gòu)域，沒有Fc段，從而避免了Fc段引起的補體反應(yīng)。與常規(guī)抗體的可變區(qū)相似，VHH包含4個框架區(qū)形成基本骨架，3個互補決定區(qū)是抗原結(jié)合的主要部位。與常規(guī)VH相比，VHH框架區(qū)序列的同源性高達80%[5]。
通過序列分析和結(jié)構(gòu)解析，揭示了VHH具有一些獨特的特征。VHH中位于FR2的4個氨基酸[6]（F37、E44、R45、G47）與VH中相同位置的氨基酸不一樣。這幾個在VH中是高度保守的疏水性氨基酸，而在VHH中是親水性氨基酸，增加了VHH的水溶性。與常規(guī)抗體的VH相比，VHH的CDR1可變性更高，CDR3區(qū)更長，形成一個突出的環(huán)，較長的CDR3環(huán)與CDR1或FR2形成一個二硫鍵來穩(wěn)定構(gòu)象[7]。由于VHH只有一個結(jié)構(gòu)域，比常規(guī)抗體小很多，所以在很多方面有廣泛應(yīng)用。
1.2熱穩(wěn)定性 1.3特異性 納米抗體除了可以識別一些常規(guī)的表位外，由于其分子量很小，CDR3區(qū)較長，形成的環(huán)向外延伸，還可以識別常規(guī)抗體無法識別的抗原表位，例如酶的活性位點[10]和一些保守的凹陷的表位[11]。然而，一些半抗原和小分子多肽，通常結(jié)合在VH-VL的縫隙中，很難和VHH結(jié)合。
1.4組織滲透性 納米抗體的分子量很小，很容易從腎小球濾過，導致VHH很快從血漿中清除，使VHH的半衰期很短。另外，VHH有很高的組織滲透作用，VHH很容易偶聯(lián)一些毒素進入細胞內(nèi)，Cortez-Retamozo等[12]利用納米抗體偶聯(lián)毒素物質(zhì)作用于腫瘤細胞，其穿透性好，特異的作用于腫瘤細胞，不會引起其它組織損傷。
1.5表達性 VHH通常在原核系統(tǒng)中表達，氨基酸的差異對表達量有很大的影響。研究發(fā)現(xiàn)有幾種形式的序列與表達量密切相關(guān)。①含有N端糖基化位點的序列，在酵母中的表達量顯著提高[13]。②與常規(guī)VH相似的VHH，在酵母中的表達量會下降。③C端未形成二硫鍵的半胱氨酸會降低VHH表達量[14]。④VHH中一些位于FR2區(qū)域的一些親水性氨基酸能夠顯著增加其在E.coli中的表達量。此外，一些多聚形式的的VHH表達量和單體的表達量相比明顯下降[15]。
2納米抗體的應(yīng)用
目前，對納米抗體的應(yīng)用主要依靠其結(jié)構(gòu)和功能特異性，由于其高的穩(wěn)定性和親和力使得其在許多方面具有廣泛的應(yīng)用。本文主要針對納米抗體在疾病的診斷和治療方面的應(yīng)用進行說明。表1[16]顯示了一些納米抗體在相關(guān)疾病治療方面的應(yīng)用。
2.1構(gòu)建多價和多特異性抗體 VHH分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，易于操作，常用于構(gòu)建多種不同形式的抗體。這些不同形式的抗體在診斷和治療疾病方面具有許多常規(guī)抗體沒有的優(yōu)點：結(jié)合同一個抗原上的鄰近的多個表位，從而提高對該抗原的親和力；可以偶聯(lián)毒性物質(zhì)，如對細胞有毒藥物、放射性物質(zhì)等。
2.2作為細胞內(nèi)抗體 抗體作用于細胞內(nèi)的單位而起作用，對抗體的穩(wěn)定性提出了更高的要求。由于細胞內(nèi)是還原性環(huán)境，不利于二硫鍵的形成，所以需要二硫鍵穩(wěn)定的常規(guī)抗體在在細胞內(nèi)不能穩(wěn)定存在而沒有功能。納米抗體的高穩(wěn)定性，可溶性以及高表達性使其非常適合用作細胞內(nèi)抗體。Gueorguieva等[17]利用噬菌體展示技術(shù)從駝源的納米抗體庫中篩選得到特異性結(jié)合介導細胞凋亡的蛋白Bax的抗體，此抗體能夠在胞漿中穩(wěn)定的存在，與Bax結(jié)合，抑制氧化應(yīng)激誘導的細胞凋亡，可用于神經(jīng)退行性疾病的治療。
2.3用作腫瘤的診斷和治療 抗腫瘤研究存在兩大難題：①早期診斷、②靶向治療。此二者不僅要求藥物在體內(nèi)迅速到達疾病部位，而且要求對正常組織損傷降到最低。目前已有多種抗體藥物可供治療腫瘤。但是因為這些抗體屬于大型蛋白質(zhì)，難以穿透腫瘤細胞；并且他們的復雜結(jié)構(gòu)使得大量生產(chǎn)非常困難且昂貴，因此在治療癌癥方面仍有改善空間。納米抗體遠小于常規(guī)抗體，且保有對腫瘤具專一性的特性；其穩(wěn)定，分子量小，屬水溶性蛋白質(zhì)，使生產(chǎn)更容易且便宜。因此，在腫瘤的診斷與治療方面比其他抗體更具優(yōu)勢。研究表明[18]一種與表皮生長因子競爭的納米抗體，與表皮生長因子受體結(jié)合，以阻礙表皮生長因子與其特異性受體結(jié)合，從而阻斷其信號通路，抑制腫瘤新生血管的形成。
2.4用于神經(jīng)性疾病的治療 藥物透過血腦屏障準確到達疾病發(fā)生部位，是神經(jīng)性疾病治療面臨的一大挑戰(zhàn)。利用納米抗體可有效的解決這一問題，將神經(jīng)性藥物連接到特異的納米抗體，該抗體能將藥物運輸?shù)酱竽X的特定部位，使藥物發(fā)揮療效。納米抗體分子量小，穩(wěn)定性高，組織滲透性強，耐高溫、pH、鹽等特性，使其在這方面的應(yīng)用有很大的優(yōu)越性。Muruganandam等[19]利用噬菌體展示技術(shù)成功篩選出兩個特異性納米抗體FC5和FC44，體外體內(nèi)試驗證明這兩種抗體能有效透過血腦屏障到達靶部位，為納米抗體應(yīng)用于神經(jīng)性疾病的治療奠定了基礎(chǔ)。
最后，納米抗體作為一種新型抗體，具有完整的抗原結(jié)合能力。其分子量小、特異性強、組織滲透性高以及易于表達等優(yōu)越性，使其在抗炎、抗感染及風濕性疾病等方面也具有很大的發(fā)展前景。
3結(jié)論
自1993年重鏈抗體發(fā)現(xiàn)以來，納米抗體已經(jīng)取得了快速的發(fā)展。在應(yīng)用方面VHH具有很多常規(guī)抗體沒有的優(yōu)勢。納米抗體作為最小的具有完整功能的抗原結(jié)合片段，具備親和力高、穩(wěn)定性好、相對分子質(zhì)量小、組織穿透力強、免疫原性低、易于操作等常規(guī)抗體所不具備的優(yōu)越性，在疾病的治療和診斷以及食品檢驗等領(lǐng)域等都有著廣闊的應(yīng)用空間[20]。然而，將納米抗體應(yīng)用于臨床仍有許多問題需要解決，免疫原性是大分子藥物用于臨床治療首要需要解決的問題，而且多價多特異性抗體及融合抗體分子量更大，多劑量重復使用將會產(chǎn)生更強的免疫原性，對治療效果將會產(chǎn)生很大的影響。盡管如此，對于納米抗體作為小分子治療抗體的研究仍會不斷持續(xù)，相信在不久的將來隨著臨床應(yīng)用中各種問題的解決，納米抗體在疾病的診斷和治療中將發(fā)揮巨大功效。
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篇2
【摘要】 采用鏈霉親和素包被磁納米粒子，將生物素標記的特異性抗體偶聯(lián)在磁納米粒子上，制備出高特異性的磁納米探針；利用此探針對人絨毛膜促性腺激素（HCG）進行測定，建立了定量檢測蛋白類激素的化學發(fā)光分析方法。利用紫外可見分光光度計、透射電鏡及動態(tài)光散射儀對磁納米探針進行表征，同時對化學發(fā)光實驗條件進行優(yōu)化。在2×10－4 mol/L魯米諾、8×10－4 mol/L H2O2， pH=13的優(yōu)化條件下，將磁納米探針用于HCG的定量檢測。結(jié)果表明，所測發(fā)光強度與待測HCG濃度之間線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.9924，線性檢測范圍由常規(guī)板式ELISA的5～200 μg/L擴展到0.5～250 μg/L; 相對標準偏差為3.82%。采用本方法和常規(guī)ELISA法同時對34份人血清標本HCG進行測試，兩者相關(guān)性良好。利用制備的磁納米探針定量測定微量蛋白類激素，具有靈敏、高效、快捷、檢測范圍寬等優(yōu)點，有望應(yīng)用于其它微量蛋白的檢測。
【關(guān)鍵詞】 化學發(fā)光免疫分析法， 磁納米探針， 動態(tài)光散射， 人絨毛膜促性腺激素
1 引言
磁納米探針技術(shù)是以免疫學為基礎(chǔ)，利用包被有免疫活性物質(zhì)的各種磁納米粒子進行免疫學或生物學分析的一項技術(shù)[1，2]。在磁納米粒子的表面引接具有生物活性的專一性抗體，可制備得到免疫磁納米探針[3]。該探針因具有比表面積大、可快速移動及單分散性良好等優(yōu)良性能，可在磁場下定位、富集和分離[4]。化學發(fā)光免疫分析法在對免疫物質(zhì)的定性、定量和生物細胞活性功能檢測方面應(yīng)用較為廣泛，常用于超痕量活性物質(zhì)的測定。該方法具有靈敏度高、檢測范圍寬，可實現(xiàn)全自動化等的優(yōu)點。用化學發(fā)光免疫標記物代替放射性同位素，避免了使用放射性同位素的危害，操作方法簡便快速[5]。
人絨毛膜促性腺激素（Human chorionicgonadotropin，HCG）是一種蛋白類激素，絨毛膜癌、葡萄胎等疾病的治療均需對HCG進行定量測定[6]。目前，用于定量檢測HCG的方法有放射免疫法和酶聯(lián)免疫法。放射免疫法具有敏感度高、特異性好等優(yōu)點，但卻存在放射性污染的缺點；酶聯(lián)免疫法不存在放射性污染問題，但靈敏度相對較低， 定量測定范圍較窄[7]。本研究采用磁納米探針檢測微量蛋白類激素，綜合了化學發(fā)光法靈敏度高、線性范圍廣、測定速度快，以及酶聯(lián)免疫法的特異性高、準確性好的優(yōu)點，同時利用磁性微粒在磁場中可控運動的特點，將待測物快速富集，具有更快的檢測速度[8]。此種磁納米探針初步應(yīng)用于臨床標本的檢測，取得了良好的效果。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
F4500熒光光譜儀（日本日立公司）； 123.20D DynaMagSpin磁分離器（挪威Dynal公司）； SI0146 VortexGenie旋渦混合器（美國科技儀器有限公司）； 20/20n化學發(fā)光多功能光度計（美國Promega公司）； UV2250 PC紫外可見分光光度計（日本島津公司)； 802型動態(tài)激光光散色儀（美國Viscotek公司）； ZHWY2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）； J2010透射電子顯微鏡（日本電子公司）; BIOTEK Elx808酶標儀（美國BIOTEK公司）。
人絨毛膜促性腺激素(青島康原藥業(yè)有限公司)；生物素標記的鼠抗αHCG抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化酶（HRP）標記的βHCG抗體（天健生物制藥有限公司）；魯米諾試劑與H2O2（北京禾尚友生物技術(shù)有限公司）；四甲基聯(lián)苯胺(TMB，萬泰生物藥業(yè)）；磁性顆粒（陜西北美基因股份有限公司）；其它試劑均為分析純，實驗用水為二次去離子水。
2.2 實驗方法
2.2.1 磁納米生物探針的制備 取25 μL生物素標記的鼠抗αHCG抗體（3 g/L），加入350 μL PBS緩沖液（pH 7.4），配制成抗體溶液。采用縮合反應(yīng)將鏈霉親和素偶聯(lián)在磁納米粒子上[9～11]，將100 μL鏈霉親和素修飾的磁納米粒子工作液（5 g/L）與該鼠抗αHCG抗體溶液混勻，置于37 ℃，150 r/min 的恒溫搖床中反應(yīng)30 min，利用生物素和鏈霉親和素之間的高親和力將生物素標記的特異性抗體偶聯(lián)在磁性納米粒子上，制備成具有高特異性的磁納米探針。探針洗滌后加入500 μL封閉液（0.05% Proclin 300與10%酪蛋白的TrisHCl緩沖液），在37 ℃，180 r/min恒溫搖床中振蕩30 min后磁性分離。用PBS緩沖液清洗后，加入PBS緩沖液配制成濃度為1 g/L的磁納米探針溶液，置于4 ℃避光保存，備用。
