導(dǎo)語：如何才能寫好一篇生物學(xué)特性研究，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公文云整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

取發(fā)酵液，以4℃、4000r/min離心30min去除菌絲，再用0.45um水溶性濾膜濾去殘余菌體，濾液用30kD超濾管以4℃、5500r/min超濾20min，用少量PBS溶液將蛋白洗脫，上層洗脫液（大分子物質(zhì)）和下層超濾液（小分子）分別保藏待用。下層超濾液用乙酸乙酯等體積萃?。ㄝ腿?次，每次用原溶液1/2體積的乙酸乙酯萃取，再合并），45℃旋轉(zhuǎn)濃縮至1/10體積。生物學(xué)活性代謝產(chǎn)物的活性分析將1.2.4節(jié)上層洗脫液和下層超濾液分別對(duì)供試菌株B5和B3進(jìn)行牛津杯生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。每支試管添加15mL牛肉膏液體培養(yǎng)基并滅菌，冷卻后分別添加上述粗提取的下層超濾濃縮液2mL，混合后接種供試菌株B5，以35℃、120r/min搖床培養(yǎng)，分別于0h，4h、8h、12h、16h和20h，6個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度，每個(gè)樣重復(fù)處理3個(gè)，取平均值。生物學(xué)活性代謝產(chǎn)物判定取1.2.5節(jié)實(shí)驗(yàn)中具有生物學(xué)活性的液體，進(jìn)行雙縮脲蛋白顯色實(shí)驗(yàn)，取3mL液體，加入0.1g/mLNaOH溶液3mL，震蕩均勻，再加入2~3滴0.01g/mLCuSO4，震蕩搖勻，觀察是否出現(xiàn)紫紅色，判斷具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物中是否有蛋白質(zhì)，是否為活性蛋白抑菌生物學(xué)活性性質(zhì)。

2結(jié)果與分析

2.1生物學(xué)活性菌株的篩選

牛津杯實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，30株放線菌中有2株對(duì)供試菌株具有明顯的抑菌活性，編號(hào)分別為A22、A2，抑菌效果如圖1所示。圖1結(jié)果表明，A22和A2的牛津杯實(shí)驗(yàn)抑菌圈很明顯，A22抑菌圈內(nèi)徑為6mm，外徑為18mm；A2抑菌圈內(nèi)徑為6mm，外徑為12mm。比較結(jié)果表明，A22和A2對(duì)供試菌株均具有生物學(xué)抑菌效果，且A22較強(qiáng)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明這兩株放線菌對(duì)供試菌株的生物學(xué)抑菌效果比較穩(wěn)定。

2.2菌株的形態(tài)觀察

按實(shí)驗(yàn)方法對(duì)A22、A2進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察[25]，菌落及電鏡照片分別見圖2和圖3。培養(yǎng)過程的觀察結(jié)果表明，A22和A2的生長(zhǎng)周期相似，都在72h左右長(zhǎng)出成熟菌落，A22形成白色、邊緣整齊凸起的圓形菌落；A2的菌落呈圓形，菌落呈灰色，邊緣整齊無凸起，氣絲呈粉狀。A22在5d生成褐素，A2的色素形成稍晚在7d左右生成，并且在菌落形成后期可以聞到明顯的土腥味，以上基本特征符合放線菌的生理特征，可以初步確定此兩株菌均為放線菌。

2.3菌株的分子鑒定

對(duì)菌株A22、A2的基因組DNA進(jìn)行提取，A22的PCR產(chǎn)物測(cè)序長(zhǎng)度為1500bp，A2的PCR產(chǎn)物測(cè)序長(zhǎng)度為1400bp，再利用BLAST將所測(cè)定株菌株的序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中已知放線菌的16SrRNA序列進(jìn)行比較鑒定。結(jié)果表明，A22菌株與白色鏈霉菌（Streptomycesalbus）、A2菌株與灰色鏈霉菌（Streptomycesgriseus）同源性最高，且同源性均可達(dá)到99%以上。再將序列經(jīng)ClustalX多序列比對(duì)后，利用Neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，A2、A22分別與Streptomycesgriseus的模式菌株JX007982、Streptomycesalbus的模式菌株NRRLB-2365相似度最近，同源性最高，可確定A2、A22分別為Streptomycessp.的Streptomycesgriseus和Streptomycesalbus。

2.4菌株代謝產(chǎn)物活性分析

牛津杯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A22與A2的上層洗脫液沒有生物學(xué)抑菌活性，下層超濾液的抑菌活性則非常明顯，并且同一株菌的下層濾液，由于發(fā)酵時(shí)間不同和作用的供試菌株不同，呈現(xiàn)出的生物學(xué)活性效果也不同。牛津杯實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4-圖6（圖下為1.2.3培養(yǎng)時(shí)間）。如圖5~圖7所示，A22與A2在發(fā)酵30-36h的發(fā)酵代謝產(chǎn)物對(duì)供試菌株的生物學(xué)抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)比圖5與圖6，A22對(duì)B5的生物學(xué)抑菌活性相對(duì)B3較強(qiáng)，而A2只對(duì)B5表現(xiàn)出了抑菌活性，總體上A22比A2對(duì)供試菌株的生物學(xué)抑菌效果更好。對(duì)比圖5和圖7，A22比A2的代謝產(chǎn)物對(duì)供試菌株具有更加穩(wěn)定的抑菌生物學(xué)關(guān)系，抑菌生物學(xué)效果更強(qiáng)。為進(jìn)一步分析A22和A2代謝產(chǎn)物的生物學(xué)活性效果，選用B5作為供試菌株，添加A22和A2代謝產(chǎn)物進(jìn)行液體培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵菌液的吸光度值，從生物量上比較A22和A2代謝產(chǎn)物對(duì)供試菌株的生物學(xué)活性，結(jié)果見表1、表2。6培養(yǎng)時(shí)間（h）菌株及發(fā)酵時(shí)間A22(24h)A22(30h)A22(36h)A22(42h)A22(48h)A22(54h)000000040.0370.0160.0090.0300.0350.04280.0460.0310.0160.0410.0390.053120.0560.0350.0350.0520.0650.068160.0620.0380.0660.0890.1030.113200.0910.0500.0730.1540.1940.176表2A2發(fā)酵液下層超濾液-B5液體培養(yǎng)吸光度分析結(jié)果培養(yǎng)時(shí)間（h）菌株及發(fā)酵時(shí)間A2(24h)A2(30h)A2(36h)A2(42h)A2(48h)A2(54h)000000040.0250.0150.0170.0280.0190.02380.0430.0220.030.0420.0360.031120.0470.0420.0530.0460.0620.062160.0850.0670.070.0780.0730.075200.1200.0790.0830.1330.0960.150表1、表2結(jié)果表明，A22和A2在30-36h發(fā)酵時(shí)間段發(fā)酵液超濾的下層超濾液對(duì)供試菌株的生物學(xué)抑菌活性最強(qiáng)，因?yàn)樘砑?0-36h時(shí)段發(fā)酵液超濾后下層超濾液的B5培養(yǎng)液中菌體的吸光度值是最小，表明此時(shí)的B5菌體生長(zhǎng)受到抑制，菌濃較低。在添加了發(fā)酵時(shí)間36h后的發(fā)酵液超濾下層超濾液的B5培養(yǎng)液中，菌體的吸光度值又變大，菌濃較大，這說明發(fā)酵36h后，積累的代謝生物學(xué)抑菌活性成分被降解或利用掉了，生物學(xué)抑菌活性成分濃度降低或沒有生物學(xué)抑菌活性成分。表1、表2結(jié)果還表明，A22在發(fā)酵30h的代謝產(chǎn)物生物學(xué)活性效果最為顯著。液態(tài)發(fā)酵生物學(xué)結(jié)果與牛津杯實(shí)驗(yàn)中圖5、圖7的結(jié)果也吻合。因此，可知A22的代謝產(chǎn)物對(duì)供試菌株的生物學(xué)抑菌活性效果要比A2強(qiáng)，A22在發(fā)酵30h時(shí)代謝積累的對(duì)供試菌株具有生物學(xué)抑菌活性的代謝產(chǎn)物濃度也大。

2.5生物學(xué)抑菌活性代謝產(chǎn)物分析

根據(jù)雙縮脲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，A22和A2發(fā)酵代謝對(duì)供試菌株具有生物學(xué)抑菌活性的代謝產(chǎn)物與雙縮脲試劑均勻混合后只呈現(xiàn)出淡藍(lán)色，而并未呈現(xiàn)出紫色，表明并未生成紫色絡(luò)合物，再結(jié)合超濾管下層濾液分子量較小的特性，可以斷定對(duì)供試菌株具有生物學(xué)抑菌活性的代謝產(chǎn)物并非蛋白質(zhì)[26]，可能為某種抗生素類的小分子化合物。相對(duì)芽孢桿菌對(duì)白酒風(fēng)味影響的研究[27-28]，放線菌在白酒釀造過程的作用并未引起太多關(guān)注，黃兵證明了放線菌與芽孢桿菌間存在互相的生長(zhǎng)影響關(guān)系[29]，這同本實(shí)驗(yàn)得出放線菌代謝產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)醬香芽孢桿菌存在生物學(xué)抑制活性作用的結(jié)論相似，說明放線菌能通過對(duì)產(chǎn)醬香芽孢桿菌的生物學(xué)調(diào)控來影響產(chǎn)香菌的生長(zhǎng)和代謝積累白酒風(fēng)味成分。另外，對(duì)比其他領(lǐng)域的放線菌生物學(xué)抑菌研究，相似體積與濃縮濃度下本實(shí)驗(yàn)所觀察到的放線菌代謝產(chǎn)物抑菌圈較小[30-31]，抑菌作用柔和，說明放線菌對(duì)白酒釀造微生態(tài)存在并不是單純的破壞，而是對(duì)其進(jìn)行合理的調(diào)控，這也與本實(shí)驗(yàn)的研究初衷相吻合。固態(tài)發(fā)酵過程存在生物學(xué)調(diào)控、酶化學(xué)調(diào)控、工藝條件調(diào)控、環(huán)境基態(tài)和物態(tài)調(diào)控等，其中最核心的調(diào)控為生物學(xué)調(diào)控和物態(tài)調(diào)控，生物學(xué)調(diào)控中尤其是功能型群體微生物的調(diào)控[32]。關(guān)于放線菌對(duì)固態(tài)發(fā)酵過程功能性微生物群落的整體性生物學(xué)調(diào)控和風(fēng)味調(diào)控機(jī)理目前本課題組正在進(jìn)一步深入研究。

3結(jié)論

篇2

關(guān)鍵詞向日葵；黃萎病；致??；生物學(xué)特性

向日葵黃萎?。╒erticilliumwilt）是一種在向日葵上發(fā)生嚴(yán)重的土傳病害[1]。近年來，隨著向日葵種植結(jié)構(gòu)的不合理化以及國(guó)內(nèi)品種資源多、亂、雜，使得向日葵黃萎病發(fā)生日趨嚴(yán)重，給向日葵生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響[2]。黃萎病是向日葵上發(fā)生的一種常見病害，分布廣泛，在世界各向日葵種植區(qū)均有發(fā)生，美州地區(qū)部分重病田，其發(fā)病率可達(dá)40%以上[3]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病在我國(guó)東北及華北等向日葵產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，寧夏引黃灌區(qū)及固原地區(qū)向日葵產(chǎn)區(qū)黃萎病發(fā)生較重，發(fā)病率最高達(dá)46.7%[4]。目前，關(guān)于黃萎病在棉花、茄子上面研究較多，向日葵黃萎病在發(fā)生和防治上研究較多，有關(guān)病菌的病原學(xué)、生理特性等研究較少，裴旭等[5]報(bào)道寧夏向日葵黃萎病由大麗輪枝菌引起，在病原菌生物學(xué)特性方面除付劍樺等[6]有所研究外，較完整的病原菌生物學(xué)特性尚未報(bào)道，本研究對(duì)寧夏地區(qū)向日葵產(chǎn)區(qū)黃萎病發(fā)生較重的地塊進(jìn)行病樣采集，對(duì)病原菌和其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，明確該病致病菌種類和病原菌的重要生物學(xué)特性，以期對(duì)寧夏向日葵黃萎病的發(fā)生和防治提供指導(dǎo)。

1材料和方法

1.1材料

病害樣本于2015年采自寧夏向日葵4個(gè)產(chǎn)區(qū)（惠農(nóng)區(qū)、平羅縣、海原縣、固原市）的向日葵地塊。

1.2方法

1.2.1病原菌分離和鑒定對(duì)采集的向日葵黃萎病病株在室內(nèi)運(yùn)用科赫氏法則進(jìn)行病原菌分離、純化，并保存[7]。將分離的病原菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征，顯微鏡下觀察分生孢子和分生孢子梗等形態(tài)學(xué)特征，并根據(jù)真菌分類學(xué)進(jìn)行病原菌鑒定[8]。1.2.2生物學(xué)特性研究溫度對(duì)向日葵黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響測(cè)定：從病原菌菌落邊緣取下圓形菌餅，接種到PDA培養(yǎng)基中，分別放入溫度為5~35℃等7個(gè)恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，15d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并記錄和分析，每處理3皿，重復(fù)3次。pH對(duì)向日葵黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響測(cè)定：將PDA培養(yǎng)基pH用稀鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液配制為pH3~12共10個(gè)檔次處理，從病菌菌落邊緣取下圓形菌餅，分別接種到不同pH的PDA培養(yǎng)基中，置于25℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，15d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并記錄和分析，每處理3皿，重復(fù)3次。碳源對(duì)向日葵黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響測(cè)定：將PDA培養(yǎng)基中分別加入麥芽糖、山梨醇、乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖和甘露醇作為碳源，制成平板培養(yǎng)基，分別將病原菌接種于中央，置于25℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)，15d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并記錄和分析，每處理3皿，重復(fù)3次。氮源對(duì)向日葵黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響測(cè)定：將PDA培養(yǎng)基中分別加入甘氨酸、谷氨酸、尿素、硝酸鈉、蛋白胨、牛肉膏和天冬氨酸作為氮源，制成平板培養(yǎng)基，分別將病原菌菌塊接種于中央，置于25℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)，15d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并記錄和分析，每處理3皿，重復(fù)3次。光照對(duì)向日葵黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響測(cè)定：將病原菌的菌塊接種到PDA培養(yǎng)基上，光照設(shè)為3種處理：全光照處理（光照24h/d）、半光照處理（光照12h/d）和黑暗處理（無光照24h/d），置于25℃條件下培養(yǎng)，第5、10、15天用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并記錄和分析，每處理3皿，重復(fù)3次。1.2.3菌絲生長(zhǎng)致死溫度的測(cè)定[9]從病原菌菌落的邊緣取下圓形菌餅，置于盛有少量無菌水的試管中，將裝有病原菌的試管放入水浴鍋中，水浴鍋的溫度分別設(shè)為30、35、40、45和50℃共5個(gè)處理，每個(gè)溫度處理分別恒溫加熱5、10min后迅速冷卻至室溫，重復(fù)3次，將菌絲塊多余水分用無菌濾紙吸收，置于PDA培養(yǎng)基中，25℃下恒溫培養(yǎng)，分別在5、10、15d后檢查菌絲生長(zhǎng)情況。

2結(jié)果與分析

2.1向日葵黃萎病菌分離和鑒定

采集寧夏向日葵4個(gè)產(chǎn)區(qū)（惠農(nóng)區(qū)、平羅縣、海原縣、固原市）的黃萎病病樣，分別對(duì)病組織分離、純化和單孢分離，4個(gè)地區(qū)的向日葵黃萎病菌落形態(tài)一致。將分離到的病原菌接種到室內(nèi)盆栽向日葵植株上，一段時(shí)間后接種病原菌的向日葵植株葉片變黃、莖基部維管束變褐，發(fā)病的植株癥狀與田間植株發(fā)病癥狀一致，再次對(duì)發(fā)病的植株進(jìn)行病原菌分離，病原菌的菌落形態(tài)特征與接種的病原菌的菌落相同，因此可以確定分離的病原菌為向日葵黃萎病的致病菌。對(duì)病原菌菌落形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌落正面初期產(chǎn)生白色氣生菌絲，后期菌絲表面產(chǎn)生黑色的菌核（封底圖版Ⅰ）。在顯微鏡下，病原菌分生孢子梗有分枝，分生孢子梗長(zhǎng)（26~54）μm×（1.6~3.5）μm，孢子?；砍拾岛谏?，分生孢子著生在小梗頂端，單胞，橢圓形，無色，大小為（4~9）μm×（2.2~3.8）μm，有微菌核產(chǎn)生（封底圖版Ⅱ）。根據(jù)病原菌特征，參照魏景超[9]真菌鑒定標(biāo)準(zhǔn)，將病原菌確定為半知菌亞門真菌大麗輪枝菌（VerticillumdahliaeSacc）

2.2病原菌的生物學(xué)特性

2.2.1溫度對(duì)向日葵黃萎病菌絲生長(zhǎng)的影響不同溫度條件下病原菌菌絲生長(zhǎng)存在差異，由圖1可知，菌絲在5~35℃內(nèi)均可生長(zhǎng)，大麗輪枝菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15d后，經(jīng)菌落直徑測(cè)定，在20~30℃菌絲生長(zhǎng)較快，其中在25℃條件下生長(zhǎng)最快，在5℃和35℃下菌落生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，菌落停止生長(zhǎng)，可將5℃和35℃視為菌絲生長(zhǎng)的最低溫和最高溫。2.2.2pH對(duì)向日葵黃萎病菌絲生長(zhǎng)的影響由圖2可知，大麗輪枝菌在pH4~11的PDA培養(yǎng)基上菌絲均可生長(zhǎng)，其中pH在4~9之間菌絲生長(zhǎng)較好，當(dāng)pH為5~6時(shí)菌絲生長(zhǎng)最好，當(dāng)培養(yǎng)基pH=3或pH=12時(shí)菌絲幾乎停止生長(zhǎng)，可將pH=3和pH=12視為菌絲生長(zhǎng)的最低和最高pH.2.2.3碳源對(duì)向日葵黃萎病菌絲生長(zhǎng)的影響對(duì)7種碳源處理的菌落生長(zhǎng)直徑進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在淀粉條件下菌絲生長(zhǎng)最好，其次是在蔗糖和葡萄糖條件下，在麥芽糖、山梨醇和乳糖條件下菌絲生長(zhǎng)較差。由此表明，淀粉是最適合黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)的碳源（圖3）。2.2.4氮源對(duì)向日葵黃萎病菌絲生長(zhǎng)的影響供試的7種不同氮源中，病原菌在甘氨酸條件下菌絲生長(zhǎng)最好，其次是在硝酸鈉、蛋白胨條件下，再次為在谷氨酸條件下，尿素條件下生長(zhǎng)最差。結(jié)果表明，黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)的最佳氮源是甘氨酸（圖4）。2.3.5光照對(duì)向日葵黃萎病菌絲生長(zhǎng)的影響對(duì)3種光照處理的菌落生長(zhǎng)直徑進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果由圖5可知，黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)最好，半光照條件下培養(yǎng)次之，全光照培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)最弱，說明大麗輪枝菌菌絲適合在黑暗條件下生長(zhǎng)。2.2.6菌絲生長(zhǎng)致死溫度的測(cè)定致死溫度測(cè)定結(jié)果表明，菌絲經(jīng)過5min水浴處理后，30、35、40℃處理菌落形成最多，45℃處理第10天開始生長(zhǎng)菌落，50℃處理幾乎無菌落長(zhǎng)出；菌絲經(jīng)過10min水浴處理后，菌落形成最多是30℃處理，其次是35℃處理，50℃處理PDA培養(yǎng)基中未長(zhǎng)出菌落，因此，大麗輪枝菌在50℃條件下10min水浴處理不能生長(zhǎng)，即其致死溫度為50℃（表1）。

3結(jié)論與討論

篇3

1.1致病力測(cè)定

(1)接種方法將葉片正面朝上均勻平鋪到20cm×30cm的保鮮盒內(nèi)。用大頭針在每片葉片沿主脈一側(cè)進(jìn)行針刺，在直徑2mm范圍內(nèi)均勻針刺5下，用直徑5mm的打孔器沿菌落邊緣打制成菌碟，置于針刺部位。接種時(shí)菌面朝下，與葉片緊貼。用吸飽蒸餾水的紙巾覆蓋葉柄保濕。每個(gè)保鮮盒接種20片葉為1個(gè)重復(fù)，以接PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)菌株作為1個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。接種后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。荔枝果實(shí)經(jīng)0.1%烯酰嗎啉溶液浸泡5min后，自然晾干，將果實(shí)均勻放置于保鮮盒內(nèi)，相互之間無擠靠。在果皮上直接接種菌碟，每個(gè)重復(fù)接種20個(gè)果實(shí)，以接PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。(2)指標(biāo)及統(tǒng)計(jì)方法葉片接種3天、果實(shí)接種5天后，采用十字交叉法測(cè)量單葉和單果的病斑直徑，并計(jì)算平均病斑直徑。以病斑直徑大小為依據(jù)，把各菌株的致病力分為4個(gè)等級(jí):病斑直徑=0cm，為無致病力;0cm＜病斑直徑＜0.6cm，為弱致病力;0.6cm≤病斑直徑≤1.2cm，為中致病力;病斑直徑＞1.2cm，為強(qiáng)致病力。統(tǒng)計(jì)各菌株在4類不同病斑直徑區(qū)間葉片或果實(shí)所占的百分比。平均病斑直徑用SAS單因子完全隨機(jī)分析，均值間采用Duncan檢驗(yàn)［13－14］。以各病斑直徑所占百分比及病斑直徑為指標(biāo)，進(jìn)行聚類分析［15］。

1.2菌株生物學(xué)特性比較

依據(jù)致病力比較結(jié)果，選取致病力最強(qiáng)和最弱的2個(gè)菌株進(jìn)行生物學(xué)特性比較研究。(1)菌絲形態(tài)和生長(zhǎng)速度經(jīng)單孢分離后的供試菌株長(zhǎng)至3天，用直徑0.5cm的打孔器打取菌碟，各菌株分別取1個(gè)菌碟接種于PDA平板中央，于28℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌絲形態(tài)，用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑，計(jì)算菌落每天的平均直徑。每個(gè)平板為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)。(2)分生孢子和分生孢子盤鑒定選取PDA平板培養(yǎng)7～14天的供試菌株，其菌落表面會(huì)長(zhǎng)出黑色的分生孢子盤及橙黃色的黏孢團(tuán)，挑取少量黑色小點(diǎn)及橙黃色黏狀物置于滴有無菌水的載玻片上進(jìn)行顯微鏡觀察。(3)產(chǎn)孢能力取直徑約0.5cm供試菌株的菌碟分別接種于含有100mLPDA液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)3～5天后，用孢子過濾器過濾收集孢子，定容至10mL，用血球計(jì)數(shù)板鏡檢孢子數(shù)。(4)孢子萌發(fā)率用無菌水配制濃度約為106個(gè)/mL供試菌株的孢子懸浮液。各取20μL孢子懸浮液，分別滴在載玻片左右兩邊，28℃恒溫保濕培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)3、6、9、12、15、18h時(shí)鏡檢分生孢子萌況，記錄萌發(fā)孢子數(shù)和未萌發(fā)孢子數(shù)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)觀察100個(gè)視野，計(jì)算孢子萌發(fā)率(萌發(fā)孢子數(shù)占總孢子數(shù)的百分?jǐn)?shù))，計(jì)算每個(gè)處理的平均值。

2結(jié)果與分析

2.1菌株致病力比較驗(yàn)證

2.1.1病斑直徑差異用供試的11個(gè)膠孢炭疽菌菌株對(duì)妃子笑幼葉、果實(shí)及大丁香幼葉進(jìn)行離體接種，結(jié)果如表2所示。同一菌株對(duì)妃子笑和大丁香2個(gè)品種葉片的致病力有一定差異，同一菌株對(duì)妃子笑的葉片和果實(shí)也表現(xiàn)出不同的致病力;不同菌株間對(duì)相同荔枝品種葉片和果實(shí)的致病力大部分存在顯著差異。從對(duì)葉片和果實(shí)的侵染能力看，菌株0977－19－2產(chǎn)生的病斑直徑均大于1.2cm，屬最強(qiáng)致病力菌株;菌株Litan－5和09619－1－1產(chǎn)生的病斑直徑均小于0.6cm，且兩者間無顯著差異，屬最弱致病力菌株。除0977－19－2外，其他菌株侵染果實(shí)產(chǎn)生的病斑直徑均小于侵染葉片產(chǎn)生的病斑直徑，說明多數(shù)菌株對(duì)葉片和果實(shí)的侵染力存在差異，即對(duì)葉片的侵染能力強(qiáng)于果實(shí)。綜合分析看，膠孢炭疽菌的致病力與其地理來源和寄主組織來源沒有必然相關(guān)性。2.1.2不同發(fā)病級(jí)別寄主組織上菌株的比率差異由于寄主組織的不同病斑直徑所占的百分比可反映出集中發(fā)病組織的情況，因此分別對(duì)葉片和果實(shí)及各自的病斑直徑關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果如表3所示。當(dāng)病斑直徑≥0.6cm時(shí)，各菌株在葉片上出現(xiàn)的比率遠(yuǎn)大于其在果實(shí)上出現(xiàn)的比率;當(dāng)病斑直徑＜0.6cm時(shí)，大部分菌株在葉片上出現(xiàn)的比率遠(yuǎn)小于其在果實(shí)上出現(xiàn)的比率，說明各供試菌株對(duì)葉片的致病力強(qiáng)于對(duì)果實(shí)的致病力。2.1.3聚類分析在聚類距離(歐氏距離)為3.3左右時(shí)，可將11株菌株分為4類:第1類含菌株0977－19－2，對(duì)果實(shí)與葉片都表現(xiàn)強(qiáng)致病力，果實(shí)和葉片在病斑直徑≥0.6cm時(shí)所占的百分比都在80%以上;第2類含菌株09626－3－1－1和09626－4－1－1，對(duì)葉片和果實(shí)都表現(xiàn)為中等致病力，葉片和果實(shí)在病斑直徑≥0.6cm時(shí)所占的百分比都大于50%;第3類可分成兩小類，菌株0958－8－6－1、09627－12－3－1、YongdaguoI－2－3對(duì)果實(shí)表現(xiàn)為弱致病力，對(duì)葉片表現(xiàn)為中致病力，葉片在病斑直徑≥0.6cm時(shí)所占的百分比約為80%，果實(shí)在0cm≤病斑直徑＜0.6cm時(shí)所占的百分比超過70%;其余的0958－7－1－1、09724－13－2、0977－15－1菌株對(duì)果實(shí)與葉片均表現(xiàn)中致病力，葉片在病斑直徑≥0.6cm時(shí)所占的百分比約為80%，果實(shí)在0cm≤病斑直徑＜0.6cm時(shí)所占的百分比為65%以上;第4類含菌株09619－1－1和Litan－5，對(duì)果實(shí)和葉片都表現(xiàn)為弱致病力(圖1)。綜合平均病斑直徑、不同病斑直徑組織的所占百分比及聚類分析結(jié)果，強(qiáng)致病力菌株有1株(0977－19－2)，弱致病力菌株有2株(09619－1－1、Litan－5)，其余菌株致病力均屬中等。