2.2.2 磁納米探針的表征 采用紫外可見分光光度計測定標記前的鼠抗αHCG抗體溶液(Pre)、標記后的上清液(Post)及標記過程中清洗液（Wash）在280 nm處的吸光度，根據(jù)公式（1）計算抗體與磁納米粒子的偶聯(lián)效率（Coupling efficiency， E）。E＝ODpre－ODpost－∑ODwashODpre×100％（1）
移取適量鏈霉親和素修飾的磁納米粒子與磁納米探針于兩個試劑杯中， 分別加入PBS緩沖液稀釋，超聲處理5 min，制備成分散懸浮液，使聚集顆粒分散為原始粒子， 并使原始粒子在分散液中保持良好的分散狀態(tài)。采用動態(tài)光散射儀對磁納米粒子及磁納米探針的有效粒徑及粒徑分布進行測量。同時采用透射電子顯微鏡（TEM）觀測磁納米探針的形貌。
2.2.3 磁納米探針用于HCG濃度的測定 采用雙抗體夾心法，利用制備的磁納米探針對HCG樣品進行定量檢測。將HCG磁納米探針、待測HCG樣品溶液、HRP標記的鼠抗人βHCG抗體置于離心管中，使三者充分混合，然后置于37 ℃搖床反應(yīng)25 min，形成磁納米探針待測HCG抗原酶標抗體的復合物，在磁性分離區(qū)域用PBS緩沖液進行洗滌，并采用單因數(shù)法對化學發(fā)光體系的實驗條件進行優(yōu)化。在優(yōu)化實驗條件下，在上述復合物中加入化學發(fā)光底物液（魯米諾與H2O2），酶催化底物發(fā)光，用20/20n單光子計數(shù)儀檢測光強，通過光強與待測物濃度的對應(yīng)關(guān)系計算樣品中HCG的濃度。
3 結(jié)果與討論
3.1 磁納米探針的表征
采用紫外可見分光光度計在280 nm處測得標記前的鼠抗αHCG抗體溶液吸光度ODpre(280)=1.755、標記后的上清液吸光度ODpost(280)=0.30、 標記過程中清洗液吸光度∑ODwash(280)=0.1752。按照公式（1）計算得抗體偶聯(lián)效率為72.9%，表明生物素標記的αHCG抗體與鏈霉親和素修飾的磁納米粒子具有良好的偶聯(lián)特性，抗體能高效地偶聯(lián)在修飾后的磁納米粒子表面，形成磁納米探針。
圖1 磁納米探針的形貌（略）
Fig.1 TEM image of the magnetic nanoparticle probes
采用透射電子顯微鏡對磁納米探針的形貌特征進行描述。如圖1所示，合成的磁納米探針具有良好的單分散性。
使用激光動態(tài)光散射儀來測定磁納米探針制作前后的平均粒度及粒度分布范圍，結(jié)果分別如圖2a和圖2b所示，實驗數(shù)據(jù)見表1。
圖2 親和素包被磁納米粒子(a)和磁性納米探針（b）的粒徑分布（略）
Fig.2 Size distribution of streptavidinlabeled magnetic nanoparticles(a) and magnetic nanoparticle probes(b)
由圖2a可知，在探針制作前表面修飾鏈霉親和素的磁珠粒徑為1066 nm，粒徑分散度為7.7%。其中存在粒徑為9754 nm的產(chǎn)物，是鏈霉親和素修飾的磁納米顆粒之間的團聚體。這種團聚體會影響良好的磁納米探針的形成，造成檢測誤差。為消除這種團聚，通過添加適量的緩沖液（緩沖液中含有陰離子），并采用超聲分散，使制作的水相中的磁納米探針之間存在靜電排斥力和空間位阻效應(yīng)，以達到較佳的分散效果。磁納米探針的平均粒度及粒度分布范圍如圖2b所示，磁納米探針粒徑為1295 nm，粒徑分散度為8.6%，可見此探針具有較好的粒徑分散度；粒徑為3.52 nm的粒子為游離出的αHCG抗體單體，粒徑為117 nm的粒子為αHCG抗體多聚體或αHCG抗體與鏈霉親和素的聚集體。
表1 親和素包被磁納米粒子與磁納米探針的粒徑與相對顆粒數(shù)分布（略）
Table 1 Distribution of diameters and relative numbers of streptavidinlabeled magnetic nanoparticles and magnetic probes
3.2 化學發(fā)光反應(yīng)的最優(yōu)實驗條件
3.2.1 魯米諾濃度對發(fā)光強度的影響 移取50 μL辣根過氧化酶標記的βHCG抗體（原液濃度為0.66 g/L，用PBS緩沖液按1∶10000稀釋），分別考察了4×10－5～6×10－4 mol/L的魯米諾溶液對體系發(fā)光強度的影響，結(jié)果如圖3a所示。當其它條件不變時，隨著魯米諾濃度增大，體系的化學發(fā)光強度也隨之增大，當其濃度為2×10－4 mol/L時，相對發(fā)光強度達到最大；濃度繼續(xù)升高時，發(fā)光強度開始下降。因此，為保證該體系檢測發(fā)光強度最高，魯米諾濃度選為2×10－4 mol/L。
圖3 魯米諾濃度(a)， H2O2濃度(b)和pH值(c)對相對光強的影響（略）
Fig.3 Effect of luminol concentration(a)， H2O2 concentration(b) and pH(c) on chemiluminescence intensity
a，b. 2×10－4 mol/L H2O2; 0.1 mol/L Tris緩沖液(Buffer solution)， pH=11.83。 c. 2×10－4 mol/L魯米諾(Luminal)；8×10－4 mol/L H2O2； 1.6×10－5 g/L HRPβHCG抗體（Antibody）.
3.2.2 H2O2濃度對光強的影響 移取50 μL辣根過氧化酶標記的βHCG抗體（原液濃度為0.66 g/L，用PBS緩沖液按1∶10000稀釋）， 在魯米諾濃度為2×10－4 mol/L時，考察了H2O2濃度在4×10－5～1×10－3 mol/L范圍內(nèi)對相對光強的影響，如圖3b所示。體系光強隨著H2O2濃度的增大而增強; 當H2O2濃度為8×10－4 mol/L時，H2O2魯米諾體系具有最大的化學發(fā)光強度; 隨著H2O2濃度的繼續(xù)增大，體系發(fā)光強度降低。因此，H2O2最優(yōu)濃度為8×10－4 mol/L。
3.2.3 pH值對光強的影響 魯米諾化學發(fā)光反應(yīng)在堿性條件下進行[12]，輻射出最大發(fā)射波長為425 nm 的化學發(fā)光。因此，采用0.1 mol/L Na2CO3NaHCO3緩沖體系為測定工作液，在反應(yīng)中，通過改變魯米諾溶液中NaOH的濃度來改變反應(yīng)體系的pH值，以提高反應(yīng)體系的靈敏度，進一步考察了上述最優(yōu)濃度配比的H2O2魯米諾體系在pH 8.0～14.0范圍內(nèi)變化時，pH值對H2O2魯米諾體系發(fā)光強度的影響。圖3c表明，若pH8.0時，體系發(fā)光強度隨pH值的增大而緩慢增強；pH =13時體系的發(fā)光強度迅速增到最大；當pH>13時，發(fā)光強度迅速減小。因此，最優(yōu)pH值選擇pH=13。
3.3 樣品測定
3.3.1 干擾實驗 考察與HCG有部分類似結(jié)構(gòu)的不同濃度蛋白類激素對10 μg/L HCG標準品測定的干擾情況。結(jié)果表明，40 μg/L的促甲狀腺激素(TSH)、促黃體生成素(LH)、促卵泡激素（FSH）、雌二醇(E2)對HCG的測定均無影響（RSD＜5%)，證明本磁納米探針特異性強。
3.3.2 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性 利用同批次制備的磁納米探針對6份濃度為10 μg/L HCG標準品進行了重復性實驗，相對標準偏差為3.82%；利用不同批次制備的磁納米探針對6份濃度為10 μg/L HCG標準品進行檢測，相對標準偏差為3.94%，具有良好的重現(xiàn)性和再現(xiàn)性。采用4 ℃避光保存的同一批次制備的磁納米探針，每3 d對同一濃度的HCG標準品進行檢測，24 d內(nèi)測定8次，相對標準偏差為4.02%。結(jié)果表明，本探針在24 d內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，具體有效期仍需進一步研究。
3.3.3 HCG標準曲線測定 在最優(yōu)實驗條件下，依據(jù)檢測體系中待測物濃度與化學發(fā)光強度在一定條件下呈線性關(guān)系的原理[13]，利用制備的磁納米探針，采用化學發(fā)光檢測儀對不同濃度HCG標準品進行測定。結(jié)果表明，HCG濃度在0.5～250 μg/L范圍內(nèi)與相對發(fā)光強度具有良好的線性關(guān)系。其線性方程為y=32.953x+5390.3，相關(guān)系數(shù)r=0.9924。
圖4 磁納米探針分析法與ELISA法相關(guān)性分析散點圖（略）
Fig.4 Scatterplot of correlation analysis between magnetic nanoparticle probe and ELISA
本探針的檢測待測樣品時間少于40 min，具有檢測速度快、特異性高、靈敏度高等特點。
3.3.4 實際樣品測定 采用同批次制備的磁納米探針檢測了34例臨床血清標本（首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院健康體檢人群血清標本），同時采用常規(guī)ELISA方法進行平行檢測。常規(guī)ELISA方法檢測HCG時，首先繪制不同濃度的HCG與ELISA吸光度之間的標準曲線，然后將所測樣品的OD值換算為濃度。兩者結(jié)果經(jīng)線性相關(guān)分析后得散點圖（圖4），結(jié)果顯示，將特異性磁納米探針用于檢測蛋白類激素與常規(guī)ELISA法具有良好的相關(guān)性，線性相關(guān)方程為y=0.9979x+2.4625， 相關(guān)系數(shù)r=0.9743。
本研究建立了一種寬范圍定量檢測蛋白類激素的方法。本方法操作簡單，快速，靈敏度高，無放射性污染，具有應(yīng)用于檢測蛋白質(zhì)類和多肽類抗原的應(yīng)用前景。
參考文獻
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篇3
【關(guān)鍵詞】功能性 納米材料 電化學 免疫傳感器
【Abstract】The immune sensor is based on the close cooperation with the selective immune response and is suitable for the signal conversion technology， to monitor antigen - antibody response of biological sensors， gradually get rapid development and extensive application in many fields. In recent years the electrochemical immunosensor main research direction， in general is to improve the sensitivity， accuracy， selectivity， response time， and this article will use the single-walled carbon nanotubes as electrode， using its good conductivity， high surface area ratio， through the modification of carbon nanotubes wall and pipe end and biological molecular bonding， and keep the activity of biological molecules， the electrochemical immunosensor extremely symbolic significance. This paper combines the specific relevant theories and analysis， the application of functional nano materials in electrochemical immunosensor for research.