2.2不同致病力菌株的生物學(xué)特性比較

根據(jù)不同菌株在荔枝葉片和果實(shí)上的致病力試驗(yàn)結(jié)果，選擇強(qiáng)致病力菌株0977－19－2和弱致病力菌株09619－1－1進(jìn)行部分生物學(xué)特性比較。2.2.1菌絲形態(tài)和生長(zhǎng)速度的比較將單孢純化的強(qiáng)致病力菌株0977－19－2和弱致病力菌株09619－1－1在PDA平板上28℃培養(yǎng)，初期平板上長(zhǎng)出的菌絲為白色絨狀，培養(yǎng)至第7天時(shí)菌絲布滿全皿。隨菌齡的增長(zhǎng)，菌絲逐漸由白色轉(zhuǎn)為灰白色，最后變成黑褐色。2個(gè)菌株生長(zhǎng)速度無明顯差異。2.2.2分生孢子和分生孢子盤的比較強(qiáng)致病力菌株0977－19－2分生孢子盤呈碟形;分生孢子盤上密生的棒狀分生孢子梗無色，不分支，由頂端生出分生孢子，未見剛毛。分生孢子單胞，無色，橢圓形，兩端鈍圓，中間具1個(gè)或多個(gè)油球，內(nèi)含顆粒物，大小12.7～15.6μm×4.1～5.1μm。弱致病力菌株09619－1－1分生孢子盤散射狀;分生孢子梗緊密排列在分生孢子盤上。分生孢子單胞，無色，橢圓形，一般具1個(gè)油球，少數(shù)有2個(gè)，大小為12.3～15.8μm×3.2～4.6μm。2.2.3產(chǎn)孢量的比較從產(chǎn)孢量結(jié)果看，相同條件下強(qiáng)致病力菌株0977－19－2的產(chǎn)孢量約為17.750×106個(gè)/mL，弱致病力菌株09619－1－1產(chǎn)孢量約為5.635×106個(gè)/mL，前者的產(chǎn)孢量顯著高于后者。2.2.4孢子萌發(fā)率的比較培養(yǎng)3h后，2個(gè)菌株的分生孢子開始萌發(fā)。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，孢子萌發(fā)率都呈增長(zhǎng)趨勢(shì);培養(yǎng)6h后強(qiáng)致病力菌株0977－19－2分生孢子萌發(fā)率達(dá)11.40%，弱致病力菌株09619－1－1的分生孢子萌發(fā)率僅為4.20%;培養(yǎng)18h時(shí)，強(qiáng)致病力菌株0977－19－2的孢子萌發(fā)率達(dá)89.65%，弱致病力菌株09619－1－1的孢子萌發(fā)率為65.43%。在整個(gè)觀察期內(nèi)，強(qiáng)致病力菌株0977－19－2的孢子萌發(fā)率都明顯高于弱致病力菌株09619－1－1。

3結(jié)論與討論

篇4

關(guān)鍵詞：生姜；結(jié)群腐霉；形態(tài)特征；ITS序列分析；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)： S632.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006—6500.2012.05.007

Study on Identification and Biological Characteristics of the Pathogen Causing Rhizome Rot Disease in Ginger

SUN Xia， FANG Tao， QIN Yan

（Biotechnology Institute， Laiwu College for Vocational Technology， Laiwu， Shandong 271100，China）

Abstract： The suspected pathogen was studied by pathogenicity test， morphology identification and ribosomal DNA— ITS sequence analysis in the article. The results showed that the pathogen of ginger rot disease in Shandong was identified as Pythium myriotylum. The temperature range of the pathogen was 1～35 ℃， the suitable culture temperature was 25 ℃， and suitable pH value was 7.

Key words： ginger； Pythium myriotylum； morphological identification； ITS sequence analysis； biological characteristics

生姜莖基腐病是近年來山東生姜產(chǎn)區(qū)發(fā)生的一種新病害，該病從生姜出苗1～2個(gè)月開始發(fā)生，首先表現(xiàn)為莖基部變黑、腐爛，而地上莖葉仍為綠色，隨后老葉變黃萎蔫。在盛發(fā)期，基部變黑2～3 d后，莖基部完全腐爛，從老姜處齊斷，病株死亡，當(dāng)?shù)厝诵蜗蟮胤Q為“爛脖子”病。 據(jù)筆者調(diào)查，該病從2005年開始陸續(xù)在山東萊蕪、安丘、萊陽等地發(fā)生，并逐漸上升為主要病害，田間病株率在5%～80%之間，嚴(yán)重地塊造成絕產(chǎn)。由于該病從出苗后就開始發(fā)生，并很快致使姜塊腐爛而失去應(yīng)用價(jià)值，給姜民帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重挫傷了姜農(nóng)種植的積極性。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)生姜莖基腐病病原菌的報(bào)道較少，為此，筆者通過對(duì)生姜莖基腐病病原菌的分離、純化，從病原菌的形態(tài)學(xué)、致病性、生物學(xué)和分子生物學(xué)方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，旨在為生姜莖基腐病的預(yù)防和防治奠定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病原菌的分離和培養(yǎng)

生姜出苗1～2個(gè)月后，從萊蕪市郊各姜田采集具有典型癥狀的病樣。采用組織分離法對(duì)病斑上的病菌進(jìn)行分離，在玉米瓊脂培養(yǎng)基（CMA）上培養(yǎng)，然后采用單菌絲先端切割的方法進(jìn)一步純化、培養(yǎng)。借鑒觀察鏈格孢（Alternaria Nees） sporulation pattern的方法，對(duì)孢子囊、卵孢子及藏卵器進(jìn)行觀察，并顯微照相[3]。

1.2 致病性測(cè)定

采用土埋法[4]進(jìn)行致病性測(cè)定。將完好無病害的生姜種于裝有滅菌土的培養(yǎng)缽中，將純化后的菌株在CMA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，用直徑0.7 cm的打孔器打出菌片，取一片接種到植株基部，然后覆蓋一層滅菌土。適時(shí)澆水，保持一定的土壤濕度，在25 ℃培養(yǎng)，以不接菌為對(duì)照，記錄發(fā)病癥狀。

1.3 分子生物學(xué)方法鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取 采用改良CTAB法提取DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 利用真菌核糖體rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS） PCR擴(kuò)增的通用引物ITS1（5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGC—3’）和ITS4 （5’—TCCTCCGCTTTTG ATATG C—3’） 對(duì)提取的真菌總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR Buffer 5 μL，10 mmol·L—1 dNTP mix 1 μL， 模板DNA溶液10 pmol，5 U·μL—1 Taq 酶0.25 μL，10 μmol·L—1 ITS1和ITS4引物各1 μL 。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 35 s，55 ℃退火 35 s，72 ℃ 延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行純化和序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果在GenBank中利用Blast軟件進(jìn)行序列比較分析。

1.4 生物學(xué)特性研究

篇5

關(guān)鍵詞:十四點(diǎn)負(fù)泥蟲;蘆筍;生物學(xué)特性;防治方法

中圖分類號(hào):S433 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1674-0432(2010)-05-0035-2

十四點(diǎn)負(fù)泥蟲 Crioceris quatuordecimpunctata (scopoli)屬鞘翅目負(fù)泥科。別名蘆筍葉甲、細(xì)頸葉甲,是蘆筍的主要害蟲之一。

一、分布與寄主

十四點(diǎn)負(fù)泥蟲國(guó)內(nèi)在黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西(華縣、西安魚化寨),北京(密云、懷柔、順義等區(qū)縣),河北的唐山、秦皇島、承德、衡水、邯鄲,山東的煙臺(tái)市,江蘇、浙江、福建、廣西(桂林、南寧、百色等地區(qū)),山西(定襄縣)等省區(qū)均有發(fā)生,國(guó)外主要分布于俄羅斯的西伯利亞和歐洲東部、朝鮮、日本等地。

十四點(diǎn)負(fù)泥蟲為多食性害蟲,主要危害蘆筍,同時(shí)還取食與蘆筍同屬的植物,如文竹、天冬草、龍須菜、南玉帚,此外室內(nèi)喂養(yǎng)發(fā)現(xiàn)可食小麥。

二、危害癥狀

十四點(diǎn)負(fù)泥蟲對(duì)蘆筍可產(chǎn)生嚴(yán)重危害,幼蟲和成蟲均可為害,多從蘆筍側(cè)枝中部開始將莖皮啃成缺刻,啃食蘆筍的嫩莖、母莖或秋莖表皮、擬葉,破壞輸導(dǎo)組織,造成嫩莖彎曲、畸形,筍株變矮,分枝和擬葉叢生,嚴(yán)重時(shí)可將地上時(shí)植株的嫩莖和葉莖全被吃光,僅剩下光禿的主莖,以致生長(zhǎng)緩慢,減產(chǎn)失收,甚至整株枯死。

三、生活習(xí)性

十四點(diǎn)負(fù)泥一年發(fā)生的代數(shù)及發(fā)生規(guī)律因地區(qū)、栽培方式不同而有較大差異。在我國(guó)一年發(fā)生2-5代,世代重疊現(xiàn)象較為突出,從第二代成蟲以后,各蟲態(tài)發(fā)育期極不整齊,在同一筍園內(nèi), 同一時(shí)期內(nèi)可發(fā)現(xiàn)成蟲、卵、幼蟲、蛹的不同蟲態(tài)。

以成蟲在筍盤四周的土下或殘留在地下的枯莖里越冬,翌春氣溫回升后出土活動(dòng),越冬代成蟲交尾后產(chǎn)卵,卵散產(chǎn)于新出筍的鱗葉內(nèi)側(cè)、筍尖或嫩葉上。幼蟲共4齡,初孵幼蟲灰黑色,二齡幼蟲起為淡黃色,幼蟲行動(dòng)慢,4齡進(jìn)入暴食期, 可在短時(shí)間內(nèi)將蘆筍擬葉吃光,造成植株枯死,老熟后鉆入土中2-3cm處化蛹。成蟲有假死性,可以進(jìn)行3-5m的短距離飛行。越冬代成蟲在秋季羽化后,氣溫偏高時(shí),棲于地上筍尖部位,氣溫下降時(shí)入土越冬。

四、防治方法

(一)嚴(yán)格檢疫

目前十四點(diǎn)負(fù)泥蟲只在局部地區(qū)發(fā)生,應(yīng)將該種害蟲列入檢疫對(duì)象。從十四點(diǎn)泥蟲發(fā)生區(qū)內(nèi)向外調(diào)運(yùn)果蔬苗木時(shí),應(yīng)進(jìn)行檢疫,以防攜帶傳播。

(二)農(nóng)業(yè)防治

清潔筍園,冬前或翌春及時(shí)清除筍田枯枝落葉,中耕培土護(hù)根,拔除枯莖集中燒毀,消滅越冬成蟲。在冬季最寒冷的時(shí)間灌大水,以壓低越冬蟲口基數(shù)。加強(qiáng)筍園的田間管理,及時(shí)施肥、松土,增強(qiáng)植株的抗病蟲能力,選擇向陽,開闊,周圍無高大樹術(shù)或建筑物的地塊種植,發(fā)生嚴(yán)重的地塊應(yīng)進(jìn)行移栽或輪作。

(三)物理人工防治

誘捕早春出蟄活動(dòng)的成蟲?？稍趫@內(nèi)按一定距離投放廢筍。一般是上午8-9時(shí)投撒,下午l-2時(shí)收采捕殺。幼蟲活動(dòng)性差,爬行緩慢,成蟲在清晨也很少飛翔,在其取食為害時(shí)極容易捕捉,利用成蟲的假死性用捕蟲網(wǎng)捕殺,效果也較好。

(四)生物防治

寄生性天敵。如赤眼蜂,彎尾姬蜂Diadegma Japonica Sonan,嚙小蜂,注意保護(hù)天敵,還可人工釋放負(fù)泥蟲金小蜂Trichomalopsis shirakii Crawford寄生幼蟲;捕食性天敵。如蝗螂、獵蝽,卵盛期田間還可見各種瓢蟲以負(fù)泥蟲卵為食;動(dòng)物天敵。如蜘蛛、麻雀、雞,都可取食十四點(diǎn)負(fù)泥蟲。

(五)化學(xué)防治

越冬成蟲出土孵化盛期,可普遍噴施一次藥,特別是育苗田及不采筍的田塊,對(duì)減少越冬代蟲口密度,控制全年發(fā)生為害程度具有顯著的效果。藥劑可選用噴散40%氧化樂果800-1000倍液,80%敵敵畏1500倍液,殺蟲效果可達(dá)90%以上。在采筍期間可按一定面積投放毒餌(廢蘆筍:40% 樂果=100:l制成)誘殺 成蟲。也可以每667用30%辛硫磷顆粒劑2-3公斤撒施于筍盤周圍,殺死出土成蟲。

幼蟲孵化盛期和幼蟲為害高峰期防治該蟲的關(guān)鍵時(shí)期。由于其低齡幼蟲抗藥性很差,故此期也是化學(xué)防治的適期,應(yīng)及時(shí)在一代卵孵化盛期進(jìn)行防治。90%敵百蟲l000-1500倍或80%敵敵畏乳油1500倍液進(jìn)行防治,殺蟲效果很好,24小時(shí)的死亡率就可達(dá)90%以上。在采筍后噴施1%魚藤酮DP,0.3%綠晶牌印楝素EC500倍或0.6%苦參堿1000倍或2%阿維菌素5000倍或10%吡蟲啉可濕性粉劑1500-2000倍液,進(jìn)行噴霧防治。在當(dāng)年最后一次采筍后,幼蟲進(jìn)入暴食期的幼齡期施藥,可以選用48%樂斯本EC1500倍液、90%杜邦萬靈2000倍或2.5%敵殺死EC1500-2000倍噴霧。

參考文獻(xiàn)

[1]黃家德,丘鳳波.蘆筍負(fù)泥蟲的初步觀察[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),1990,5:33-35.

[2]李力.陜西負(fù)泥蟲分類的初步研究(鞘翅目:負(fù)泥蟲科)[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào),2003,31(4).

[3]張金良,王志杰,楊建國(guó),等.蘆筍十四點(diǎn)負(fù)泥蟲發(fā)生規(guī)律與防治技術(shù)初探[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2006,22(2):338-339.

[4]李術(shù)臣,賈海民,趙聚瑩.河北省蘆筍主要病蟲害種類及為害調(diào)查[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,13(4):28-29,31.

[5]李元良,田桂英,鄭建強(qiáng).蘆筍上的14點(diǎn)負(fù)泥蟲生物學(xué)特性觀察及藥效試驗(yàn)[J].萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1992,9(1):57-60.

[6]楊秀林,牛澤民.蘆筍田14點(diǎn)葉甲的防治方法[J].山西農(nóng)業(yè).2004,(11):33.

[7]康克功,王志軍.蘆筍葉甲的形態(tài)習(xí)性與防治[J].西北園藝.1998(6):43.

[8]夏淑春,鄢洪海.蘆筍十四點(diǎn)負(fù)泥蟲的發(fā)生及防治[J].吉林蔬菜.1999,(5):18.

[9]尹國(guó)香.石刁柏田十四點(diǎn)負(fù)泥蟲發(fā)生規(guī)律及防治方法[J].中國(guó)蔬菜,1994(1):32-34.

[10]張寧,李曉娜.五種殺蟲劑對(duì)蘆筍十四點(diǎn)負(fù)泥蟲的毒力測(cè)定[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào),2008,23(6).

[11]郭艷娟,武玉剛,隋龍崗.蘆筍十四點(diǎn)負(fù)泥蟲的發(fā)生與防治[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè),2007,8:9.

[12]藺中祥.十四點(diǎn)負(fù)泥蟲的發(fā)生與防治[J].植保技術(shù)推廣,1996,16(2):21-22.

[13]韓崇文,趙慧艷,張立波.農(nóng)村實(shí)用科技信息[J].2008(2):20.

[14]李術(shù)臣,賈海民,趙聚瑩.河北省蘆筍主要病蟲害種類及為害調(diào)查河北農(nóng)業(yè)科學(xué)[J].2009,13(4):28-29,31.

[15]康克功,王志軍.蘆筍葉甲的形態(tài)習(xí)性與防治[J].西北園藝,1998(6):43.

[16]虞國(guó)躍.十四點(diǎn)負(fù)泥蟲[J].蔬菜VEGETABLES,2003,10:21.

[17]續(xù)芝芳,張志平.蘆筍負(fù)泥蟲的綜合防治[J].山西農(nóng)業(yè),2003,11(31):41.

[18]楊春清,樊瑛.柏負(fù)泥蟲的初步研究[J].植物保護(hù),1996年第1期:20-22.

基金項(xiàng)目:湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(Q200612003)。

篇6

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓;生物學(xué)特性;栽培技術(shù)

藍(lán)莓果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,且有預(yù)防血管老化、強(qiáng)心抗癌及明目等保健作用?；谒{(lán)莓的獨(dú)特保健功效及廣闊的市場(chǎng)前景,世界各地興起了藍(lán)莓的栽培熱潮。筆者根據(jù)近幾年栽培實(shí)踐,將藍(lán)莓的生物學(xué)特性及栽培技術(shù)總結(jié)如下。

1藍(lán)莓的生物學(xué)特性

1.1藍(lán)莓的主要栽培種類

藍(lán)莓為杜鵑花科越桔屬植物,全世界約400個(gè)種,我國(guó)約91個(gè)種28個(gè)變種,主要分布于東北和西南地區(qū)。

目前,已栽培利用的主要有3個(gè)種類:高叢藍(lán)莓、矮叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓[1]。

高叢藍(lán)莓主產(chǎn)于北美溫帶、亞熱帶,是目前全世界人工栽種面積最大的藍(lán)莓種類。高叢藍(lán)莓又分北方高叢、南方高叢和半高叢等。南方高叢藍(lán)莓需要低溫休眠的時(shí)間短,適合南方種植;半高叢藍(lán)莓是高叢藍(lán)莓與矮叢藍(lán)莓的雜交種,樹高一般為0.7～1.5m,適于休眠期較長(zhǎng)、寒冷的北方種植;北方高叢藍(lán)莓適宜于在休眠期稍長(zhǎng)的北方種植,樹高通常2～3m。

矮叢藍(lán)莓主要分布于美國(guó)東北部和加拿大東部沿海地區(qū),以野生資源為主,樹高不足0.5m,適宜北方寒冷地區(qū)種植,它分布在高叢藍(lán)莓的北界。

兔眼藍(lán)莓原產(chǎn)北美洲亞熱帶地區(qū),樹高2～5m,樹勢(shì)旺盛,抗旱,耐熱,長(zhǎng)壽,豐產(chǎn),對(duì)土壤酸度的要求幅度寬些,休眠期與需水期均較短,適合我國(guó)南方地區(qū)栽培。

所有藍(lán)莓均喜光,在排水良好,并富含有機(jī)質(zhì)的酸性土壤(pH值4.2～5.5)上生長(zhǎng)良好。

1.2藍(lán)莓的形態(tài)特征

藍(lán)莓為灌木,樹體大小及形態(tài)差異顯著。樹高0.3～5.0m,多年叢生,有常綠也有落葉,單葉互生,葉全緣或有鋸齒?；ü诔３蕢位蜮徯巍；ò昊柯?lián)合,外緣4裂或5裂,白色或粉紅色,雄蕊8～10個(gè),短于花柱,由昆蟲或風(fēng)媒授粉,花序多為總狀花序。多數(shù)品種成熟時(shí)果實(shí)呈藍(lán)黑色,有的品種為紅色;果實(shí)有球形、橢圓形、扁圓形或梨形,平均單果重0.5～2.5g。果肉細(xì)軟,多漿汁。種子細(xì)小,食用時(shí)可隨果肉食下不影響口感,根系多而纖細(xì),粗壯根少,分布淺,沒有根毛[2]。

1.3藍(lán)莓的生長(zhǎng)、開花和結(jié)實(shí)習(xí)性

藍(lán)莓在一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)內(nèi)可多次生長(zhǎng),以二次生長(zhǎng)較為普遍。在我國(guó)南方,藍(lán)莓1年有2次生長(zhǎng)高峰,第1次是在5～6月,第2次是在7月中旬至8月中旬。幼苗栽植后第3年生長(zhǎng)明顯加快,新枝萌發(fā)多并生長(zhǎng)旺盛,年生長(zhǎng)量可達(dá)1m以上。

當(dāng)年生枝頂端多形成花芽,花芽從頂端向下進(jìn)行分化,每一枝條可分化的花芽數(shù)與品種和枝條粗度有關(guān),高叢藍(lán)莓一般4～7個(gè),兔眼藍(lán)莓3～6個(gè);花芽在節(jié)上以單生為主。各種藍(lán)莓的花芽分化期不同,矮叢藍(lán)莓和高叢藍(lán)莓在7～8月開始分化,兔眼藍(lán)莓從6月中旬開始;9月底至10月初,藍(lán)莓的花芽分化已經(jīng)完成。從形態(tài)上看,藍(lán)莓花芽肥大,呈橢圓形或近球形。花芽以下為一些窄尖的營(yíng)養(yǎng)芽和休眠芽。

藍(lán)莓的開花期因氣候和品種有明顯的差異,正常年景藍(lán)莓在我國(guó)南方3月上、中旬開花,北方為4～5月;花期一般15～20d,最長(zhǎng)達(dá)40d?；ㄔ谝粋€(gè)伸長(zhǎng)的軸上著生,構(gòu)成總狀花序?；ㄩ_的同時(shí)營(yíng)養(yǎng)芽開始發(fā)育成營(yíng)養(yǎng)枝,營(yíng)養(yǎng)枝生長(zhǎng)到一定程度(長(zhǎng)度不等)便停止生長(zhǎng),頂端最后一個(gè)細(xì)尖的幼葉變黑成黑尖,黑尖約2周左右脫落,至2～4周后,位于黑尖下的營(yíng)養(yǎng)芽長(zhǎng)出新枝,并具有頂端優(yōu)勢(shì),即實(shí)現(xiàn)枝條的轉(zhuǎn)軸生長(zhǎng),這種轉(zhuǎn)軸生長(zhǎng)在南方一年有3～5次。夏季最后1次新梢上緊挨黑尖的一個(gè)芽原始體逐漸增大發(fā)育成花芽,占據(jù)了頂端的位置。從枝頂花芽往下還能形成多個(gè)花芽,第2年春天開花并結(jié)果。其下的營(yíng)養(yǎng)芽又發(fā)育成營(yíng)養(yǎng)枝,而結(jié)過果實(shí)的短小枝秋后逐漸干枯、脫落。

藍(lán)莓多為異花授粉植物。高叢藍(lán)莓自交可孕,但可孕程度在品種間有明顯差異;而兔眼藍(lán)莓和矮叢藍(lán)莓一般自交不孕,因此在生產(chǎn)上須考慮多品種搭配建園,以提高產(chǎn)量。藍(lán)莓的花受精后,子房迅速膨大,大約1個(gè)月后增大趨于停止,之后漿果保持綠色,體積僅稍有增長(zhǎng)。當(dāng)漿果進(jìn)入變色期與著色期后,漿果增大迅速,可使果徑增長(zhǎng)50%。在著色以后,漿果還能再增長(zhǎng)20%,且甜度和風(fēng)味變得適中。同一果穗上的果實(shí)不同時(shí)成熟,果穗頂部、中部的果實(shí)先熟,成熟時(shí)間一般在6～8月。同一品種和同株樹上的果實(shí)成熟期一般在30d左右;在貴州麻江和江蘇南京,兔眼藍(lán)莓早熟品種6月中旬開始成熟,晚熟品種7月上、中旬開始成熟[3]。

2栽培技術(shù)

2.1園地選擇

根據(jù)藍(lán)莓的生態(tài)適應(yīng)性,先確定適栽區(qū)域,即氣候條件適宜區(qū),然后進(jìn)行種植地塊的選擇。在選擇種植地塊時(shí)要首先了解或測(cè)定土壤pH;其次,要盡可能選擇土壤疏松、富含有機(jī)質(zhì)而且排灌條件良好的地方,若是山地要盡量選擇陽坡中、下部,坡度不宜超過15°,大于15°時(shí)要修筑2m寬的梯田;立地類型以荒山地、低產(chǎn)松林改造地最佳,坡地退耕也可。但退耕地的栽植成活率不如松林改造地的成活率高,而且病蟲害和雜草也比松林改造林地多,使生產(chǎn)管理成本增大。在南方丘陵山區(qū),結(jié)合商品林基地建設(shè),推廣種植藍(lán)莓,既能改善生態(tài)環(huán)境,又調(diào)整了林種結(jié)構(gòu),還可以增加山區(qū)群眾的經(jīng)濟(jì)收入[4]。

2.2品種配置與定植時(shí)間

異花授粉是提高藍(lán)莓產(chǎn)量和果實(shí)大小的重要因素之一,高叢藍(lán)莓自花結(jié)實(shí)率高,而矮叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓多數(shù)品種自花結(jié)實(shí)率極低或不結(jié)實(shí)。異花授粉可使高叢藍(lán)莓的坐果率從67%提高到82%,使兔眼藍(lán)莓從18%提高47%。因此,在藍(lán)莓的種植園內(nèi),至少需配置2個(gè)以上品種相互授粉,以提高產(chǎn)量和品質(zhì)。授粉樹配置比例一般為2～3∶1,即主栽品種2～3行,授粉品種1行。