【Key words】Functional； Nano materials； Electrochemical； Immunosensor
免疫傳感器的一般工作原理為固定在換能器上的抗體（抗原）對樣品介質(zhì)中的抗原（抗體）進行選擇性免疫識別，并且產(chǎn)生隨分析物濃度的變化而變化的分析信號。在抗體的不同區(qū)域和抗原決定簇之間的高選擇性反應(yīng)主要包括疏水力、靜電作用力、凡德瓦爾力和氫鍵作用力。近年來納米材料在電化學免疫傳感器上的應(yīng)用也發(fā)展得相當迅速。由于納米材料具有表面積大、表面反應(yīng)活性高、表面活性中心多、催化效率高和吸附能力強等優(yōu)異性質(zhì)，將納米微粒應(yīng)用于電化學免疫傳感器中，可以提高傳感器測量的靈敏度、準確性、減少采血量和檢測時間[1]。作為免疫分析技術(shù)的一個重要分支，免疫傳感器除了具有傳統(tǒng)免疫分析方法所共有的性能特點外，還具有高選擇性、高靈敏度、可逆性和劑利用的高效率等優(yōu)點。另外，免疫傳感器大都制備簡單，便于實現(xiàn)自動化、數(shù)字化和微型化，因此可以避免傳統(tǒng)免疫分析方法所附帶的一系列問題，故在臨床分析、環(huán)境分析和生物監(jiān)測過程中顯示了強大的應(yīng)用潛力[2]。因為免疫傳感器常用來測量源于分析物和固定的抗體/抗原之間的反應(yīng)而產(chǎn)生的信號，所以將抗體（抗原）固定在原始換能器表面的固定化過程在免疫傳感器制備中有著重要的作用。大量的固定法已用于各種免疫傳感器，如靜電吸附、包覆法、交聯(lián)法、共價鍵結(jié)合法等。
1 電化學免疫傳感器的工作原理
由于電化學免疫傳感器具有高靈敏度、低成本和便攜等優(yōu)點，成為免疫傳感器中研究最早、種類最多，也較為成熟的一個分支。電化學免疫傳感器的基本工作原理是：采用電化學檢測方法來檢測標記的免疫劑或一些由酶、金屬離子和其它電活性物質(zhì)標記的標記物，從而對疾病診斷或病人狀態(tài)監(jiān)測中復雜系統(tǒng)的多組混合物進行分析提供有力數(shù)據(jù)[3]。用于電化學免疫傳感器檢測中的換能器主要分為電位型、電導型、電容型、阻抗型和安培型等裝置。電位型傳感器現(xiàn)在已經(jīng)被公認為是一種成熟的傳感器，已有大量的商品化產(chǎn)品。對于電位型傳感器，當電流流動為臨界點時，換能器界面處于平衡狀態(tài)，此時電極或者表面修飾膜的電位變化與溶液定金屬離子活性呈對數(shù)比例關(guān)系，這就是電位型換能器的基本工作原理。這類生物傳感器具備制備簡單、操作容易及選擇性良好的優(yōu)點[4]。
2 功能性納米材料技術(shù)
與塊狀物質(zhì)相比，金屬和金屬氧化物納米粒子由于其新穎的材料特性，近年來已被廣泛研究。少于50個金屬原子小團簇可以產(chǎn)生像大分子一樣的效果，但大于300個原子的大團簇表現(xiàn)出大體積樣品的性質(zhì)，介于這兩種極端之間的材料，通常為納米材料，有許多未知的化學和物理性質(zhì)，這也是許多研究一直集中于納米材料的一個原因。納米材料具有依賴于其尺度的光、電和化學性能[5]。納米材料可以應(yīng)用到許多領(lǐng)域，如光學器件、電子器件、催化、感測技術(shù)、生物分子標記等。考慮納米粒子的優(yōu)點，如大面積、高催化性和良好的親和性，如今，多種納米材料已被用來包覆蛋白質(zhì)。常用的有納米碳管（CNTs）、金膠體（Au colloidal）、量子點以及納米二氧化鈦。CNTs自從1991年被發(fā)現(xiàn)以來，引起了一股研究熱潮。納米直徑的圓筒形石墨片狀的CNTs具備高電導率、良好的化學穩(wěn)定性、非常顯著的機械強度和成模性。納米碳管可以與DNA分子自組裝（self-assembly）。根據(jù)理論預測與實驗驗證，DNA/CNTs 層可作為新的電子材料[6]。由于DNA溶液可以膠化，混合的DNA/CNTs層能夠在金屬電極表面保持穩(wěn)定，可以用來研究一些電化學現(xiàn)象或檢測一些蛋白質(zhì)性質(zhì)。此外，帶正電荷的蛋白質(zhì)可被固定在帶大量負電荷的DNA修飾層上。多壁納米碳管與DNA混合后，可成功地固定在鉑電極表面，更進一步的研究表示，細胞色素C可被強吸附在修飾電極表面形成一種近似的單分子層。
納米技術(shù)的快速發(fā)展為納米粒子在生物傳感器和生物分析中的應(yīng)用開拓了新的方向，由于其獨特的物理、化學性質(zhì)，納米粒子引起了納米科學家的極大興趣，這些性質(zhì)使其在化學和生物感測方面具有廣闊的應(yīng)用潛力。近年來，組成和空間結(jié)構(gòu)不同的納米粒子被廣泛應(yīng)用于不同生物分子識別的電學、光學和微量感測中。膠體金（Colloidal gold）和半導體量子點納米粒子在生物分析中應(yīng)用得非常廣泛。通過與生物識別反應(yīng)和納米生物電子的耦合作用，能極大地提高這兩種納米粒子的用途。納米粒子放大標記以及納米粒子-生物分子的自組裝產(chǎn)生極大的信號增強作用，為制造超靈敏的光學和電學檢測奠定了基礎(chǔ)，其靈敏度可與聚合物酶鏈反應(yīng)（PCR）相比[7]。
納米材料獨特的性質(zhì)使其在設(shè)計具有高靈敏度和選擇性的核酸和蛋白質(zhì)檢測方法中具有廣闊的應(yīng)用前景。由于可以制得不同尺寸、組成和形狀的納米材料，調(diào)節(jié)其物理化學性質(zhì)，使其在生物感測和生物分析中得到廣泛的應(yīng)用。由于納米材料的小尺寸效應(yīng)，其性質(zhì)很大程度上受到與其結(jié)合的生物分子影響。近幾年，不同組成的納米粒子作為多種用途、靈敏的標記物被廣泛地應(yīng)用于識別不同生物分子的電子、光學和微天傳感器中。納米粒子放大標記以及納米粒子-生物分子的自組裝產(chǎn)生極大的信號增強作用，這種技術(shù)結(jié)合了納米粒子-生物分子自組裝的放大特性和光學或電化學傳感器的高靈敏性，將多個基于納米材料的放大單元和過程結(jié)合，也能夠設(shè)計出多重放大器，滿足現(xiàn)代生物分析對更高靈敏度的需求[8]。金屬納米粒子獨特的催化性質(zhì)能在其本身或另一種金屬納米粒子的刺激下實現(xiàn)放大信號的功能。也可以通過將大量的能夠產(chǎn)生信號的分子封裝在納米粒子中以提高每個結(jié)合過程標記物的數(shù)量，達到放大信號的目的。這些基于納米材料的生物感測和生物分析方法還能夠與其它的放大技術(shù)結(jié)合。如圖1所示。
3 基于功能性納米粒子的電化學免疫傳感器與應(yīng)用
基于抗體和抗原的特異性反應(yīng)，免疫傳感器為免疫劑的分析提供了一種靈敏的選擇性的方法。在此方法中，免疫材料被固定在傳感器上，通過標記物與其中一種免疫劑的復合物對分析液進行測量[9]。一般是通過測量標記物的特異活性，例如放射性、酶活性、熒光、化學發(fā)光或生物發(fā)光對分析物進行定量。但是每一種標記物都有自己的優(yōu)缺點，含有金屬標記物免疫檢測的金屬免疫檢測，以克服一般的放射性標記，熒光標記和酶標記的缺點。電化學檢測的金屬免疫分析具有以下幾種優(yōu)點：如，檢測液用量少、樣品不用純化、靈敏度好、儀器設(shè)備相對便宜。盡管電化學技術(shù)能夠檢測到nano-mole有機金屬化合物或金屬離子，與能檢測到pico-mole級的熒光檢測方法相比，靈敏度還不夠高。使每個結(jié)合物上含有最大量的金屬標記物的理想方法是使用包含上千個金屬原子的金屬納米粒子。由于其優(yōu)越的氧化還原活性，膠體金是電化學免疫感測和免疫標測標記物的最佳選擇?，F(xiàn)已建立了一種基于金納米粒子循環(huán)累積的新方法，通過陽極溶出技術(shù)檢測人的免疫球蛋白（IgG）[10]。在生物素存在下，脫巰基生物素和親合素的解離反應(yīng)為能夠分析最終定量的金納米粒子的循環(huán)累積提供了有效的路線。陽極峰電流隨著循環(huán)次數(shù)的增加而增大。五個循環(huán)的累積即可滿足該分析方法的需要。這種方法的優(yōu)點就是背景值很低，從而使人IgG的檢測極限可達0.1ng/ml。如圖2、圖3所示。
4 結(jié)語
納米技術(shù)為設(shè)計超靈敏的生物傳感器和生物分析方法提供了很大的機會。納米粒子在生物傳感器放大和生物分子識別具有巨大的潛力及應(yīng)用價值。新的納米粒子感測技術(shù)的超強靈敏度，為常規(guī)方法檢測不到的疾病標記物提供了可行性。這種高靈敏的檢測方法還能夠?qū)崿F(xiàn)疾病的早期診斷或預警。納米粒子標記物在蛋白質(zhì)檢測中的應(yīng)用還處于起步階段。但超靈敏的DNA檢測中的應(yīng)用會為蛋白質(zhì)的檢測提供好的起步。
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篇4
【摘要】 近年來納米材料在各領(lǐng)域已受到人們越來越廣泛的關(guān)注，尤其是核殼型納米顆粒的制備技術(shù)在不斷更新發(fā)展，在生物傳感器方面有著巨大的應(yīng)用前景。本文重點介紹了生物傳感型核殼顆粒的工作原理、制備方法及其在電化學生物傳感器、光學生物傳感器以及壓電晶體生物傳感器上的最新應(yīng)用進展。
【關(guān)鍵詞】 核殼， 納米顆粒， 制備， 生物傳感器， 評述
1 引言
納米技術(shù)是20世紀80年代末崛起的新技術(shù)，在材料、光學、化工、醫(yī)藥、環(huán)境保護等諸多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1]。納米顆粒是指尺寸在1～100 nm之間的粒子，它是由數(shù)目極少的原子或分子組成的原子群或分子群，介于宏觀物質(zhì)和微觀原子與分子中間的領(lǐng)域，是一種典型的介觀系統(tǒng)。其特殊的結(jié)構(gòu)導致它具有許多獨特的性質(zhì)，如表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等。傳感器追求微型化、靈敏度高、響應(yīng)速度快[2]，納米顆粒的特點滿足了這些要求，而核殼結(jié)構(gòu)的納米顆?？梢赃M一步提高納米材料的性能，廣闊的復合空間與納米粒子獨特性能的結(jié)合，使粒子復合技術(shù)成為材料領(lǐng)域的又一亮點。核殼部分可由多種材料組成，包括高分子、無機物和金屬等。包覆在外面的殼層材料可改變顆粒的光、電、磁等物理性質(zhì)，在生物傳感器領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
2 生物傳感型核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒工作原理
核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒具有比表面積大、良好的生物相容性以及電催化性等優(yōu)良的性質(zhì)，在應(yīng)用于生物傳感器時體現(xiàn)了其優(yōu)越的適用性。核殼納米顆粒在生物傳感器應(yīng)用主要有幾種形式：構(gòu)建活性界面用于固定生物材料；作為標記物應(yīng)用于傳感器等。
2.1 構(gòu)建活性界面固定生物材料
核殼顆粒具有保持生物組分活性的性質(zhì)，而且能加快生物分子與電極表面之間的電子轉(zhuǎn)移，可提供固定生物材料的活性界面（如圖1）。圖1中將抗體固定在核殼顆粒上，再與特異性抗原結(jié)合。DNA以及酶等生物分子在檢測等過程中極易失活，而固定在核殼顆粒上，核殼顆粒結(jié)合了不同材料的優(yōu)點，不僅具有良好的生物相容性，保持其生物活性，且比用其中一種材料修飾的檢測信號更強。Feng等[3]將CeO2/殼聚糖組合矩陣首次應(yīng)用于單鏈DNA探針的固定，組成的生物傳感器具有無毒性以及高的電子傳導率，加強了單鏈DNA探針在電極表面的負載，用于結(jié)腸直腸癌基因的檢測。Marcos等[4]在核殼顆粒上固定肽核酸（PNA），特異性地與互補DNA雜交。Tang等[5]用磁性核殼納米顆粒(Fe3O4/SiO2)構(gòu)建界面固定漆酶，構(gòu)造電化學生物傳感器來檢測堆肥中苯磷二酚，核殼顆粒良好地保持了漆酶的活性。Yang等[6]用逐層自組裝的方法制備了碳納米管/殼聚糖復合材料，并將膽固醇氧化酶固定在電極上，設(shè)計了一種用來檢測膽固醇濃度的生物傳感器。納米復合顆粒大幅度提高了固定化酶的催化活性，增加電極的電流響應(yīng)靈敏度，改進生物傳感器的抗干擾性能。
圖1 核殼顆粒作為活性界面（略）
Fig.1 Nanoparticle acts as active interface
在將核殼納米顆粒用于生物傳感器構(gòu)建過程中，關(guān)鍵是如何將生物材料(酶、抗原、抗體、生物組織、細胞、DNA等)穩(wěn)定地、高活性地固定到傳感換能器(基體電極、晶振片、光極等)表面，提高和改善生物傳感器的測定重復性、靈敏度、線性范圍、檢出限及使用壽命等特性。常用于將生物材料固定在傳感換能器表面的主要方法有吸附固定法、包埋法、交聯(lián)法、共價鍵合法及定向固定法等。
2.2 作為標記物應(yīng)用于生物傳感器
對核殼納米粒子作為標記物的檢測方法主要有分光光度法、熒光分析法和電化學分析法。分光光度法是根據(jù)納米粒子標記DNA探針在分子雜交反應(yīng)前后最大吸收波長的變化進行測定。由于納米粒子的激發(fā)光譜寬，且連續(xù)分布，而發(fā)射光譜呈對稱分布且寬度窄，顏色可調(diào)，即不同大小的納米粒子能被單一波長的光激發(fā)而發(fā)出不同顏色的光，并且光穩(wěn)定性高，不易降解，所以可用熒光分析法對納米粒子標記物進行測定。電化學分析法是一種新的檢測納米粒子標記物的方法。由于所用納米粒子多為金屬微?；虬雽w納米材料，根據(jù)組成納米粒子的金屬不同，其相應(yīng)的氧化還原電位也不相同，可以通過對納米粒子標記物中的金屬含量的測定，達到對納米粒子標記物的測定的目的。常用的電化學手段有循環(huán)伏安法、溶出伏安法、差分脈沖伏安法等。
Cai等[7]在殼聚糖修飾的電極上修飾ssDNA，與金納米粒子標記的寡核苷酸探針雜交，加入銀納米的修飾劑，在金表面在線沉積納米銀，得到銀包裹的金納米粒子，利用高靈敏度的微分脈沖伏安法檢測銀，從而使檢測ssDNA的靈敏度提高了2個數(shù)量級，檢出限可達50 pmol/L。Palecek等[8]在DNA 序列的檢測中引入磁性微粒，用磁性微粒標記寡核苷酸作為探針，與待測的DNA分子雜交后，磁場分離雜交分子，利用陰極溶出法進行DNA 的檢測，降低了檢出限。段菁華等[9]采用油包水的反相微乳液方法，首次以羊抗人免疫球蛋白(IgG) 標記的異硫氰酸熒光素(FITC)為核材料，成功地制備了FITC的核殼熒光納米顆粒， 克服了采用傳統(tǒng)方法制備核殼熒光納米顆粒中存在的熒光染料泄露的問題。該核殼熒光納米顆粒比細胞小很多，且具有生物親和性，可為納米生物傳感器件提供新型材料?；谠摵藲晒饧{米顆粒的標記方法也為生物醫(yī)學提供了一種新型的非同位素分析方法。
Cai等[10] 用低溫法制備了一種以Cu為核，Au薄層為殼的核殼型納米粒子，使之易于與ssDNA進行功能性聚合。這種核殼型Cu/Au納米粒子與有5′巰基修飾的ssDNA 偶聯(lián)，制備成納米標記的DNA 探針，待測ssDNA固定在玻碳電極表面。當它與相對應(yīng)的納米Cu/Au核殼型納米粒子標記DNA 探針雜交后形成含有納米標記物的DNA 雜交分子。與金納米探針相比，Cu/Au對DNA的雜交過程所產(chǎn)生的電信號具有明顯的放大作用。Huang等[11]使用CdSe/ZnS核殼量子點作為熒光標記檢測α人類IgE生物素，達到良好的效果，之后又將量子點作為指示劑對尿素進行定量分析[12]。核殼納米顆粒的特殊性質(zhì)使傳感器具有好的適應(yīng)性及高靈敏度。Xu等[13]將抗 單克隆抗體包被功能化的熒光核殼納米顆粒，作為標記物用于夾心熒光免疫檢測中。校準曲線在1.0～75.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限達到0.3 μg/L。
核殼納米顆粒利用其不同于傳統(tǒng)材料的優(yōu)良性質(zhì)，在作為標記物中體現(xiàn)了其特殊的光學性質(zhì)、催化性質(zhì)等，極大提高了生物傳感器的各項性能，提高響應(yīng)靈敏度，提高抗干擾能力。
3 生物傳感型核殼顆粒的制備
3.1 溶膠凝膠法
溶膠凝膠法是合成納米復合顆粒的一種重要方法。在含有聚合物共溶劑體系中，使得烷氧金屬或金屬鹽等前驅(qū)物水解和縮合。如果條件控制得當，在凝膠形成與干燥過程中聚合物不發(fā)生相分離，即可獲得。這種方法具有成本低、工藝簡單、組分易于控制等優(yōu)點。
溶膠凝膠法在半導體/SiO2納米復合材料的制備與結(jié)構(gòu)控制方面具有重要作用，該方法設(shè)備簡單、反應(yīng)溫度低，可制備其它方法難以制備的化合物。Jayasankar等[14]用一種簡單的溶膠凝膠方法合成氧化鋁鈦酸鋁核殼結(jié)構(gòu)。這種方法在控制復合顆粒的粒徑大小、低溫合成及燒結(jié)等方面效果顯著。在氧化鋁基中低溫合成鈦酸鋁歸因于試劑間大的接觸面積。該方法晶粒生長不明顯，且具有很好的增濃作用。
3.2 沉積法
沉積法是指將金屬快速散射于預定的表面上，而聚合物可以直接加熱蒸積到襯底上，也可以是一般單體或聚合物材料經(jīng)高溫熱解產(chǎn)生出可聚合性單體散射于襯底聚合而得，可以與金屬散射同時聚合，也可以先行聚合再處理。
Sathish等[15]通過沉積法合成AuTiO2復合顆粒。如果用CdS 修飾TiO2納米管陣列，反應(yīng)生成的CdS晶粒在襯底上的沉積過程實質(zhì)是一個表面吸附成核的過程。在光滑的薄膜表面上吸附能力較弱，成核密度較低；反之，表面適當粗糙的襯底，卻有較強的活性和吸附能力，成核密度高[16]。Flores等[17]制備了SiO2@Ag核殼納米顆粒，用直徑為(4±2) nm的Ag納米顆粒包覆直徑為(50±10) nm的Si納米微球。在水/乙醇混合液中，原硅酸四乙酯作為硅源，將AgNO3作為Ag的來源而并未加入交聯(lián)劑，在制備過程中，將溶液中的Ag+轉(zhuǎn)化為Ag納米顆粒沉積在Si微球表面，形成了均一的核殼結(jié)構(gòu)納米微球。Shishkanova等[18]將聚苯胺沉積在聚乙烯表面，用來控制聚合膜的厚度。在聚N乙烯吡咯烷酮存在的條件下，苯胺的氧化是在分散態(tài)下進行的。
3.3 原位聚合法
原位聚合法也稱就地聚合。即在柔性聚合物或其單體中溶有剛性聚合物單體后，再就地聚合，生成的剛性聚合物分子均勻地分散在柔性聚合物基體中，從而形成分子復合材料。原位聚合在很大程度上提高了納米粒子在聚合物基體中的分散性，提高了聚合物復合材料的力學性能。
在合成核殼顆粒過程中，殼層的交聯(lián)劑含量對粒子的尺寸的影響很大。任現(xiàn)文等[19]用原位聚合法成功地制備出不同響應(yīng)溫度的溫敏性聚乳酸/聚異丙基丙烯酰胺co丙烯酰胺核殼膠束。實驗中當交聯(lián)劑的摩爾分數(shù)從5%提高到15%時，粒子在25 ℃下的流體力學直徑從170.2 nm增加到886.5 nm。Liu等[20]用原位聚合法合成了SiO2/聚吡咯核殼顆粒，聚吡咯微球的殼厚度是可以控制的。Jing等[21]采用原位化學氧化聚合法合成了Ag/聚苯胺的核殼結(jié)構(gòu)。Liu等[22]用原位氧化聚合法合成了 @聚苯胺（ATP@PANI）核殼顆粒，并研究了HCl濃度的影響以及ATP@PANI復合顆粒的導電性能。核殼顆粒的殼厚度很容易通過過程參數(shù)來控制，如單體濃度和熱水溫度等。Luo等[23]等將聚苯胺原位聚合到Si納米顆粒上，形成核殼結(jié)構(gòu)，更容易吸附辣根過氧化物酶，同時也增大了活性電極表面積。
3.4 自組裝技術(shù)
自組裝是指組裝單元通過非共價鍵作用自發(fā)形成熱力學穩(wěn)定且具有明確有序結(jié)構(gòu)的聚集體的過程，自組裝技術(shù)制備的核殼式微球，其殼層形成的驅(qū)動力是中心粒子和殼層間所帶的相異電荷，或是相鄰殼層間相異電荷的靜電引力，實現(xiàn)物理吸附。也可以引發(fā)層間的化學反應(yīng)產(chǎn)生交聯(lián)，提高了殼層的穩(wěn)定性。
宋秀芹等[24]采用逐層自組裝方法在二氧化硅球表面交替組裝了十二烷基硫酸鈉單分子膜和TiO2納米粒子膜，該復合多層膜經(jīng)高溫煅燒得到了核殼型納米結(jié)構(gòu)TiO2/SiO2復合顆粒。利用X射線、掃描電鏡、X射線能譜等對復合顆粒進行了表征。結(jié)果表明：TiO2在復合顆粒表面排列緊密、均勻，粒徑約50 nm，復合顆粒中TiO2的含量隨組裝層數(shù)的增加而均勻增加。Au/C[25]， CdS/聚電解質(zhì)[26]等核殼顆粒都可通過自組裝方式合成。Bizdoaca等[27]用自組裝的方法合成核殼顆粒，由640 nm直徑聚苯乙烯微球核以及5層12 nm直徑Fe3O4納米晶體組成。Yang等[28]通過層層自組裝技術(shù)合成生物功能化的熒光微球，用于免疫檢測分析。首先將多層熒光標記的聚電解質(zhì)覆蓋在膠體顆粒上，再包覆上蛋白質(zhì)層，實驗結(jié)果顯示其具有很好的效果。Chen等[29]制備了以聚苯乙烯為核，將4乙烯基吡啶/Au自組裝在核表面形成核殼結(jié)構(gòu)，表面組合顆粒具有更高的催化活性和接觸反應(yīng)效率。Wang等[30]采用層層自組裝技術(shù)形成AuC@SiO2復合物并構(gòu)造H2O2生物傳感器。
4 核殼顆粒在生物傳感器的應(yīng)用
4.1 核殼顆粒在電化學傳感器中的應(yīng)用
電化學生物傳感器是以酶、微生物、抗原或抗體、細胞、動植物組織為敏感膜，以將生物量轉(zhuǎn)換為電信號的電化學電極為轉(zhuǎn)換器的裝置。圖2為原理流程圖，首先通過吸附沉積等作用形成核殼顆粒，在電極表面修飾化學基團，利用化學基團與核殼顆粒的作用將核殼顆粒固定，再在顆粒表面連接生物分子，用于電化學檢測。
Cai等[7]研究的金銀復合納米粒子在DNA 檢測中使靈敏度較一般的單個納米粒子標記的DNA 探針提高了2個數(shù)量級。Liu等[31]將絡(luò)氨酸酶修飾的磁性核殼顆粒MgFe2O4SiO2利用磁力固定在碳糊電極上，構(gòu)造苯酚生物傳感器，采用循環(huán)伏安法等電化學手段對苯酚進行檢測。Wang等[32]將Si@Au核殼顆粒（GNSs）通過自組裝技術(shù)，固定在丙基三甲氧基硅烷（APTES）修飾的氧化銦錫（ITO）電極表面，形成GNSs/APTES/ITO電極。核殼顆粒能提供大的表面積以及具有良好的導電性，促進血色素與電極間的直接電子轉(zhuǎn)移。此外，還據(jù)此構(gòu)筑了高效的H2O2生物傳感器。Zhang等[33]利用Fe3O4/SiO2核殼磁性納米顆粒修飾碳糊電極并用于檢測對苯二酚。Qiu等[34]利用二茂鐵修飾的磁性核殼Fe3O4/SiO2納米顆粒合成新型的葡萄糖生物傳感器，獲得的磁性生物納米顆粒連接到碳糊電極表面，并作為酶與電極之間電子轉(zhuǎn)移的媒介。此生物傳感器可以在1.0×10－5～4.0×10－3mol/L線性范圍內(nèi)檢測葡萄糖。Yan等[35]合成銀聚苯胺核殼復合物，構(gòu)造生物傳感器，在中性環(huán)境中有很好的電化學行為，并對抗壞血酸維生素C的氧化有抑制作用，能在抗壞血酸維生素C濃度為多巴胺5000倍的情況下檢測多巴胺。
圖2 核殼顆粒應(yīng)用于電化學生物傳感器的原理流程圖（略）