在冬季不很干旱的南方,以秋季至早春萌動(dòng)前定植最好。一年生苗的定植深度在15～20cm,而且要扶土踩緊壓實(shí),做到“三扶兩踩一提苗”。在秋冬季干旱的地方以雨季到來時(shí)定植為宜;有灌溉條件的地方,一年四季均可定植。在貴州麻江夏季定植,也能達(dá)到95%以上的成活率。

2.3定植密度與整地

高叢藍(lán)莓定植密度以1.0～1.5m×2.0～3.0m為宜;兔眼藍(lán)莓常選擇1.5m×2.0～2.5m;半高叢藍(lán)莓選擇0.6～1.2m×2.0m。在國(guó)外,實(shí)際栽培密度常根據(jù)機(jī)械化程度而定。我國(guó)南、北方,可以根據(jù)實(shí)際經(jīng)營(yíng)目標(biāo)選擇適宜的密度。

定植前挖定植穴稱為整地,整地(定植穴)規(guī)格為1.0m×1.0m×0.5m(長(zhǎng)×寬×深)。種植半高叢藍(lán)莓和矮叢藍(lán)莓可適當(dāng)縮小整地規(guī)格,對(duì)兔眼藍(lán)莓可適當(dāng)增大整地規(guī)格。定植穴挖好后,將取出的泥土摻入磨碎的松樹皮和泥炭或松林下的腐殖土等,混合均勻后回填入穴內(nèi),回填土要以高出地面20～30cm為宜,在土壤酸度不夠的情況下可摻入適量硫磺粉。

3參考文獻(xiàn)

篇7

【摘要】 為了了解凍存復(fù)蘇過程對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cell，MSC) 生物學(xué)特性和支持造血能力的影響，采用常規(guī)方法分離培養(yǎng)骨髓MSC，將傳代后的細(xì)胞用含10％二甲亞砜、40％胎牛血清的IMDM細(xì)胞凍存液保存在-196℃液氮中，觀察短期（4周）和中期（9-15月）復(fù)蘇后MSC的活性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力，并同凍存前的MSC進(jìn)行比較。 結(jié)果表明：中短期凍存后的MSC的細(xì)胞活性分別為(90士3.75)％和(93士2.51)％；凍存后細(xì)胞的增殖能力、免疫表型、體外分化為脂肪和骨細(xì)胞的能力、支持集落（CFU-GM，CFU-E，CFU-GEMM）的生長(zhǎng)作用和凍存前MSC相似。結(jié)論：骨髓MSC在液氮中短期和中期保存后，細(xì)胞活性略有下降，但是并不影響MSC的增殖、分化和支持造血能力。

【關(guān)鍵詞】 支持造血

Biological Characteristics and Ability of Supporting Hematopoiesis of Bone Marrow Mesenchymal

Stem Cells Pre-and Post-Cryop-reservation

Abstract This study was aimed to observe the biological characteristics of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cell (MSC) and to examine their abilities to support in vitro hematopoiesis.Bone marrow MSC were cryopreserved in -196℃ liquid nitrogen for 4 weeks (short term) and 9-15 months (medium term) with IMDM containing 10% DMSO，40% fetal calf serum as cryoprotectant.The viability，proliferation，immunophenotype，in vitro differentiation and ability of supporting hematopoiesis of thawed MSC were investigated and compared with these of pre-cryopreserved MSC.The results showed that the cell viability were (93士2.51)％ and (90士3.75)％ for MSC cryopreserved as long as 4 weeks or 9-15 months respectively.However，there were no changes detected，as compared with pre-cryopreserved MSC in immunophenotype，abilities of proliferation and supporting colony forming of CFU-GM，CFU-E and CFU-GEMM.It is concluded that bone marrow-derived MSC can be stored in liquid nitrogen for short-term (4 weeks) or medium-term (9-15 months) without changes of abilities of proliferation，differentiation and hematopoiesis support.

Key words cryopreservation; mesenchymal stem cell； hematopoiesis support

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有多向分化和支持造血的能力，而且來源廣泛，容易在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床并顯示了良好的治療效果［1-4］。將培養(yǎng)后的MSC凍存，在患者需要MSC治療時(shí)給予輸注，具有很好的臨床應(yīng)用前景。但是，凍存是否會(huì)影響MSC的生物學(xué)特征，我們尚不清楚。因此，本研究將骨髓來源的MSC凍存于-196℃液氮中，觀察中期和短期凍存后MSC的增殖、分化和支持造血的能力并同凍存前的MSC進(jìn)行比較，為進(jìn)一步在臨床中的應(yīng)用提供詳盡的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

試劑

IMDM、DMEM、DF12、MCDB培養(yǎng)液、胎牛血清、馬血清和甲基纖維素均為Gibco公司產(chǎn)品。鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR抗體購(gòu)自PharMingen公司; rh-SCF、 GM-CSF、 EPO、 IL-3購(gòu)自Peprotech公司;胰酶、EDTA、全反式維甲酸、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（IBMX）和二甲亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司。

MSC的分離和培養(yǎng)

骨髓來自8例健康志愿者（年齡18-34歲，平均29歲）。髂后上棘抽取骨髓，用淋巴細(xì)胞分離液（密度1.077）400×g 離心20分鐘，取白環(huán)以上細(xì)胞部分，計(jì)數(shù)后接種于含40% MCDB、2% FCS的DF12培養(yǎng)液中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后換液，去除未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，常規(guī)消化傳代。

MSC的凍存和復(fù)蘇

將1×106細(xì)胞加入含10％ DMSO和40% FCS的IMDM中，總體積1.8 ml。先置于-80℃冰箱中，第二天轉(zhuǎn)入-196℃中凍存。將中期9-15個(gè)月（平均13個(gè)月）和短期（4周）凍存的MSC置于37℃水浴中快速?gòu)?fù)溫，凍融后加入8 ml IMDM混勻后離心，然后再用IMDM洗滌1次，置于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天，更換新鮮培養(yǎng)液。

細(xì)胞活性和增殖能力測(cè)定

應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)拒染回收率（TBR）試驗(yàn)檢測(cè)復(fù)蘇細(xì)胞的活性，TBR(%)＝凍存后活細(xì)胞計(jì)數(shù)/凍存前活細(xì)胞計(jì)數(shù)×臺(tái)盼藍(lán)拒染率×100％。將凍存前后的MSC接種在24孔板中（5×103細(xì)胞/孔），置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1天取2孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，繪制生長(zhǎng)曲線。

細(xì)胞免疫表型分析

用含20 g/L BSA的PBS將胰酶消化后的MSC制成1×106 cells/ml的細(xì)胞懸液。每個(gè)上機(jī)試管中加入500 μl細(xì)胞懸液，先加入鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR單克隆抗體，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，于4℃孵育30分鐘，PBS洗3遍。再加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，4℃孵育30分鐘，PBS洗4遍，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用cellquest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。

體外誘導(dǎo)多向分化檢測(cè)

成骨誘導(dǎo) 將5×104細(xì)胞接種于6孔板中，加入含10-7mol/L地塞米松、10 mol/L β磷酸甘油、0.05 mol/L維生素C和10% FCS的IMDM，3周后應(yīng)用von Kossa染色檢測(cè)鈣化小結(jié)。

脂肪誘導(dǎo) 將5×104細(xì)胞接種于6孔板中，加入含10-6 mol/L地塞米松、0.5 mol/L IBMX 、0.1 mol/L維生素C和10% FCS的IMDM，7天后油紅O染色檢測(cè)脂肪滴。

支持造血的能力測(cè)定

將凍存前后的骨髓MSC用10.0 Gy 60Co γ線照射，然后更換為長(zhǎng)期培養(yǎng)液（含12.5％ FCS、 12.5%馬血清、2 mmol/L谷氨酰胺、10-6 mol/L 氫化考的松的IMDM）。獲取健康人骨髓單個(gè)核細(xì)胞，預(yù)先培養(yǎng)4小時(shí)以去除貼壁細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞按照1×106/ml接種在照射后的MSC中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每周半量換液。4周后獲取全部細(xì)胞接種于甲基纖維素體系中測(cè)定其集落形成能力。培養(yǎng)體系為: IMDM中含30%馬血清、1% BSA，2 mmol/L谷氨酰胺、1×10-4/L β2巰基乙醇、1%甲基纖維素和重組細(xì)胞因子。細(xì)胞因子包括: rhSCF 50 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，GM-CSF 50 ng/ml 和EPO 4 U/ml。集落形成實(shí)驗(yàn)在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)14天。每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞。14天后在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)集落，50個(gè)以上細(xì)胞為1個(gè)集落。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較應(yīng)用方差分析。

結(jié) 果

骨髓MSC的形態(tài)特征和生長(zhǎng)特點(diǎn)

于倒置顯微鏡下，凍存前骨髓MSC為成纖維樣，胞漿豐富，核染色質(zhì)細(xì)，核仁明顯，平行排列或旋渦樣生長(zhǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，骨髓MSC的倍增時(shí)間約為42.03士2.41小時(shí)。細(xì)胞形態(tài)和倍增時(shí)間隨著細(xì)胞傳代并不發(fā)生改變。

凍存后MSC的活性率和增殖能力

骨髓MSC的活性率（TBR）隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)略有下降。短期凍存MSC的TBR為93士2.51％；中期凍存MSC的TBR為90士3.75％。二者之間并沒有顯著性差異。凍存后MSC的增殖能力同凍存前相比較，沒有明顯差異。依據(jù)生長(zhǎng)曲線可以得出短期和中期凍存后骨髓MSC的倍增時(shí)間分別為39.54士3.53小時(shí)和41.64士1.68小時(shí)。

凍存前后MSC的免疫表型

通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)凍存前后骨髓MSC的免疫表型發(fā)現(xiàn)，凍存前后MSC均表達(dá)CD29、CD44、CD105，而CD11b、CD31、CD34、CD45和HLA-DR均為陰性(表1)。CD分子的表達(dá)量在凍存前后略有不同，但均不存在顯著性差異。Table 1.Flow-cytometric phenotype analysis of adult bone marrow derived MSC before and after cryopreservation（略）

多系分化的鑒定

成骨分化 2周后細(xì)胞聚集成集落，并有少量鈣鹽沉積，繼續(xù)培養(yǎng)1周，細(xì)胞呈現(xiàn)多層生長(zhǎng)的結(jié)節(jié)狀，并有大量鈣鹽沉積，而對(duì)照組細(xì)胞仍為單層生長(zhǎng)，無鈣鹽沉積。von Kossa 染色證實(shí)為鈣鹽沉積(圖A)，對(duì)照組無上述現(xiàn)象出現(xiàn)。

成脂肪分化 3-5天后發(fā)現(xiàn)少量細(xì)胞中有小脂肪滴出現(xiàn)，繼續(xù)誘導(dǎo)，1周后可以看見大部分細(xì)胞胞體變大，胞漿出現(xiàn)大量脂肪滴，油紅O染色證實(shí)為脂肪滴(圖B)，而對(duì)照組細(xì)胞胞漿中無脂肪滴出現(xiàn)，油紅O染色為陰性。

凍存后的MSC同樣具有成骨和成脂肪分化能力(圖C，D)。

支持造血作用

為了評(píng)估凍存是否影響MSC支持造血的能力，將骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于照射過的凍存前和復(fù)蘇的MSC中，在長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)液中培養(yǎng)4周后檢測(cè)CFU生成情況。如表2所示，凍存前后MSC均具有支持造血作用。CFU-GM，CFU-E和CFU-GEMM的產(chǎn)率在以凍存前、短期凍存和中期凍存后MSC為滋養(yǎng)層的骨髓長(zhǎng)期培養(yǎng)體系中并無顯著性差異。Table 2.Hematopoiesis supported by MSC in long term bone marrow culture（略）

討 論

MSC是造血微環(huán)境中主要組成部分，通過合成、分泌多種造血因子和黏附分子來調(diào)控造血干細(xì)胞的增殖、分化和自我更新。既往研究顯示，MSC可以合成并分泌多種造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有維持長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LTC-IC)的能力，促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖和分化［5］。聯(lián)合MSC的移植方案還可以促進(jìn)HSC的植入和移植后的造血恢復(fù)［6］。但是，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增中，MSC的增殖能力會(huì)逐漸下降并發(fā)生分化，支持造血的能力減弱。將擴(kuò)增后或者增殖旺盛的MSC進(jìn)行凍存，在需要的時(shí)候復(fù)蘇培養(yǎng)，可以有效地解放上述問題并確保提供足夠的MSC應(yīng)用于臨床。

既往的大量研究顯示，造血干細(xì)胞可以在液氮中長(zhǎng)期凍存，復(fù)蘇后仍然具有良好的造血重建能力。但是，MSC經(jīng)過低溫凍存和復(fù)蘇，其增殖和分化能力、支持造血功能是否受影響，尚不明確。因此，我們觀察了骨髓MSC經(jīng)過短期（4周）和中期（9-15月）凍存后的生物學(xué)特性和支持造血能力。結(jié)果顯示，經(jīng)過中期和短期凍存后MSC的形態(tài)并未發(fā)生改變，仍為梭形，貼附在培養(yǎng)瓶底。凍存后MSC的活性略有下降，但凍存并不影響細(xì)胞的增殖能力，凍存前和中期、短期凍存后MSC的倍增時(shí)間在40小時(shí)左右，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不具有顯著性差異。通過FACS檢測(cè)，凍存前后的MSC的免疫表型沒有明顯改變，表現(xiàn)為CD29、CD44和CD105為陽性，而CD11b、CD34、CD31、CD45、和HLA-DR為陰性。多向分化能力是MSC的主要特征之一，我們將經(jīng)過中期和短期凍存后MSC誘導(dǎo)向脂肪和骨分化，結(jié)果顯示凍存后MSC仍然具有向脂肪和骨分化的能力，而且這種分化能力，并不隨著復(fù)蘇后細(xì)胞的傳代而發(fā)生變化。由此可見，中期和短期凍存并不影響MSC的生物學(xué)特性。