Fig.2 Principle flow chart of core/shell nanoparticles applied in electrochemical biosensor
4.2 核殼顆粒在光生物傳感器中的應(yīng)用
光生物傳感器選擇性地識別分子信息，引發(fā)光學變化，且把光學變化轉(zhuǎn)換為電信號輸出?？衫玫墓鈱W信號很多，包括光吸收、熒光、表面等離子體共振等。光生物傳感器具有靈敏度高、不需要參比、光傳播信號不受外界電磁干擾等特點。圖3為核殼顆粒應(yīng)用于光生物傳感器的原理圖，首先在平板表面組裝上底層，再將作為核的納米顆粒連接在底層上，并在顆粒外覆蓋殼層，利用其特殊光學性質(zhì)進行檢測。
圖3 核殼顆粒應(yīng)用于光生物傳感器的原理流程圖
Fig.3 Principle flow chart of core/shell nanoparticles applied in optical biosensor
Endo等[36]發(fā)展了基于表面等離子體共振生物傳感器的新型非標記細胞檢測方法。他們使用核殼納米顆粒作為層基片，通過固定在傳感器表面的抗體和抗原的特異性反應(yīng)而產(chǎn)生的折射率變化，檢測細胞代謝物。在此表面等離子體生物傳感器中，通過光學性質(zhì)的檢測來判斷抗體與細胞代謝物之間的特異性反應(yīng)，固定在傳感器上的抗體的檢出限為10 ng/L。
Huang等[37]由傳統(tǒng)的金納米棒與Na2S2O3或 Na2S反應(yīng)生成一類蟲狀的新型金納米棒。這種金金硫化物核殼結(jié)構(gòu)的金納米棒的靈敏度比傳統(tǒng)的納米棒高，這種特性使金納米棒在生物傳感器構(gòu)造以及生物分子識別研究中有廣泛的應(yīng)用前景。核殼顆粒的特殊光學性質(zhì)，可將其用于光吸收。Enders等[38]通過表面增強紅外吸收（SEIRA）來檢測抗體抗原的特異性反應(yīng)。SEIRA膜是將金納米顆粒沉積到SiO2/Si晶片表面得來的。在將特異性抗體固定到金納米顆粒上后，樣品暴露在特異性抗原中，然后采用紅外光譜檢測樣品。
4.3 核殼顆粒在壓電晶體生物傳感器中的應(yīng)用
壓電生物傳感器是一種將高靈敏的壓電傳感器技術(shù)與特異的生物反應(yīng)結(jié)合，通過換能器將生物信號轉(zhuǎn)化為易于定性或定量檢測的物理或化學信號的新型生物檢測分析方法。壓電晶體具有高度靈敏性的質(zhì)量響應(yīng)特征，其頻率變化與結(jié)合在其上的物質(zhì)質(zhì)量相關(guān)。顯然，具有生物親和性質(zhì)的組分檢測，可以構(gòu)建壓電傳感器。
高效地將免疫活性材料固定到傳感表面是設(shè)計生物傳感器的關(guān)鍵步驟。Ding等[39]通過將金納米顆粒自組裝到納米級的羥基磷灰石上，來設(shè)計壓電免疫傳感器的界面，通過檢測α胎蛋白抗原抗體系統(tǒng)來研究此傳感器的性能，并將此種免疫傳感器的免疫反應(yīng)與抗體單獨固定在羥基磷灰石或納米金上的進行比較。實驗發(fā)現(xiàn)，用此種傳感器的傳感界面，抗原抗體活性更高?？梢栽?5.3～600.0 μg/L范圍內(nèi)對胎蛋白進行檢測。Jia等[40]將細胞連接到殼聚糖/多壁碳納米管修飾的金電極上，使用壓電石英晶體微量天平來控制，這種組合物的化學性質(zhì)以及形態(tài)學都用掃描電極以及紅外光譜表征。實驗顯示這種納米組合物與細胞有更好的生物相容性。5 展 望
核殼結(jié)構(gòu)的納米復合粒子由于其特殊的結(jié)構(gòu)具有許多優(yōu)異的性質(zhì)，不同于單一的材料，往往具備核層和殼層材料的性能，有著新的光學、電化學以及光電轉(zhuǎn)換等特性，一直是研究的熱點。以前的研究主要集中在核殼聚合物粒子領(lǐng)域，現(xiàn)在的研究深入到內(nèi)核或外殼為聚合物、氧化物、貴金屬等，而且核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒的組成、形貌和表面性質(zhì)是可調(diào)的，有著重要而廣闊的應(yīng)用前景。生物傳感器在免疫學、醫(yī)學、食品等領(lǐng)域都有著普遍應(yīng)用，而且已被成功應(yīng)用于環(huán)境中痕量有害物質(zhì)的分析與檢測[41]。生物傳感型的核殼粒子作為一種新型的復合材料，它必將受到人們越來越多的重視。如量子點納米顆粒由于其量子尺寸效應(yīng)，大小不同或組成材料不同即可發(fā)不同顏色的熒光，而且可用單一波長的光激發(fā)多種顏色不同的量子點，更適合現(xiàn)今生物大分子的分析檢測，近年來被廣泛用于生物學標記。生物可降解納米顆粒的研究也受到越來越多的重視，它們包裹活性物質(zhì)，使其與周圍介質(zhì)相隔離以避免過快降解，并能在需要時釋放活性物質(zhì)。將核殼納米顆粒應(yīng)用于生物傳感器的檢測，提高了傳感器的性能，使其可檢測的目標物濃度越來越低，使生物傳感器的研究更加深入。但是，部分核殼材料的形成機理及核與殼材料的協(xié)同作用機理尚不明確，而且許多制備工藝也完善，制得的納米復合材料的性能往往無法與期望的完全符合。因此，為了使核殼型納米復合材料得到更廣泛的推廣應(yīng)用， 還需要大量深入的研究。
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篇5
納米技術(shù)的定義是指一些設(shè)備，本身或其關(guān)鍵部分是人工的，至少在某個方向上是1~100nm范圍。與癌癥相關(guān)的納米技術(shù)設(shè)備可以是攜帶靶向性治療藥物的納米載體；生物靶向性的納米造影劑；也可以是高度特異檢測DNA和蛋白質(zhì)的納米粒子和納米設(shè)備，將在腫瘤的診斷、治療領(lǐng)域產(chǎn)生巨大突破。
【關(guān)鍵詞】 納米技術(shù) 腫瘤 診斷 治療
1 癌癥納米技術(shù)
納米技術(shù)的正式定義是指一些設(shè)備，本身或其關(guān)鍵部分是人工的，至少在某個方向上是1~100nm范圍。與癌癥相關(guān)的納米技術(shù)設(shè)備可以是注射的納米載體；生物靶向性的納米造影劑，用于手術(shù)中顯像以區(qū)別神經(jīng)—腫瘤的相互關(guān)系；也可以是高度特異檢測DNA和蛋白質(zhì)的磁性納米粒子。Whitesides[3]在其納米技術(shù)的定義中，對確切的大小沒有過分限制，從生物學需要考慮，更強調(diào)生物納米尺寸在實際操作中的合適性。
2 常用的納米技術(shù)工具
2.1 用于藥物投遞和顯像的納米載體
癌癥治療中的納米載體是一大類納米技術(shù)裝置，可以非侵襲性地發(fā)現(xiàn)早期腫瘤分子標志；同時靶向性投給藥物。納米載體一般至少由3部分組成[2]：核心的組成部分；治療作用和（或）影像功能的有效負荷；生物表面調(diào)節(jié)分子，以增加納米粒子在播散時的腫瘤靶向性。
脂質(zhì)體是原始而簡單的納米載體，可以穿透癌癥新生血管增加腫瘤位點的藥物濃度。脂質(zhì)體包埋的阿霉素現(xiàn)在用于乳腺癌或難治性卵巢癌[4]。幾種類型的納米粒子可以增加MRI的對比度，如含釓或氧化鐵的納米粒子；以及多結(jié)構(gòu)納米造影劑，可以將MRI與生物靶向性和可見光檢測相結(jié)合。低密度脂性納米粒子已用于提高超聲影像的質(zhì)量。
注射用的多孔硅納米載體可以生物降解，比其他可生物降解的聚合體速度更快（幾分鐘~幾小時vs幾天~幾個月），因此具有以前不可達到的時間特征。金納米殼（Nanoshell）[5]，由黃金在硅核心上涂布組成，可以通過組織的近紅外線被選擇性的激活，導致局部治療性熱消融。
2.2 含納米材料的宏觀設(shè)備
目前有能力在納米范圍內(nèi)進行分子沉淀，使信息密度成百萬倍的增加，微陣列進步為納米陣列，直接用于核酸或蛋白組的測定。用于癌癥領(lǐng)域的另一個納米級裝置是表面增強的激光解吸附—電離飛行時間（surface?鄄enhanced laser desorption/ionization time?鄄of?鄄flight，SELDI?鄄TOF）質(zhì)譜技術(shù)，應(yīng)用于癌癥的早期診斷[6]。
多通路生物分子傳感器，可以同時間對大量不同的分子標志（組織或血清蛋白組）進行檢測，目前最有希望的有微懸臂和納米懸臂陣列。
硅納米導線或?qū)Ч芤延糜谛》肿臃蛛x，控釋藥物的投給[7]。也可以作為納米級的場效應(yīng)生物晶體管，當其表面發(fā)生分子結(jié)合事件時，變化的導電率可以被檢測。將尺寸控制在5~100納米的通路和小孔已在硅芯片上制成，使體積移動精確到納米范圍。
3 癌癥納米技術(shù)的應(yīng)用
納米技術(shù)的應(yīng)用包括：早期診斷，如對血標本進行蛋白組分析；其次，在體內(nèi)對腫瘤的演化過程進行分析或分子顯像；提高藥物治療的靶向性，避開體內(nèi)的生物或生理學屏障；對治療效果進行實時監(jiān)測，替代治療后的隨訪評估。
3.1 體內(nèi)癌癥生物標志的檢測和監(jiān)測
新的影像學技術(shù)使用的造影劑上結(jié)合有分子識別物質(zhì)或靶向性藥物（抗體），具有信號增強作用，可以檢測更微小更早期的癌細胞。
近來證實，親淋巴的順磁性納米粒子，可對前列腺癌的隱性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進行MRI顯像，這為非侵襲性方法難以發(fā)現(xiàn)。Meta分析顯示[8]，使用納米粒子造影的MRI對多種癌癥的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷具有很高的特異性（96%）和敏感性（88%）。Kobayashi等[9]在乳腺癌小鼠中使用釓納米載體——聚合狀的樹狀體（dendrimers）可以清晰顯示淋巴結(jié)和淋巴管的排泄，提示在臨床上可以替代前哨淋巴結(jié)活檢。雙峰納米粒子，攜帶有近紅外的肉眼可見的熒光基團，與MRI造影劑（交聯(lián)氧化鐵）共價結(jié)合，可以用于手術(shù)前腦腫瘤輪廓的描繪和手術(shù)中的病變顯示。交聯(lián)氧化鐵納米粒子與annexin?鄄Y共價結(jié)合，用于MRI可識別喜樹堿誘導T細胞的凋亡。使用生物精確納米粒子，端粒酶活性（增殖潛能的標志）也可以在細胞水平由MRI檢測。
持續(xù)血管生成發(fā)生于癌前病變中，是早期診斷中的重要標志。在動物模型中使用改良納米粒子，以ανβ3?鄄integrin為靶點，可以對血管形成進行了MRI顯像。另一個體內(nèi)分子檢測的是植入性傳感器，體外設(shè)備進行信號接收，但植入性材料存在非特異性吸附血清蛋白——生物污垢，導致傳感器對蛋白檢測能力迅速下降。
3.2 體外癌癥生物標志分子的早期精確檢測
臨床使用的一些癌癥分子標志，如CEA、PSA，由于特異性不是很好，限制其應(yīng)用于早期診斷。有幾個納米技術(shù)是很合適的侯選者，如納米懸臂，檢測蛋白組的SELDI?鄄TOF質(zhì)譜分析。
生物分子的結(jié)合會產(chǎn)生壓力和形變[10]，使用合適的選擇性納米結(jié)構(gòu)傳感器可以進行檢測和識別。主要的例子是微米和納米懸臂，當其表面發(fā)生核酸雜交、分子結(jié)合事件，其共振頻率會發(fā)生偏斜和改變。此偏斜或者直接被激光束探測，或者偏斜轉(zhuǎn)換成可以測量的物理特征，如共振頻率發(fā)生改變，見圖1。值得提出的是，將成千上萬個納米懸臂陣列集成在厘米大小的芯片上，這樣可以同時讀碼蛋白組信息，甚至整個蛋白組。此技術(shù)與微電子制作技術(shù)存在相同之處，因此提示可以大規(guī)模的，低成本可靠的生產(chǎn)。
納米懸臂、納米導線和納米管的陣列是可以將癌癥的診斷、預后和治療的選擇從單個生物標志向多個生物標志轉(zhuǎn)化的工具。
此外，攜帶熒光基團的硅珠已經(jīng)用于白血病細胞的檢測；在人類SY5Y成神經(jīng)細胞瘤和C6膠質(zhì)細胞瘤中，熒光納米粒子可以檢測細胞內(nèi)的鈣濃度——細胞死亡的有效標志，因此可定量測量細胞對藥物的反應(yīng)。
納米粒子比傳統(tǒng)的細胞染色方法具有穩(wěn)定性和可調(diào)性的優(yōu)勢。如量子點不會隨時間丟失其信號強度，即不存在光漂白作用；而且，偶聯(lián)不同抗體的納米粒子與對應(yīng)的分子靶向性結(jié)合后，可以顯示不同的顏色 [11]。即使進行單波長光照射，單個細胞或細胞群中的分子標志分布地圖將準確而清晰的顯示。
納米粒子已經(jīng)用于血清蛋白組的檢測，重點是痕量的低分子量蛋白水解片段，應(yīng)用于卵巢癌和其他腫瘤。SELDI?鄄TOF蛋白組分析使用納米粒子后，可增加單位面積的蛋白吸附能力，進行更多不同樣本的分離和檢測。
目前已經(jīng)開始聯(lián)合使用多個納米診斷技術(shù)。如改良的寡聚核苷酸—金納米磁性粒子具有500個zepto摩爾（zepto=10-21）的敏感性，用于核酸的檢測。因不需要酶擴增，具有超過PCR的優(yōu)勢，而且也用于蛋白質(zhì)分析[12]。更進一步的方法是改良金納米粒子探針，與微懸臂結(jié)合，可以分析DNA的單個堿基錯配。
3.3 藥物的靶向性治療
將具有識別功能的物質(zhì)（如抗體）與納米載體結(jié)合，使含有活性藥物的納米載體具有分子靶向性功能。與傳統(tǒng)的抗體引導的治療相比，分子靶向性納米載體至少具有4大優(yōu)勢：在每個靶向性生物識別過程中，可以攜帶更多有效治療負荷；能攜帶多個不同的靶向性藥物，增強選擇性；能夠以整體的方法通過生物屏障；局部可以投給多種藥物，導致靶向性的聯(lián)合治療。
通過葉酸介導的靶向性納米粒子已經(jīng)在移植鼻咽癌的裸鼠的治療中得到證實。多功能納米材料——樹狀多聚體在胞內(nèi)與葉酸靶向性結(jié)合后，選擇性的在細胞內(nèi)投遞抗癌藥物甲氨蝶呤[13]；若將熒光素結(jié)合到納米載體則可提供可視的影像信號。多種抗原已用于引導納米粒子識別血管內(nèi)皮細胞。如將存在于內(nèi)皮細胞的ανβ3?鄄integrin與全碳氟納米乳液結(jié)合，用于小鼠模型中結(jié)腸腺癌和黑色素瘤的抗血管治療。目前，已將靶向性溶解血管內(nèi)皮細胞和化療藥物相結(jié)合的納米粒子開發(fā)出來，并可以明顯提高治療效果，減少副作用[14]。
另一類靶向性方法由外部能量驅(qū)動，激活局部毒性反應(yīng)。如使用聚焦超聲爆破的脂質(zhì)包裹微囊進行光動力學治療；通過聯(lián)合使用金納米殼和近紅外線光學激活，對深層的癌細胞進行局部熱消融。其次，非特異的物理化學相互作用也會提高納米載體的靶向性，如100nm的粒子更趨向于達到內(nèi)皮細胞的末梢；比此尺寸更大或更小均導致靠邊，因此使治療的藥物更容易到達內(nèi)皮或組織部位。對pH敏感的多聚納米載體可以生物分解而釋放出抗癌藥物紫杉醇，所以腫瘤部位特殊的pH水平使治療作用優(yōu)先得到靶向性激活[15]。將來的希望是將上述靶向性方法聯(lián)合起來，使之在治療上取得最大成功。
獲得和維持藥物理想的生物分布，需要精確的給藥劑量和時間。植入體內(nèi)的納米膠囊，沒有多次注射和醫(yī)院使用的不方便，還可以預先編程，使投遞具有時間變化規(guī)律，或者通過傳感器對植入點的微環(huán)境刺激作出自調(diào)節(jié)的反應(yīng)。目前，從植入滲透泵恒速的投給激素藥物醋酸亮丙瑞林已經(jīng)在臨床上用于治療前列腺癌[16]。
3.4 工程納米粒子避開生物、生理學屏障
藥物和造影劑從投給部位向理想靶點的緩慢移動，充滿磨難，納米載體和傳統(tǒng)的方法均如此。生物物理屏障包括上皮細胞之間的緊密聯(lián)接（血腦屏障）或血管內(nèi)皮細胞的保護性排出，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)（reticulo?鄄endothelail system，RES）的捕獲，以及供應(yīng)癌癥的脈管系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)的紊亂和癌癥細胞中的高滲透壓；延遲藥物微粒進入或促進滲出。納米技術(shù)基礎(chǔ)的藥物投遞系統(tǒng)具有穿過屏障的優(yōu)勢，因為其組成的核心材料的獨特特征，如使用緩激肽拮抗劑可以增加血管的通透性[1]。
通透性增強劑的局部給藥，能可逆性地開啟細胞間的聯(lián)接，使生物分子藥物更容易穿透腸道的上皮細胞屏障，進入血液循環(huán)。納米技術(shù)具有多功能性，可以同時攜帶治療藥物、通透性增強劑和腸壁靶向性材料，因此也使藥物避免被酶降解，延遲釋放時間[17]。同樣，尺寸更微小的多功能粒子被靜脈注射，可以增加藥物從癌癥血管透出，或更容易通過血腦屏障。
細胞的RES可以隔離注射的納米粒子，對納米粒子包埋的藥物是有效的免疫屏障。通過表面覆蓋聚乙烯乙二醇，脂質(zhì)體可以有效避免被RES的吸收，因此藥物的半衰從幾分鐘提高到幾小時或幾天，增加了脂質(zhì)體靶向治療腫瘤的效果。
癌癥病變內(nèi)的高滲透壓，導致治療藥物滲透和在腫瘤內(nèi)擴散相當困難，即使藥物直接注射到病變也容易再排除，尤其是晚期癌癥。將來解決此麻煩問題的創(chuàng)造性方法是，多階段、多負荷的投遞系統(tǒng)，但目前這僅僅是一個理論上的構(gòu)思。2005年1月Abraxane被美國FDA批準[18]為治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌，此藥物由紫杉醇納米粒子組成，可以結(jié)合到白蛋白分子上。這種納米粒子不需要治療前使用甾體類抗炎藥物（傳統(tǒng)的紫杉類必須使用），白蛋白可以幫助納米粒子從內(nèi)皮細胞上穿過，此聯(lián)合可以將紫杉醇的臨床劑量提高50%。
4 納米技術(shù)的安全性和展望
納米技術(shù)對癌癥治療可能是最有希望的手段之一，然而，應(yīng)該放在安全性考慮之后。這不僅是嚴格的審批管理的觀點，當然也是健康工作者最關(guān)注的問題。納米載體也會觸發(fā)過敏反應(yīng)。碳納米管可以產(chǎn)生抗體，早期的納米樹狀體也可導致較弱的抗體反應(yīng)，但蛋白結(jié)合的樹狀體是很強的免疫原。因此，納米技術(shù)的治療不可能不導致過敏反應(yīng)，需要設(shè)計合適對抗手段。
納米粒子主要的優(yōu)勢是其多功能性，能夠?qū)⒍喾椒?，如治療、診斷和屏障避開制劑進行聯(lián)合，與藥物反應(yīng)的生物副作用也會增加。Cristini等[19]發(fā)現(xiàn)，將靶向性細胞毒藥物治療腫瘤，尤其是抗血管治療，將癌癥病變分割成多個衛(wèi)星灶，即治療產(chǎn)生的重新排列（氧和營養(yǎng)支持的來源），使后序治療的難度增加。
展望將來，對治療的療效進行實時評估方法，將替代直接對腫瘤大小、分子表達和靶向性信號通路進行的觀察，甚至替代一些傳統(tǒng)的終點分析方法，如緩解時間和生存時間。體內(nèi)分子顯像劑的開發(fā)，雙重的治療—顯像納米載體技術(shù)的建立，體內(nèi)顯微鏡技術(shù)（通過熒光光子技術(shù)對單個細胞進行顯像）的出現(xiàn)，將對最優(yōu)的診斷治療提供確實的依據(jù)[20，21]。
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篇6
最近科學家制造出一種納米顆粒，就具有這樣的潛力，目前體外實驗證明效果不錯，但是還需要進一步研究。這樣的策略也可以用于其他生物毒素的救治，例如對蝎子、蜘蛛、黃蜂、水母等毒素。該最新研究已經(jīng)在《美國化學學會雜志》上發(fā)表。北科羅拉多大學蛇類生物學家麥克西認為，這種救治思路聽起來非常好，如果進一步優(yōu)化該技術(shù)，有希望解決多種生物毒素中毒的治療難題。
傳統(tǒng)抗蛇毒方法的困境
由于缺乏有效治療方法，每年大約450萬人被毒蛇咬傷，其中10多萬人被咬死，被咬傷致殘的數(shù)量更多。毒蛇咬人造成嚴重后果的情況主要發(fā)生在非洲和東南亞地區(qū)，導致這些危害的關(guān)鍵就是邊遠地區(qū)缺乏足夠合適的抗蛇毒藥物。
傳統(tǒng)抗蛇毒血清的制造方法比較復雜，首先是提取蛇毒，然后給動物（如馬）少量注射，動物接受注射后，免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生針對這種蛇毒的多種抗體，這些抗體能結(jié)合蛇毒并使之失去毒性。因此，用這種動物的血清給毒蛇咬傷患者注射可以達到解毒的目的。但是傳統(tǒng)的抗毒血清存在許多問題，首先制造這種血清需要大量時間和成本，藥物公司很難獲得很好的利潤。其次，抗毒血清也必須放置在低溫條件下，存儲成本也較高。
如何利用納米技術(shù)解毒
篇7
酶抑制法
這是目前相對成熟的一種快速檢測技術(shù)。其檢測原理是利用有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥能夠特異性抑制昆蟲中樞與周圍神經(jīng)系統(tǒng)乙酰膽堿酶的活性，致使神經(jīng)正常傳導功能受到破壞。這樣昆蟲就會逐漸中毒而死。在開展果蔬農(nóng)藥殘留檢測試驗時，乙酰膽堿酶會與樣品發(fā)生反應(yīng)。若樣品無農(nóng)藥殘留或僅有少量農(nóng)藥殘留，酶的活性一般不會受到抑制；若樣品內(nèi)農(nóng)藥殘留量較大，酶的活性就會明顯降低。此法在半小時內(nèi)便能得出果蔬中有機磷農(nóng)藥與氨基甲酸酯的殘留結(jié)果。
酶抑制法具有操作簡單、檢測快速等優(yōu)點，是當前國際上常用的一種檢測果蔬農(nóng)藥殘留方法。此法主要被應(yīng)用于多地的蔬菜基地與市場，用于檢測果蔬農(nóng)藥殘留是否超標。但是此法的不足之處是檢測農(nóng)藥種類有限，以檢測有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥為主。
生物傳感器法
該技術(shù)是當前農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)中的研究熱點。它是利用生物的相關(guān)敏感部件與轉(zhuǎn)換器密切配合所形成的一種分析裝置。對某些生物活性物質(zhì)與特定化學物質(zhì)具有選擇性與可逆響應(yīng)。通過檢測pH、光、熱、顏色、電導等物理化學信號的變化來分析農(nóng)藥殘留情況。該技術(shù)不僅具有較強的靈敏度與選擇性，而且體積小、響應(yīng)迅速、抗干擾能力強、成本低廉。同時，還具有連續(xù)檢測與在線分析等優(yōu)點。根據(jù)使用生物敏感材料的不同主要分為四類，分別是細胞傳感器、酶傳感器、免疫傳感器、組織傳感器。
免疫學技術(shù)
目前，用于農(nóng)藥殘留檢測的免疫學技術(shù)有很多，常見的有酶免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)、化學發(fā)光免疫技術(shù)等。其中，最常用的就是酶聯(lián)免疫法（ELISA），其檢測原理是利用抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，受檢樣品與酶標抗原或抗w按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)。然后，通過洗滌方法將固相載體上面的抗原抗體復合物分離出來，再加入酶反應(yīng)底物。此時，底物被酶催化后變色，工作人員可根據(jù)顏色反應(yīng)進行定性或定量分析。