支持造血是骨髓MSC的重要功能之一，凍存后MSC支持造血能力是否發(fā)生變化將直接影響MSC的臨床應(yīng)用。Majumdar等［7］的研究顯示，骨髓MSC可以分泌多種造血生長(zhǎng)因子，具有支持造血作用，能促進(jìn)骨髓來源的CFU-GM，CFU-E，CFU-Meg和CFU-GEMM的增殖。但是凍存后MSC支持造血能力如何變化，既往并無報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過檢測(cè)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)體系中集落形成情況來評(píng)估凍存后MSC對(duì)造血干細(xì)胞的支持作用。骨髓單個(gè)核細(xì)胞在以凍存前、短期凍存和中期凍存后MSC作為滋養(yǎng)層的骨髓長(zhǎng)期培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，4周后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的CFU生成率在各體系之間沒有顯著性差別。這說明經(jīng)過中期和短期凍存后MSC仍具有支持造血能力，同凍存前比較，支持造血能力沒有明顯變化。進(jìn)一步分析上述不同培養(yǎng)體系中CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的生成情況，結(jié)果表明：凍存前后MSC均可以促進(jìn)CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的增殖，而且MSC促進(jìn)定向祖細(xì)胞的增殖能力在凍存前后沒有明顯差別。這些結(jié)果表明，凍存并不影響MSC促進(jìn)不同階段造血祖細(xì)胞增殖、分化的能力。

綜上所述，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)：經(jīng)過中期和短期低溫凍存的骨髓MSC并不改變其固有的生物學(xué)特性。雖然凍存可以導(dǎo)致部分細(xì)胞損傷，但是并不影響剩余細(xì)胞的增殖能力和多向分化能力。此外，凍存后的MSC仍然具有支持造血的功能。但是，凍存后MSC是否在體內(nèi)仍具有上述生物學(xué)性狀和支持造血功能，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

【參考文獻(xiàn)】

1Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of me-senchymal stem cell derived from adult marrow.Nature，2002; 418（6893）: 41-49

2Krause DS，Theise ND，Collector MI，et al.Multi-organ，multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell.Cell，2001; 105: 369-377

3Noort WA，Kruisselbrink AB，in’t-Anker PS，et al.Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood-derived CD34 (+) cells in NOD/SCID mice.Exp Hematol，2002; 30: 870-878

4Koc ON，Gerson SL，Cooper BW，et al.Rapid hematopoietic reco-very after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy.J Clin Oncol，2000; 18: 307-316

5Majumdar MK，Thiede MA，Mosca JD，et al.Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells.J Cell Physiol，1998; 176:57-66

篇8

[關(guān)鍵詞] 赤雹；種子；生物學(xué)特性；萌發(fā)

赤雹Thladiantha dubia Bunge為民族藥中的滿族用藥，屬于葫蘆科赤雹屬植物，以果實(shí)及塊根入藥。果具有理氣，活血，祛痰，利濕作用。塊根主治乳汁不下，脹痛等[1]。目前，在河北省承德地區(qū)民間用赤雹果實(shí)的水煎液治療腰腿疼痛和腰部扭傷，療效顯著，因此本課題組開始對(duì)民間滿族用藥赤雹進(jìn)行化學(xué)成分、提取工藝、藥理作用等方面的研究。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：赤雹根具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎和抗過敏作用[2-3]；同時(shí)觀察到不同濃度赤雹根水提取物對(duì)人白血病細(xì)胞K562的增殖有劑量依賴性的抑制作用[4]。 目前這方面的研究依然在進(jìn)行中，隨著對(duì)赤雹研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有很大的開發(fā)價(jià)值，且用藥量不斷增加，野生資源已經(jīng)滿足不了用藥需求，探討赤雹野生變家種的途徑勢(shì)在必行，因此，從2008年起，筆者對(duì)赤雹種子的生物學(xué)特性及其萌發(fā)條件進(jìn)行了初步研究，為赤雹的栽培和大田生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料

供試赤雹種子于2008年開始每年秋季果實(shí)成熟后進(jìn)行采收，種子采自河北省青龍滿族自治縣。經(jīng)作者鑒定為葫蘆科植物赤雹T. dubia，TDB的干燥成熟種子。種子采集后放入紙袋，室溫下自然干燥，保存于河北省承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所。試驗(yàn)時(shí)選取籽粒飽滿、質(zhì)地均勻、大小一致的供試種子。

2 方法

2.1 種子外部形態(tài)和品質(zhì)特性

2.1.1 赤雹種子千粒重的測(cè)定 采用百粒法（參照《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)—農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程GB/T3543.1-3543.7-1995》），將2 400粒赤雹種子分成3組，每組隨機(jī)抽取赤雹種子100粒，8個(gè)重復(fù)。用分析天平（梅特勒-托利多AG245）分別稱得各份質(zhì)量，并由此計(jì)算出千粒重，3組取平均值。

2.1.2 種子的形態(tài) 將300粒飽滿的赤雹種子平均分成3組，先觀察顏色、整體外形、表面光澤，然后分別測(cè)量每粒種子的長(zhǎng)、寬和厚度，每組100粒，取平均值，最后取3組的平均值。

2.1.3 種子含水量的測(cè)定 先將稱量瓶放在105 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，再將供試種子放入，在天平上稱取20 g，打開瓶蓋，放入110 ℃的烘箱內(nèi)，保持（105±2） ℃，經(jīng)連續(xù)3次稱重的差異不超過0.5 mg為止，重復(fù)9次，每3次為1組，計(jì)算其含水量，取平均值。

2.1.4 種子生活力測(cè)定 采用TTC法，將300粒供試種子用蒸餾水浸泡24 h，分3組，每組100粒，重復(fù)3次，沿種脊小心地將種子切成兩瓣，放入培養(yǎng)皿中，切面朝下，滴入0.05%的TTC溶液浸沒剖面，放在30 ℃暗培養(yǎng)箱中，4 h后取出沖凈，觀察染色反應(yīng)，被染成紅色的有生活力，不被染色或僅有淺紅色的為沒有生活力，然后計(jì)算種子生活力。

2.2 不同處理方法對(duì)赤雹種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響

采用培養(yǎng)皿+雙層濾紙床法，不同浸種時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響：將赤雹種子分別浸泡4，8，12，24，36 h后置于25 ℃下光照培養(yǎng)，以不浸種的種子（0 h）作對(duì)照，每組3次重復(fù)，每重復(fù)100粒；不同溫度條件對(duì)種子萌發(fā)的影響：將赤雹種子分別放在15，20，25，30，35 ℃下光照培養(yǎng)，每組3次重復(fù)，每重復(fù)100粒；在最佳溫度，浸種時(shí)間確定情況下，選擇不同發(fā)芽床：雙層濾紙上，雙層濾紙間，濕潤(rùn)的沙土中測(cè)定發(fā)芽情況，3次重復(fù)，每次重復(fù)100粒種子；不同超聲處理時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響：使用昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的KQ-100型超聲儀，頻率為40 kHZ，處理時(shí)間為5，10，15 min，未超聲處理的（0 min）為對(duì)照，然后放在25 ℃下光照培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，每次100粒種子，最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間30 d，分別記錄種子發(fā)芽始期，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，最后取平均值。

2.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)赤雹種子進(jìn)行不同處理，記錄種子發(fā)芽始期，計(jì)算種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，發(fā)芽率表示萌發(fā)周期結(jié)束后，萌發(fā)種子的數(shù)量占總供試種子的比例，發(fā)芽勢(shì)表示赤雹種子在發(fā)芽過程中日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到最高峰時(shí)，發(fā)芽種子數(shù)占總供試種子的百分?jǐn)?shù)。發(fā)芽始期也就是種子萌發(fā)開始時(shí)間，即培養(yǎng)開始到第1粒種子萌發(fā)所需要的時(shí)間。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用DPSv3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，各處理組間的多重比較采用Duncan法，檢測(cè)水平α=0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 種子外部形態(tài)和品質(zhì)特性

赤雹種子扁卵形，棕黑色，種臍端稍尖，合點(diǎn)端稍平，表面無光澤，長(zhǎng)4.96 mm，寬3.25 mm，厚1.08 mm，千粒重平均為14.03 g，種子平均含水量10.10%，種子平均生活力90.33%（表1） 。

3.2 不同浸種時(shí)間對(duì)赤雹種子發(fā)芽率的影響

不同浸泡時(shí)間處理對(duì)赤雹種子的發(fā)芽情況影響不同（表2）。在浸泡4～12 h中，隨處理時(shí)間的增大，由于種子吸入水分增加，赤雹種子萌發(fā)率增加，但并不是處理時(shí)間越長(zhǎng)萌發(fā)率越大，浸泡24 h的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)比浸泡12 h的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)低，但差異不顯著，而浸泡36 h后種子發(fā)芽力明顯低于對(duì)照，差異顯著。此外，從發(fā)芽始期看，浸泡12 h的赤雹種子發(fā)芽始期是3 d，比對(duì)照組縮短了3 d。因此得出浸泡12 h對(duì)赤雹種子的發(fā)芽情況影響最大，縮短了發(fā)芽始期，提高了發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，發(fā)芽率最大為84.67%。

3.3 不同溫度條件對(duì)赤雹種子萌發(fā)的影響

15 ℃時(shí)，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均為0，而在20～35 ℃，赤雹種子均能萌發(fā)，而且以25～30 ℃種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)較好，但經(jīng)方差分析，二者無顯著性差異；從發(fā)芽始期方面考慮，30 ℃培養(yǎng)種子早于25 ℃培養(yǎng)，20 ℃培養(yǎng)的種子發(fā)芽和生長(zhǎng)緩慢，35 ℃培養(yǎng)的種子，發(fā)芽始期提前，但發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)極低（表3）。因此，確定赤雹種子發(fā)芽最適溫度在25～30 ℃。

3.4 不同發(fā)芽床對(duì)赤雹種子萌發(fā)的影響

紙上發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)較高，且發(fā)芽始期時(shí)間較短，為3 d，而沙中發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)較低，而且大大延緩了發(fā)芽始期，推遲為9 d。經(jīng)方差分析，紙上和紙間發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)差異不顯著，而沙中發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)顯著低于紙上和紙間的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，因此，發(fā)芽床應(yīng)選擇雙層濾紙上（表4）。

3.5 超聲處理對(duì)赤雹種子萌發(fā)的影響

超聲處理對(duì)赤雹種子的萌發(fā)有比較顯著的影響。經(jīng)超聲處理，赤雹種子的發(fā)芽率均高于對(duì)照組，差異顯著，但是隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率都呈下降趨勢(shì)。結(jié)合發(fā)芽始期看，超聲處理10 min時(shí)，種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率達(dá)到峰值，且發(fā)芽始期較短（表5）。

4 討論

本研究觀察了赤雹種子的外部形態(tài)和品質(zhì)特性，研究了不同浸泡時(shí)間、不同溫度、不同發(fā)芽床和不同超聲時(shí)間對(duì)赤雹種子發(fā)芽始期、發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響，得出赤雹種子萌發(fā)最適條件為：種子浸泡12 h，40 kHz超聲10 min，25～30 ℃下雙層濾紙床上光照培養(yǎng)。

大量研究表明，浸種能顯著提高種子的發(fā)芽率。一般，種子要吸收其本身質(zhì)量的25%～50%的水分才能萌發(fā)。只有吸足水分，才能打破種子的休眠，使種皮膨脹、軟化，氧氣才容易透入，呼吸才能增強(qiáng)。各種生理活動(dòng)才會(huì)大大加強(qiáng)；只有吸足水分，種子內(nèi)貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶解于水并經(jīng)過酶的分解后才能轉(zhuǎn)運(yùn)到胚，供胚吸收利用。但浸種時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響發(fā)芽率，這可能與種子缺氧有關(guān)，也可能是浸種時(shí)間過長(zhǎng)，種內(nèi)物質(zhì)外滲，發(fā)生毒害有關(guān)[5]。本研究中發(fā)現(xiàn)，赤雹種子在浸種12 h后發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)達(dá)到最高。

從本實(shí)驗(yàn)中看出，赤雹種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)隨溫度升高，表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，這說明在一定溫度范圍內(nèi)，溫度對(duì)赤雹種子發(fā)芽速率有著促進(jìn)作用，當(dāng)溫度過高，發(fā)芽受到抑制，溫度過低，種子不發(fā)芽，依然處于休眠狀態(tài)，赤雹種子在25～30 ℃時(shí)，發(fā)芽始期較短，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均較高，這可能是溫度影響了種子體內(nèi)酶的活性，從而影響了種子內(nèi)部物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)以及種子吸水和氣體交換。

超聲處理可顯著提高赤雹種子發(fā)芽率。目前認(rèn)為這是由于大能量的超聲波作用于介質(zhì)時(shí)，在振動(dòng)處于稀疏狀態(tài)的位置，介質(zhì)被撕裂成許多小空穴，這些小的空隙會(huì)發(fā)生閉合，閉合時(shí)會(huì)產(chǎn)生高達(dá)幾千大氣壓的瞬時(shí)壓力，這種作用被稱為空化作用?？栈梢蕴岣呒?xì)胞膜的透性、細(xì)胞內(nèi)酶的活性，提高細(xì)胞的新陳代謝。為提高赤雹種子萌發(fā)率，且又不影響種子生活力及幼苗生長(zhǎng)，可采用10 min超聲處理，作為大規(guī)模播種的前處理，應(yīng)用于大田生產(chǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 宋立人，紅恂，丁緒亮，等.現(xiàn)代中藥大辭典.上冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社， 2001：1022.

[2] 陳建雙，張玉玲，趙波，等.赤雹根總皂苷抗炎作用研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（8）：163.

[3] 張玉玲，趙波，陳建雙，等.赤雹根鎮(zhèn)痛作用及有效部位研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（10） ：2483.

[4] 張玉玲，趙波，劉永平，等.赤雹根水提取物對(duì)人白血病細(xì)胞K562的抑制作用 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010（2）：397.

[5] 劉麗，郭巧生，王云鵬，等.藥用鼠尾草種子萌發(fā)特性的初步研究[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31（19）：1587.

Studies on biological characteristics and germination

conditions of Thladiantha dubia seeds

ZHAO Chun-ying*， SU Zhan-hui， MAO Xiao-xia， TONG Ji-ming

（Institute of Chinese Mateia Medica， Chengde Medical College Hebei Key Laboratory of Research

and Development for Traditional Chinese Medicine， Chengde 067000， China）

[Abstract] Objective： To study the biological characteristics and find out the optimum condition for germination of seed of Thladiantha dubia Bunge for its standardized culturing. Method： The weight per 1 000 seeds， seed moisture content and seed viability were determined. The biological characteristics were studied and germination conditions of seed of T. dubia were tested under following conditions： different seed soaking time， different temperatures （15， 20， 25， 30， 35 ℃） and different irradiation time （0， 5， 10， 15， 20 min）. Result： The average length， width and thickness of T. Dubia seed were 4.96， 3.25and 1.08 mm， respectively. The weight per 1 000 seeds was 14.03 g； the seed moisture content was 10.10%； the seed viability was 90.33%. Under the same condition of light， temperature and other factors， the seed germination percentage and germination energy were the highest after seed soaking 24 h. The suitable temperature range of seeds was form 25 ℃ to 35 ℃. Under different irradiation time， the seed germination percentage and germination energy were the highest after irradiation 10 min. In different germinating beds， the seeds germination percentage and germination energy were the highest on paper （TP）， which was 89.33%. Conclusion： The optimum condition for the germination of the seed of T. dubia is seed soaking 12 h， irradiation 10min， 25-30 ℃ on filter paper.

篇9

1 DMBT1基因的發(fā)現(xiàn)與分子結(jié)構(gòu)特征

1997年，Molleuhancer等[1]研究發(fā)現(xiàn)80%的多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤顯示具有10q的缺失。并采用表象差異分析法在一個(gè)成神經(jīng)管細(xì)胞瘤細(xì)胞株中，識(shí)別了一個(gè)位于10q25．3-26．1的純合子缺乏，并克隆了跨越這一缺失的新基因--DMBT1基因。正是由于最早發(fā)現(xiàn)該基因常常在腦組織惡性腫瘤中丟失，故而得名（deleted in m alignant brain tumors，DMBT1）。

DMBT1基因位于10號(hào)染色體長(zhǎng)臂，由高度同源的重復(fù)外顯子和內(nèi)含子序列構(gòu)成[2]，該基因具有至少54個(gè)外顯子，并且覆蓋長(zhǎng)達(dá)8 kb的基因組區(qū)域[3]。 DMBT1基因與清道夫受體富含半光氨酸區(qū)域（SRCR）超家族具有同源性，編碼包含SRCR區(qū),CUB(“Clr/Cls Uegf Bmp1”)區(qū)和ZP(“zona pellucida”)區(qū)[4]的糖蛋白。因此也說明DMBT1可能參與間接的蛋白與蛋白的相互作用。

2 DMBT1基因的功能

2．1 DMBT1與免疫防御 DMBT1編碼蛋白是SRCR超家族中的新成員，SRCR超家族是免疫球蛋白超家族中具有回憶功能且大多數(shù)與免疫系統(tǒng)的增生和分化相關(guān)的家族[5]。Mollenhauer等[5]研究發(fā)現(xiàn)DMBT1 mRNA在整個(gè)免疫系統(tǒng)都有表達(dá)，Western雜交研究顯示DMBT1同源體與膠原凝集素結(jié)合蛋白gp-340相符合，gp-340是一種參與呼吸道免疫防御的糖蛋白，DMBT1 gp-340通過與肺泡表面的表面活性蛋白Sp-D（surfactant protein D）、Sp-A作用可刺激肺泡巨噬細(xì)胞的遷移。免疫組化顯示腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞都可以合成DMBT1,而且在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中（與正常腦組織相比）下調(diào)，其可能參與了免疫防御功能。

2．2 DMBT1與細(xì)胞分化 據(jù)Hikitac等[6]和Al-Awqati等[7]研究報(bào)道hensin這種蛋白存在于遠(yuǎn)曲小管和集合管的閏上皮細(xì)胞以及小腸上皮細(xì)胞，是一種極性蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)的相互作用及與細(xì)胞表面蛋白的聯(lián)系而能夠逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞的極性，而集合小管閏細(xì)胞的極性轉(zhuǎn)變代表了終末分化；hensin這種蛋白還能誘導(dǎo)微絨毛蛋白的表達(dá)，而導(dǎo)致尖端終端網(wǎng)狀蛋白（細(xì)胞角蛋白19和肌動(dòng)蛋白）的出現(xiàn)（這些均導(dǎo)致過度生長(zhǎng)的微絨毛結(jié)構(gòu)）。Hensin在許多類型的上皮細(xì)胞中表達(dá)，而且可能它在這些上皮細(xì)胞的分化中也扮演了相同重要的作用。兔的hensin蛋白和人的DMBT1蛋白均來源與相同基因的選擇性拼接。免疫組化顯示DMBT1蛋白在成人與胎兒的胃腸道上皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞的表達(dá)水平和空間分布存在明顯差異，這提示DMBT1可能在人體某些部位的發(fā)育過程起作用。說明DMBT1可能具有促進(jìn)細(xì)胞分化的功能。

3 DMBT1表達(dá)與腫瘤臨床病理、生物學(xué)行為

Mollenhauer等[1]通過RNA 轉(zhuǎn)移雜交在胎兒肺中檢測(cè)到DMBT1的cDN段有8．0、7．5、6．0 kb 3種，在成人肺中只檢測(cè)到8．0 kb片段，在小腸中檢測(cè)到7．5 kb和6．0 kb片段。比較DMBT1基因6．0 kb片段和 8．0 kb片段的外顯子功能，Mollenhauer等發(fā)現(xiàn)DMBT1的不同大小片段可編碼不同SRCR區(qū)和SID區(qū)（SRCR interspersed domain）的蛋白質(zhì)，且SRCR區(qū)是蛋白配體的結(jié)合區(qū)。還發(fā)現(xiàn)在8．0 kb片段中外顯子14（定位于SID3a）及外顯子17（定位于SID4b）缺乏，提示可能是編碼SID區(qū)的外顯子功能的不同調(diào)控方式，進(jìn)一步提示不同的編碼外顯子的SRCR區(qū)和SID區(qū)可產(chǎn)生不同功能特點(diǎn)的蛋白質(zhì)。DMBT1基因在正常成人呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)組織中高表達(dá)[8-9]，在生殖系統(tǒng)和腦組織中為中等表達(dá)，在多種腫瘤中，DMBT1基因的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度存在明顯的相關(guān)性，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤，DMBT1基因的表達(dá)率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。DMBT1基因表達(dá)的改變與腫瘤的組織學(xué)分型、浸潤(rùn)方式、腫瘤大小、腫瘤部位等無關(guān)。

4 DMBT1基因在常見腫瘤的表達(dá)及其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系

大量的研究顯示DMBT1基因和/或表達(dá)的異常與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、肺癌、乳腺癌等均有關(guān)，以下就DMBT1基因與腫瘤的關(guān)系作一簡(jiǎn)要闡述。

4．1 DMBT1基因在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá) Mollenhauer等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在20例成神經(jīng)管細(xì)胞瘤有5例，39例多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中有19例檢出等位基因的缺失，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在二者中存在高比例的純合性缺失，且4/5腦腫瘤細(xì)胞株缺乏DMBT1基因的表達(dá)，故認(rèn)為DMBT1可能是一種參與成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤致癌機(jī)制的腫瘤抑制基因。Somerville等[10]研究指出：21例原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中38%腫瘤顯示DMBT1基因內(nèi)的純合性缺失。Lin等[11]研究報(bào)道，在26例間變性少突膠質(zhì)瘤、31例間變性星形細(xì)胞瘤、53例多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，DMBT1位點(diǎn)常常發(fā)生雜合性缺失，且3組之間無明顯差異，但DMBT1位點(diǎn)的雜合性缺失與患者的生存期無關(guān)，認(rèn)為DMBT1與膠質(zhì)瘤形成的早期階段有關(guān)。但是據(jù)Sanson等[12]研究報(bào)道，39例少突膠質(zhì)瘤中，10例出現(xiàn)DMBT1基因純合性缺失，但這其中只有1例具有PTEN突變，且其純合性缺失與生存期無關(guān)，認(rèn)為DMBT1基因有關(guān)腫瘤發(fā)生的作用有待進(jìn)一步研究證明。

4．2 DMBT1基因在消化系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá) DMBT1在正常成人消化系統(tǒng)呈高水平表達(dá)，Mori等[13]用RT-PCR的方法測(cè)定食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌中DMBT1 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)43例食管癌中有23例、40例胃癌中有5例、24例結(jié)直腸癌中4例DMBT1 mRNA的表達(dá)明顯減少。且15種食管癌細(xì)胞系中12種食管癌細(xì)胞系無DMBT1 mRNA表達(dá)，并且11．6%原發(fā)性食管癌中、

13．3%食管癌細(xì)胞系中存在DMBT1純合性缺失。表明DMBT1作為一個(gè)腫瘤抑制基因也存在于消化道腫瘤中，特別是食管癌中。王越英等[14]研究報(bào)道，在食管癌、賁門癌、胃癌組織中，DMBT1 mRNA陽性表達(dá)缺失率分別為63．2%（24/38）、52．4%（11/24）、72．0%（18/25）。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織DMBT1 mRNA表達(dá)缺失率均顯著高于相應(yīng)淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移的癌組織，腫瘤外侵越嚴(yán)重，DMBT1 mRNA表達(dá)缺失率越高，提示DMBT1基因在上消化道癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起一定作用。

Sasaki等[15]檢測(cè)了25例肝結(jié)石病的膽管上皮、52例伴有肝結(jié)石病的浸潤(rùn)和非浸潤(rùn)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌、49例伴有肝結(jié)石病的肝管內(nèi)狀瘤、32例無肝結(jié)石病的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌和10例正常肝組織。發(fā)現(xiàn)與正常的肝組織相比肝結(jié)石病的膽管上皮的DMBT1表達(dá)增加，57%的伴有肝結(jié)石病的肝管內(nèi)狀瘤和79%的非浸潤(rùn)性肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌表達(dá)也增加，而有和無肝結(jié)石病的浸潤(rùn)性肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的DMBT1表達(dá)減少（各為50%和30%）。在4個(gè)（20%）肝管細(xì)胞癌組織和2個(gè)（50%）膽管細(xì)胞癌細(xì)胞株存在純合性缺失和表達(dá)減少，故認(rèn)為DMBT1基因純合性缺失和表達(dá)減少是肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌形成和進(jìn)展的關(guān)鍵。

4．3 DMBT1基因在肺癌組織中的表達(dá) 據(jù)Wu等[9]研究報(bào)道，10%（2/20）小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系和43%（6/14）非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系缺少DMBT1的表達(dá)，而且與正常肺組織相比，45%（9/20）原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌DMBT1的基因表達(dá)水平顯著降低，且 10%（4/40）的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系存在DMBT1的純合性缺失。并通過對(duì)8個(gè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系和20例原發(fā)性非小細(xì)胞DMBT1區(qū)編碼測(cè)定，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中測(cè)定到52密碼子的點(diǎn)突變，從而導(dǎo)致編碼的氨基酸由絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼?，認(rèn)為DMBT1基因缺失或其他不明機(jī)制引起的DMBT1基因表達(dá)缺失在肺癌的發(fā)生中起了一個(gè)重要的作用。周愛蓮等[16]用聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)原發(fā)性肺癌DMBT1基因純合性缺失，發(fā)現(xiàn)37例肺癌組織中9例有DMBT1基因純合性缺失，而其自身癌旁正常肺組織均無DMBT1基因的純合性缺失，DMBT1基因純合性缺失率,非小細(xì)胞肺癌組高于小細(xì)胞肺癌組，低、未分化肺癌組高于中、高分化肺癌組，伴有淋巴和/或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組高于不伴轉(zhuǎn)移組，有吸煙史組高于無吸煙史組（ P