該檢測方法通過肉眼就能觀察到結(jié)果，并且成本低廉，試劑能夠長時間保存。工作人員無需借助先進的檢測設(shè)備就能完成定性或定量分析。因此，這是一種極易推廣與普及的檢測技術(shù)。但是ELISA的不足之處在于一種試劑只能檢測一種農(nóng)藥，而果蔬中往往殘留了數(shù)種農(nóng)藥，難以完全檢測出來。
紅外光譜法
近紅外光譜法：這是一種無損檢測技術(shù)，對人工配制的農(nóng)藥樣品需要進一步檢測，防止檢測過程中樣品受到破壞。此法存在諸多缺陷，檢測靈敏度不高，誤差大，不易建立起合理的模型。即使完成模型構(gòu)建后仍需不斷修正，消除干擾因素。同時，此法無法檢測散性樣品或痕量樣品。
中紅外光譜法：與近紅外光譜法相比，此法分子振動的基頻信號更強，可獲取更多的信息。同時，還能與其它多種不同的分析設(shè)備聯(lián)合使用，提高檢測準確性。不足之處在于生成的圖譜非常復雜，解析難度大，定量分析比較困難。
納米金技術(shù)
納米金是指直徑為1～100nm的微小金顆粒，能夠與多種生物大分子相結(jié)合，且不會對其生物活性產(chǎn)生影響。納米金作為顯微鏡示終物，被廣泛用于各類檢測技術(shù)中，如免疫印記技術(shù)、免疫層析技術(shù)、流式細胞儀、斑點金免疫滲濾測定技術(shù)等。因此，納米金技術(shù)又被稱為現(xiàn)代四大標記技術(shù)之一，其標記原理是球形狀的納米金顆粒具有極強的吸附性，能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)等高分子吸附到自身表面，逐步將自身包被起來。
篇8
【摘要】：隨著基因藥物、藥用輔料、新裝置和新的給藥技術(shù)的發(fā)展，脂質(zhì)體、微球、微囊、納米球、抗體等作為局部或全身性藥物的載體進行肺部給藥日益受到重視。
【關(guān)鍵詞】：脂質(zhì)體、微球、微囊、納米球、抗體
1脂質(zhì)體脂質(zhì)體是磷脂質(zhì)分子在水溶液中排列成封閉式多雙分層小球狀新型藥物載體， 也稱類脂小球或人工細胞。脂質(zhì)體由于對各種化合物的高負荷能力而作為潛在的藥物或基因的載體具有多個方面優(yōu)點被廣泛用于肺部給藥，包括增溶，緩釋，細胞及細胞內(nèi)定位，減低毒性和促進吸收。[1-5]一些研究結(jié)果表明脂質(zhì)體應(yīng)用于肺部給藥是安全的、有效的，Juliano and Mc Cullough [6]研究包裹在脂質(zhì)體內(nèi)的阿糖胞苷，其半衰期是原來的12倍，景恒翠等人[7]制備的穿心蓮內(nèi)酯脂質(zhì)體在肺部有良好的靶向性。影響脂質(zhì)體肺靶向給藥的因素，粒子大小和表面電荷，直徑4-7 μm的大粒子沉積在大氣道，直徑1-3μm的小粒子沉積在小氣道和肺內(nèi)，通常不帶電的中性脂質(zhì)體比攜帶正、負電荷的脂質(zhì)體容易分布在肺內(nèi)，然而中性脂質(zhì)體具有非零的Z -電位的離子強度，吸收陰離子或陽離子，導致輕微的負或正的Z -電位[9]。宋金春等人[8]研究的肺靶向羥基喜樹堿陽離子脂質(zhì)體的制備也為肺部腫瘤化療提供了一個良好的制劑方案。脂質(zhì)體在感染治療中的應(yīng)用，治療肺部感染所造成的各種病原體是一項艱巨的任務(wù)，這是因為藥物溶解度（大多數(shù)用于治療肺部感染的藥物是疏水性），毒性藥物（不溶性藥物沉積在肺部造成毒性），以及肺局部化（針對特定領(lǐng)域的肺癌）問題，利用脂質(zhì)體作為藥物載體的克服這些問題。若干項研究進行了測試的安全性和有效性利用脂質(zhì)體作為藥物緩釋劑或藥物載體[10]。Chimote and Banerjee 研究制備抗結(jié)核藥利福平，異煙肼和乙胺丁醇的脂質(zhì)體。肺癌是常見的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性惡性疾病。主要是由于診斷晚，肺腫瘤治療方法一般是減少手術(shù)。全身化療，吸入治療肺惡性腫瘤已在最近幾年的開展研究。巨噬細胞靶向藥物和治療肺動脈高壓的肺脂質(zhì)體靶向藥物也引起許多專家的研究。在過去的20年中，脂質(zhì)體已被應(yīng)用在肺部給藥。在這一領(lǐng)域的研究具有優(yōu)勢，脂質(zhì)體為載體，第一個和最重要的原因是他們的化學相似的肺表面活性劑。其他包括能夠溶解難溶性藥物的能力，提供持續(xù)釋放能力，促進肺泡巨噬細胞，并避免局部刺激肺組織的優(yōu)點。缺點是其形成穩(wěn)定骨架的壽命和其霧化后的穩(wěn)定性。
2微球微球是一種由天然和合成多聚體組成的，粒子大小< 200 μm的球形離子，微球?qū)儆诨|(zhì)型骨架微粒，可以包載一種或多種藥物，并具有靶向作用的特點。靜脈注射的微球，在體內(nèi)的分布首先取決于微球粒徑的大小。通常小于7μm的微球被肝脾中的巨噬細胞攝??；大于7μm-15μm時則被肺部的最小毛細血管床以機械濾過的方式截留。Makino等制備聚苯乙烯微球，研究影響巨噬細胞吞噬攝取能力的微球的大小和表面特性的因素，研究結(jié)果顯示聚苯乙烯微球比羧基微球更有效的被肺泡巨噬細胞吞噬和攝取。趙志娟、丁紅等人對肺靶向阿霉素微球的體外釋放度的測定方法的建立，為抗腫瘤治療提供了良好的研究基礎(chǔ)。微球作為載體應(yīng)用于多種疾病的治療，首先，抗腫瘤藥物，順鉑、卡鉑、多西紫杉醇的微球的制備被廣泛研究，這些研究結(jié)果表明這些藥物的微球制劑在肺部擁有理想的濃度，能達到有效的靶向作用。同時還有大量的研究集中在肺部吸入藥和抗結(jié)核藥的微球制備。
3納米粒納米粒是在200-300nm范圍大小的固態(tài)膠體微粒。目前，納米給藥系統(tǒng)多應(yīng)用于肺癌的治療，該類型的納米粒子在研究癌癥的治療應(yīng)用包括聚合物納米微粒、膠束、蛋白質(zhì)納米粒子、陶瓷納米粒子、納米病毒和金屬納米粒，這些功能性納米微粒提供一個不被血清蛋白粘附的穩(wěn)定表面，特別時親水聚合物，可降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除。明膠納米粒子是基于人血清蛋白的納米粒子，因此這類粒子適合作為藥物載體用于人呼吸道上皮細胞的基因治療，但是多烷基聚合物的納米粒子對呼吸道上皮細胞有細胞毒性，它的的毒性主要依賴于烷基鏈的長度，短鏈比長鏈毒性大。納米氣溶膠具有可生物降解的核心，能有效地分布在肺部基因中，帶有負電荷的納米氣溶膠比其他帶有正電荷的納米粒子低毒，因為它能表現(xiàn)出與細胞凋亡中產(chǎn)生的潛在負電荷的細胞膜減少的接觸。蛋白質(zhì)納米粒子用于肺癌的基因治療，在包載胰島素形成的納米粒子對控制血糖也有顯著的優(yōu)勢，可延長降糖作用達20-48h。蛋白質(zhì)納米粒子還可以封裝降鈣素，能有效降低豚鼠血鈣濃度長達24h。
4.微囊微囊是基于非離子表面活性劑的單層和多層囊泡，是藥物載體的一種。一項研究顯示在肺癌小鼠治療中直徑為3.72μm的卡鉑微囊能提高治療效果和減少副作用[11]。還有研究結(jié)果證實順鉑微囊擁有顯著的抗肺部腫瘤次生長活性，比單獨應(yīng)用順鉑毒性低。在抗結(jié)核藥物方面，直徑8 -- 15 μm的利福平微囊，經(jīng)大鼠口服后65%的藥物肺部在肺部。
結(jié)論：
脂質(zhì)體、微球、微囊、納米球、抗體等微載體給藥系統(tǒng)在肺靶向給藥起著重要作用，載體能向肺部提供持續(xù)的藥物，延長給藥時間，減少給藥劑量，提高患者的依從性和減少高毒性藥物的不良反應(yīng)。最近，生物活性分子例如載體表面結(jié)合的抗體提供了肺部靶向給藥的一個良好的平臺。然而，研究清楚的證明了受體在肺部高表達，還需要證實這樣的受體不僅在肺部，在肺的細支氣管和肺泡也有其靶向作用。我們應(yīng)進一步研究長期應(yīng)用的安全性，對每一個微載體的毒理學和毒代動力學的研究和這些藥物的臨床應(yīng)用的研究。肺靶向給藥系統(tǒng)的載體研究前景廣闊。
參考文獻
篇9
關(guān)鍵詞 抗腫瘤藥物 靶向制劑 進展
脂質(zhì)體(LIPOSOME)
傳統(tǒng)脂質(zhì)體：①Dauno Xome：系柔紅霉素脂質(zhì)體制劑，由二硬脂酰(DSPC)與膽固酸組成靶向藥物傳遞系統(tǒng)(SUVS)，臨床研究證明，脂質(zhì)體與游離柔紅霉素相比，療效明顯增加且毒性降低。②Caelyx：系鹽酸多柔比星的立體穩(wěn)定型脂質(zhì)體，表面含親水性的甲氧基聚乙二醇(MPEG)，包封層可延長脂質(zhì)體在血液中停留時間，在人體中的半衰期為55小時，而游離藥物可在幾分鐘內(nèi)分布至各組織，并在24小時內(nèi)從體循環(huán)中完全清除。脂質(zhì)體骨架和內(nèi)在的緩沖體系使多柔比星完全被包封而使藥物不能游離，不良反應(yīng)低。③Onco Tcs即長春新堿脂質(zhì)體：以載體系統(tǒng)(TCS)傳遞，將藥物傳遞至病灶，并以高濃度進入疾病細胞，其作用時間較長，能使對原先化療無效的晚期非霍奇金淋巴瘤(NH)病人的腫瘤明顯縮小，Ⅱ期臨床研究結(jié)果表明，使用本品治療評估的NH病人總有效率為45%。
他莫昔芬傳遞體：是指具有高度變形能力，并能以皮膚水化壓力動力，高效穿透比自身小數(shù)倍孔道的類脂聚集體。將他莫昔芬制成傳遞體后，藥物主要蓄積于皮膚，對皮膚的穿透率大于普通脂質(zhì)體，取得了令人滿意的結(jié)果。
基因藥物脂質(zhì)體：基因脂質(zhì)體制劑能夠?qū)⒅委熁驅(qū)蜃饔貌课?，保護DNA或RNA免于滅活或降解，在體內(nèi)有較高的轉(zhuǎn)染率，與細胞融合后，即被降解，不良反應(yīng)小。將DNA-脂質(zhì)體復合物引入皮下腫瘤中，轉(zhuǎn)移的基因表達并定位在注射部位，未見明顯的毒性或抗DNA抗體。
自1978年Zamecnik 等首次證明，特異互補的寡核苷酸在體外能有效抑制Rous肉瘤病毒(RSL)的增殖以來，反義寡核苷酸引起人們的廣泛興趣。隨著快速基因克隆及自動DNA合成技術(shù)的出現(xiàn)，反義核苷酸的研究有了迅猛發(fā)展：作用于PKC-α基因的反義化合物ISIS-3521正處于Ⅱ期臨床試驗階段，其作用靶點是c-raf激酶，可用于治療前列腺癌、卵巢癌等。用于治療晚期黑色素瘤的靶向c-raf基因和靶向bcl-α基因正處于臨床研究階段。但反義核苷酸易受酶的攻擊而降解，因此對核酸酶不穩(wěn)定；另外其攝取率及轉(zhuǎn)運特異性亟待解決，因此抗體導向的反義寡核苷酸的靶向轉(zhuǎn)運成為另一研究方向[1]。
毫微粒和毫微囊
長循環(huán)毫微粒：長循環(huán)毫微粒即靜脈注射給藥后，能夠躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(MPS)的攝取，而在血液循環(huán)系統(tǒng)中長時間滯留的毫微粒。作為抗腫瘤制劑，它的最大特點就是具有克服多向性藥物耐受性的能力。而且Grislain 等通過實驗證明了，聚氰丙烯異丁脂毫微粒具有對肺腫瘤組織的通過性，并認為經(jīng)過修飾，可降低由于普通毫微粒(NP)在MPS系統(tǒng)的蓄積而造成的抗腫瘤藥物對NPS的毒性，但這種應(yīng)用尚存疑問。宋存先等證明載藥的NP制劑能作為血管內(nèi)靶向定位[2]。
固體脂質(zhì)納米粒(SLN)：固體脂質(zhì)納米粒是將固態(tài)的天然或合成的類脂藥物包封于類脂核中制成的，具有控制藥物釋放，避免藥物降解或泄露，以及良好的靶向性等特點。喜樹堿(CA)的SLN口服給藥后，與CA溶液劑相比，在觀察的各器官中，CA的AUC和MTR均有顯著提高，其中腦中AUC提高尤其明顯，說明SLN作為緩釋靶向制劑具有廣闊的應(yīng)用前景。
其他抗腫瘤藥物NP制劑：阿霉素A的聚氰基丙烯酸異丁酯NP的體外抗肝細胞瘤效果均明顯優(yōu)于游離的阿霉素A。另外，吸附于聚氰基烯酸烷基酯納米粒子上的寡核苷酸，已被證實提高了其對核酸酶的穩(wěn)定性，并形成了更理想的細胞定位。體內(nèi)和體外實驗均證明，把親脂性免疫調(diào)節(jié)劑制成NP，其抗轉(zhuǎn)移瘤比游離態(tài)制劑更有效，中藥提取物紫杉醇毫微球作為熱點之一正在研究階段。
磁性藥物制劑
磁性藥物制劑是近年來國內(nèi)外大力研究的一種新的靶向制劑，其中抗腫瘤藥物微球研究得最多。這種磁性微球在體外磁場的作用下，在腫瘤部位滯留，定向釋放藥物，可以減少用藥劑量，提高靶區(qū)藥物濃度，減少血液循環(huán)中藥物分布，對肝、脾、腎等器官損害較小。
王氏[3]等用含平陽霉素、甲氨喋呤、阿霉素、絲裂霉素的磁性微球，對58例不同類型的食管癌、口腔癌、直腸癌、舌癌的患者進行了治療，結(jié)果完全緩解22.4%，部分緩解67.2%，總有效率為89.7%。
現(xiàn)已制備的抗腫瘤磁性微球還有：絲裂霉素C、兩性霉素B、氟尿嘧啶、肝素、博來霉素等。阿霉素磁性微球是目前研究得最多的抗腫瘤制劑，動物實驗證明，該制劑有非常好的靶向性及對腫瘤細胞的殺傷性，但同時也使實驗動物體重降低，出現(xiàn)肝、腎組織壞死等癥狀。雖然磁性微球的劑型僅限于水溶性制劑且存在許多如肝、腎組織毒性等問題尚待解決，但其在離表皮較近的如乳腺癌、膀胱癌、食道癌、皮膚癌等的治療方面已顯出優(yōu)越性。
微 球
微球作為抗腫瘤藥物靶向載體的研究非常引人注目，其中用于肝動脈栓塞的研究較為成熟，已進入臨床治療階段。白蛋白最主要的應(yīng)用是將其作為抗腫瘤藥物載體，使其療效提高，不良反應(yīng)減小。它是以白蛋白為載體，包封或吸附藥物，以過固化分離而形成的實心球體，與脂質(zhì)體和乳劑相比，具有在體內(nèi)貯存時穩(wěn)定性好的優(yōu)點。用白蛋白包封研究的抗癌藥已有阿霉素、5-氟尿嘧啶、巰基嘌呤、博來霉素、甲氨蝶呤、長春花堿酰胺硫酸鹽等。
抗體靶向酶-前藥制劑
該類制劑系指將特異性抗體-酶交聯(lián)物注入體內(nèi)，使其與腫瘤細胞表面抗原特異性結(jié)合，然后再注入毒性較低的前藥，此時結(jié)合在腫瘤細胞上的酶特異性地將前藥轉(zhuǎn)化成活性藥物，作用于腫瘤細胞。該制劑選擇性高、局部藥物濃度大，毒性相對較低。利用基因工程技術(shù)制備的人源化抗體，保存了靶向性的同時又較傳統(tǒng)方法制備的鼠源性單抗引起的人抗鼠抗體反應(yīng)輕，療效好。常用的活性前藥有苯甲酸氮芥、苯酚氮芥、甲氨蝶呤、阿霉素、美德倫、沙?？?、苯胺氮芥、長春花堿、紫杉醇、柔紅霉素、5-FU、表柔比星、足葉乙苷絲裂霉素C、絲裂霉素、氰化物、羥基衍生物等。雖然抗體靶向酶-前藥制劑療效較好，但也存在免疫學和藥理學方面的一些缺陷，目前正處于臨床前或臨床研究階段。
抗體制劑
首個上市治療腫瘤的單克隆抗體是1997年經(jīng)FDA批準的Rituximab(商品名Rituxan)，它是一種靶向B細胞CD20的小鼠人嵌合抗體，用于治療復發(fā)或難治性低度或濾泡型非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；另外，Bexxar 和Zexxar也是治療該瘤的單抗。首個新抗體靶向化療藥Mylotarg 是一種靶向細胞表面蛋白CD33抗體，用于治療首次復發(fā)的急性髓細胞性白血病(AML)。1999年批準上市的Ontak用于治療肢體軟組織瘤。
治療癌癥疫苗
腫瘤相關(guān)抗原能激發(fā)特異性的腫瘤應(yīng)答，并作為癌癥疫苗的靶點。全球第一個黑色素治療疫苗已在加拿大批準上市，M-Vax也成為2000年首個進入澳大利亞市場的黑素瘤疫苗，使用乳腺癌和結(jié)腸癌胚抗原(CEA)的疫苗正在研究中。生長因子受體ErbB-2/neu也擬用于乳腺癌和卵巢癌，用于治療前列腺癌的研究性疫苗PROSTVAC VF進入了Ⅱ期臨床，SnET2(GM2神經(jīng)節(jié)苷酯)疫苗已進入Ⅲ期臨床試驗，對直腸癌、胃癌、及小細胞癌有效。
參考文獻
1 鄒宗亮，王升啟，王志清.靶向技術(shù)在反義寡核苷酸中的應(yīng)用.國外醫(yī)學?藥學分冊，2000，27(5)：260-264.
篇10
1實驗步驟
1.1CSN的制備采用油包水的反相微乳液法合成CSN[11]。通過正硅酸乙酯(TEOS)的水解和縮聚反應(yīng)，并以TritonX-100、正己醇、環(huán)己烷分別為表面活性劑、助表面活性劑和有機溶劑，氨水作為催化劑，制備二氧化硅納米微球；為合成彩色微球，在反應(yīng)過程中分別加入活性大紅3G、活性橙黃X-GN、活性藍綠(活性翠蘭KN-G與活性嫩黃4GLN按1∶1調(diào)配)等有機活性染料各150μL；為消除二氧化硅納米微球之間的團聚，加入20μL硅烷偶聯(lián)劑KH-550在微球表面引入氨基，增大表面電位以促進微球之間的分散度，形成單分散彩色微球。連續(xù)反應(yīng)48h后用丙酮破乳、離心并收集顆粒，將得到的CSN分散在5mL超純水中備用。
1.2CSN的粒徑和形貌表征采用場發(fā)射掃描電鏡SU-70和Nano2S激光粒度電位儀對各參數(shù)下制備的二氧化硅納米微球的粒徑和形貌進行表征。
1.3CSN的活化將合成的CSN用超純水清洗三次，分散到20mL水中超聲10min使微球均勻分散，分別加入1.4mL冰乙酸和0.2mL的APTE攪拌均勻后持續(xù)震蕩反應(yīng)1h。將反應(yīng)后的微球用水清洗3次，分散到10mL琥珀酸酐和DMF的混合溶液中在通氮氣條件下持續(xù)振蕩反應(yīng)5h，離心、清洗后即可得到富含羧基的活性微球，將其4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4ICSN的制備及反應(yīng)原理配制pH6.8濃度為0.1mol/L的嗎啉乙磺酸緩沖液(MES)，在5mLMES緩沖液中分別加入500mg的N-羥基丁二酰亞胺和500mg的DEHE，加入活化后的CSN室溫下反應(yīng)1h。離心后得到的微球分散到pH7.3濃度0.1mol/LPBS中。取10mL分散的活化微球與10μLE.sakazakii凝集抗體，室溫下孵育4h，用PBS清洗、離心后得到ICSN，分散到5mLPBS中，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.5制備抗原制取一定濃度的E.sakazakii菌液，將其用0.4%甲醛溶液滅活，并進行滅活檢測，確定滅活后稀釋成所需濃度。
1.6不同ICSN凝集試驗將不同顏色的ICSN各10μL分別與等量的待測抗原滴加在潔凈的凹圓載玻片上，混勻至抗原抗體充分反應(yīng)，在1min～3min內(nèi)觀察凝集現(xiàn)象，同時設(shè)陰性對照，除特別說明以外的其它凝集反應(yīng)均在室溫(22℃±2℃)下進行。
1.7ICSN的特異性將標記E.sakazakii抗體的ICSN分別與濃度相同的E.sakazakii、S.pullorum&gallinarum、E.coli、S.flexneri進行凝集試驗，用生理鹽水做陰性對照，觀察凝集現(xiàn)象。
1.8ICSN的敏感性用ICSN分別與濃度為6×101cfu/mL～6×109cfu/mL的E.sakazakii進行凝集試驗，并以生理鹽水為陰性對照，觀察凝集效果，評價其敏感性。
1.9凝集反應(yīng)最適溫度的選擇取10μL藍色ICSN與10μLE.sakazakii，分別在溫度為0℃、22℃、37℃、45℃和60℃條件下進行凝集反應(yīng)，觀察凝集效果，以確定出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象的最適溫度。
1.10穩(wěn)定性將制備的ICSN在4℃條件下放置30d，而后取出室溫放置，使其溫度達到室溫，觀察與E.sakazakii的凝集效果，測其儲存穩(wěn)定性。
2結(jié)果
2.1CSN的制備研制的單分散彩色二氧化硅納米活性微球如圖2所示。圖2A為活性大紅3G、活性橙黃X-GN、活性嫩黃4GLN、活性綠(活性翠蘭KN-G與活性嫩黃4GLN按1∶1調(diào)配)、活性翠蘭KN-G、活性芷青GD和活性紫KN-4R染色后的7種顏色的CSN；圖2B為合成的CSN的掃描電鏡圖，由圖可知，這些彩色微球的形狀規(guī)則、大小均一(約70μm)、表面光滑并且具有較好的分散性。
2.2ICSN凝集試驗分別用藍色、黃色和紅色3種顏色的ICSN與E.sakazakii菌懸液進行凝集反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果如圖3所示。以3種不同顏色的ICSN分別與E.sakazakii的玻片凝集反應(yīng)，在1min～3min均出現(xiàn)明顯的團狀或絮狀凝集現(xiàn)象，液滴變得澄清，凝集現(xiàn)象醒目、直觀及易于判別(圖3A、B、C)。表明ICSN具有很好的免疫凝集特性，并且3種不同顏色的ICSN均具有同樣良好的凝集效果，即不同種顏色有機活性染料對ICSN與抗原的凝集反應(yīng)過程均無可見影響，染料只起顯色、醒目的效果。而在ICSN中加入生理鹽水可以觀察到微球均勻分散在液滴中，無任何凝集塊出現(xiàn)，表明包被抗體的ICSN既不與生理鹽水發(fā)生反應(yīng)，也無自凝現(xiàn)象。
2.3ICSN的特異性為考察基于ICSN的新型凝集試驗的特異性，本研究選用了3種常見致病菌分別與E.sakazakii修飾的ICSN進行凝集試驗，并以生理鹽水為陰性對照，結(jié)果顯示，標記E.sakazakii抗體的藍色ICSN僅與E.sakazakii發(fā)生凝集反應(yīng)，與S.pullorum&S.gallinarum、E.coli、S.flexneri均未發(fā)生凝集，用生理鹽水做陰性對照，表明ICSN具有良好的特異性。
2.4ICSN敏感性測定采用藍色ICSN與不同濃度E.sakazakii菌液的凝集結(jié)果顯示，當菌液濃度為6×109cfu/mL和6×108cfu/mL時，出現(xiàn)粗大凝集塊，液滴澄清，凝集現(xiàn)象清晰、醒目，凝集結(jié)果判定為++++；當菌液濃度為6×107cfu/mL和6×106cfu/mL時，出現(xiàn)粗大凝集塊，液滴有少量渾濁，凝集現(xiàn)象清晰醒目，判定為+++；當菌液濃度為6×105cfu/mL、6×104cfu/mL和6×103cfu/mL時，出現(xiàn)較明顯的凝集塊，液滴較渾濁，判定為++；當菌液濃度為6×102cfu/mL時，顯示肉眼可見的輕微凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，液滴渾濁，凝集結(jié)果判定為±；濃度為6×101cfu/mL的菌液和生理鹽水中未觀察到凝集現(xiàn)象(圖5)。結(jié)果表明，ICSN具有較好的靈敏度，對E.sakazakii的檢測范圍為6×103cfu/mL～6×109cfu/mL。
2.5凝集反應(yīng)最適溫度的選擇凝集試驗是基于抗原與抗體之間的特異性反應(yīng)，其中抗體的活性是凝集試驗的效果好壞的關(guān)鍵，在各種因素中反應(yīng)溫度對抗體活性的影響較為明顯(圖6)。圖6結(jié)果顯示，22℃～37℃的條件下，ICSN與E.sakazakii最先發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象較快，僅為20s～30s，凝集效果清晰、醒目，并且該溫度接近室溫，便于操作，因此選擇22℃～37℃為最佳凝集反應(yīng)溫度。當溫度為45℃和60℃時，凝集現(xiàn)象依次減弱，這與常規(guī)凝集試驗相同。
2.6穩(wěn)定性試驗4℃放置30d后的3種顏色的ICSN的凝集效果與儲存前無顯著差異，表明ICSN的穩(wěn)定性好。
3討論