4．4 DMBT1基因在其他系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá) Bikker等[18]應(yīng)用免疫組化的方法測(cè)定涎腺腫瘤中DMBT1蛋白-涎腺凝集素（Salivary agglutinin SAG）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在涎腺癌旁組織中SAG的表達(dá)上調(diào)，而在涎腺腫瘤中,與其自身正常組織或癌旁組織相比，SAG表達(dá)下調(diào)。認(rèn)為SAG可以作為一個(gè)潛在的涎腺腫瘤指示劑和（或）涎腺腫瘤抑制因子。

Mollenhauer 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與正常表皮組織相比DMBT1和galectin-3在上皮起源的皮膚腫瘤中的表達(dá)也是下調(diào)的，指出DMBT1/galectin-3的缺失表達(dá)在皮膚癌的發(fā)生上起一定的作用。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在黑色素細(xì)胞中DMBT1/galectin-3無表達(dá)，在8例痣中有1例，11例黑色素瘤中有1例有誘導(dǎo)表達(dá)，認(rèn)為在黑色素瘤中DMBT1和galectin-3不可能作為一個(gè)典型腫瘤抑制基因起作用。

Braidotti等[20]研究指出：在正常的和增生的乳腺組織中，DMBT1的表達(dá)是重新分配和上調(diào)的，而在乳腺癌DMBT1的表達(dá)是下調(diào)的。認(rèn)為DMBT1在乳腺癌中具有潛在的作用。而且DMBT1的表達(dá)與MCM的伴隨表達(dá)，說明DMBT1可能與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān)。

5 小結(jié)

DMBT1基因是一種侯選的抑癌基因，它既可通過參與免疫防御功能，又可通過促進(jìn)細(xì)胞的分化，發(fā)揮其抑癌作用。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)DMBT1基因的表達(dá)水平和DMBT1突變/缺失在腫瘤形成過程的作用，有時(shí)會(huì)得出頗具爭(zhēng)論的結(jié)論。且關(guān)于DMBT1在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞、及細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)相互作用的可能作用，以及和不同腫瘤的聯(lián)系，需要在體內(nèi)外進(jìn)行更多直接功能研究來闡明。對(duì)其作用機(jī)理的進(jìn)一步揭示及其在體內(nèi)外生物學(xué)效應(yīng)的進(jìn)一步探討，將為臨床預(yù)防、診斷、治療腫瘤和判斷預(yù)后提供一條新途徑。

參考文獻(xiàn)

［1］Mollenhauer J,Wiemann S,Scheurlen W,et al.DMBT1,a new member of the SRCR superfamily,on chromosome 10q25．3-26．1 is deleted in m alignant brain tumors.Nat Genet,1997,17(1):32-39.

［2］ Mollenhauer J,Muller H,Kollender G,et al.SRCR/SID region of DMBT1 defines a complex multi-allele system representing the major basis for its variability in cancer.Gene Chromosomes Cancer,2002,35(3):242-255.

［3］ Mollenhauer J,Holmskov U,WiemannS,et al.The genomic structure of the DMBT1 gene:evidence for a region with susceptibity to genomic instability.Oncogene,1999,18(46):6233-6240.

［4］ Mollenhauer J,Herbertz S,Helmke B,et al.Deleted in m alignant brain tumors 1 is a versatile mucia-like molecule likely to play a differental role in digestive tract cancer.Cancer Res,2001,61(24):8880-8886.

［5］ Mollenhauer J,Herbertz S,Holmskov U,et al.DMBT1 encodes a protein involved in the immune defense and in epithelial differentiation and is highly unstable in cancer.Cancer Res,2000,60(6):1704-1710.

［6］ Hikita C,Vijayakamar S,Takito J,et al.Induction of terminal differentiation in epithelial cells requires polymerization of hensin by galectin 3．J Cell Biol,2000,151(6):1235-1246.

［7］ Al-Awqati Q,Vijayakumar S,Takito J,et al.Phenotypic plasticity and terminal differentiation of the intercalated cell:the hensin pathway.Exp Nephrol,2000,8(2):66-71.

［8］ Takeshita H,Sato M,Shiwaku HO,et al.Expression of the DMBT1 gene is frequently suppressed in human lung cancer.Jpn J Cancer Res,1999,90(9):903-908.

［9］ Wu W,Kemp BL,Proctor ML,et al.Expression of DMBT1,a candidate tumor suppressor gene,is frequently lost in lung cancer.Cancer Res,1999,59(8):1846-1851.

［10］Somerville RP,Shoshan Y,Eng C,et al.Molecular analysis of two putative tumor suppressor genes,PTEN and DMBT,which have been implicated in glioblastoma multiforme disease progression.Oncogene,1998,17(13):1755-1757.

［11］ Lin H,Bondy ML,Langford LA,et al.Allelic deletion analyses of MMAC/PTEN and DMBT1,lociin gliomas:relationship to prognostic significance.Clin Cancer Res,1998,4(10):2447-2454.

［12］ Samson M,Leuraud P,Aguirre-Cruz L,et al.Analysis of loss of chromosome 10q,DMBT1homozygous deletions,and PTEN mutations in oligodendrogliomas.J Neurosurg,2002,97(6):1397-1401.

［13］ Mori M,Shiraishi T,Tanaka S,et al.Lack of DMBT1 expression in oesophageal,gastric and colon cancers.Br J Cancer,1999,79(2):211-213.

［14］ 王越英，唐槐靜，邵康，等.DMBT1基因在上消化道癌組織中的表達(dá)及意義.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2002，19（6）：514-515.

［15］Sasaki M,Huang SF,Chen MF,et al.Decrease of deleted in m alignant brain tumour-1 (DMBT-1) expression is a crucial late event in intrahepatic cholangiocarcinoma.Histopathology,2003,43(4):340-346.

［16］ 周愛蓮，文海云，何建猷，等.DMBT1基因純合性缺失中與原發(fā)性肺癌臨床病理特征的關(guān)系.腫瘤防治研究，2003，30（3）：184-186.

［17］ Petersen S,Rudof J,Bockmuhl U,et al.Analysis of the DMBT1 gene in carcinomas of the respiratory tract.Int J Cancer,2000,88(1):71-76.

［18］ Bikker FJ,van der Wal JE,ligtenberg AJ,et al.Salivary agglutinin/DMBT1SAG expression is up regulated in the presence of salivary gland tumors.J Dent Res,2004,83(7):567-571.

篇10

聲波通常意義上是指人耳所能感覺到的一種縱波，它的頻率范圍在16hz-20khz之間。而在物理聲學(xué)的研究中，通常將頻率在20hz以下的聲波稱為次聲波，而將頻率大于20khz的稱為超聲波。近些年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，聲波在國(guó)內(nèi)外的各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用都較為廣泛，同時(shí)也對(duì)其研究提出了更高層次的要求。在物理聲學(xué)研究組成中，對(duì)于超聲波與次聲波的研究更受到了廣泛的關(guān)注，加強(qiáng)對(duì)于二者的研究力度以使之更適用于社會(huì)各項(xiàng)經(jīng)濟(jì)文化建設(shè)已經(jīng)成為未來物理聲學(xué)研究發(fā)展方向之一。

1.超聲波與次聲波的特性

1.1超聲波的特性

1.1.1束射特性

因超聲波的波長(zhǎng)較短，它能夠和其他光線一樣具有反射、折射與聚焦特性，并且其也滿足一些基本光學(xué)定律要求。當(dāng)超聲波傳輸?shù)揭环N物質(zhì)表面而發(fā)生反射時(shí)，其會(huì)遵循幾何光學(xué)定律，即反射角等于入射角。而當(dāng)其在兩種不同的介質(zhì)之間傳播時(shí)，它會(huì)因介質(zhì)密度的不同而發(fā)生折射，此時(shí)它的傳播方向也就會(huì)隨之發(fā)生改變，當(dāng)兩種介質(zhì)之間的密度差別越大時(shí)，其發(fā)生折射的程度就會(huì)越大。

1.1.2吸收特性

超聲波在物質(zhì)中進(jìn)行傳播時(shí)，隨著時(shí)間的推移，其強(qiáng)度與能量會(huì)逐漸減弱，其原因是物質(zhì)會(huì)將其部分能量吸收。對(duì)于同一種物質(zhì)而言，其吸收率與超聲波的頻率成正比，即超聲波的頻率越大，其吸收率就越大。相關(guān)物理聲學(xué)研究表明：對(duì)于特定頻率的超聲波而言，其在氣體中傳播時(shí)所體現(xiàn)的吸收特性要強(qiáng)于液體與固體，其中在固體中傳播時(shí)該特性體現(xiàn)得最不明顯。

1.1.3能量傳送特性

超聲波能夠在社會(huì)各個(gè)行業(yè)部門得到較為廣泛的應(yīng)用，與其自身具有較大的能量有著非常大的關(guān)系。與普通的聲波相比，超聲波具有更為強(qiáng)大的功率。然而之所以出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象，是因?yàn)楫?dāng)超聲波傳達(dá)到某一物質(zhì)中時(shí)，它會(huì)使物質(zhì)中的分子也隨之振動(dòng)，并且振動(dòng)的頻率與聲波一致，也就是我們常說的共振。值得一提的是，分子振動(dòng)的頻率決定了其振動(dòng)速度，即頻率越高其速度也就越大。

1.1.4聲壓特性

當(dāng)聲波傳入到物體中時(shí)，因引發(fā)物質(zhì)分子產(chǎn)生的緊縮與稠密作用會(huì)使物質(zhì)所受的壓力產(chǎn)生變化，這種因聲波振動(dòng)所產(chǎn)生的附加壓力稱為聲壓作用。因超聲波所蘊(yùn)含的能量較大，其通常情況下會(huì)使物質(zhì)分子體現(xiàn)出非常顯著的聲壓作用，例如當(dāng)液體表面有超聲波沖擊時(shí)，其表面壓力可以達(dá)到好幾個(gè)大氣壓力。液體在這種短暫的較強(qiáng)壓力作用下，會(huì)使其溫度瞬間升高，這種作用也會(huì)使懸浮在液體表面的固體物質(zhì)遭到破壞，也就是我們常說的空化現(xiàn)象，超聲波洗衣機(jī)便是這一現(xiàn)象的一個(gè)典型應(yīng)用。

1.2次聲波的特性

次聲波的頻率通常在20hz以下，而且不容易生衰減，同時(shí)也不易于被空氣和水吸收。與超聲波相比，它也具有束縛與吸收特性，同時(shí)其波長(zhǎng)一般都比較長(zhǎng)，在傳播過程中可以繞開較大的障礙物而發(fā)生衍射，甚至有些次聲波可以繞地球傳播2到3周。但值得一提的是，次聲波的頻率與人體器官的振動(dòng)頻率相近，容易與人體器官發(fā)生共振現(xiàn)象，所以對(duì)人體會(huì)有一定的傷害。但是其應(yīng)用范圍也比較廣泛，如醫(yī)療診斷、地震等自然災(zāi)害預(yù)測(cè)等。

2.超聲波與次聲波的應(yīng)用分析

2.1超聲波的應(yīng)用分析

對(duì)于超聲波的應(yīng)用一般是利用其聲波傳播特性與其自身所蘊(yùn)含的強(qiáng)大能量，下面就以其在兩個(gè)方面的應(yīng)用對(duì)超聲波的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要的分析。

2.1.1在彈性模量測(cè)量中的應(yīng)用

在各向同性的固體材料中，可以按照應(yīng)力與虎克定律將超聲波傳播的特征方程求出。對(duì)于同一種材料而言，超聲波的縱波與橫波傳播速度一般不同，但它們都受到介質(zhì)密度、泊松比、楊氏模量等參數(shù)的影響。同時(shí)，通過測(cè)量超聲波在物體材料中的傳播速度也可將測(cè)量材料有關(guān)的彈性常數(shù)求出。

2.1.2超聲波在混凝土檢測(cè)中的應(yīng)用

利用超聲波可以對(duì)混凝土內(nèi)部的松散區(qū)域與漏洞進(jìn)行檢測(cè)，其作用原理是，當(dāng)發(fā)射探頭所發(fā)出的超聲波在傳播過程中遇到空洞時(shí)就會(huì)發(fā)生反射而使其能量衰減，同時(shí)另一部分就會(huì)沿著孔壁繼續(xù)傳播，這些聲波最后被統(tǒng)一接收，最終從超聲儀上分析出不同混凝土層存在的差別。同時(shí)，通過不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)變化情況，以及超聲波波形、振幅所發(fā)生的變化，可以解算出混凝土內(nèi)部空洞的大致尺寸。需要注意的是，這一應(yīng)用主要是用于判斷其內(nèi)部是否存在空洞或是缺陷，之后再進(jìn)行后續(xù)的操作。在開展具體的混凝土檢測(cè)工作過程中，需布置大量的測(cè)點(diǎn)。如材料兩側(cè)的測(cè)試面平行，就可用對(duì)測(cè)法來進(jìn)行測(cè)量，當(dāng)只有一對(duì)測(cè)試平行面時(shí)，也可在對(duì)測(cè)的基礎(chǔ)上進(jìn)行交叉斜測(cè)，并對(duì)可疑區(qū)域進(jìn)行加密測(cè)量。

2.2次聲波的應(yīng)用（以在醫(yī)學(xué)的典型應(yīng)用為例）