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篇1

【關鍵詞】化學發(fā)光免疫；應用；發(fā)展

中圖分類號：C911文獻標識碼： A

一、前言

化學發(fā)光免疫分析方法靈敏度高、適用范圍廣泛受到了人們的認可，在醫(yī)學、食品、藥品等眾多領域廣泛使用。傳統(tǒng)的免疫分析需要的培育時間長，因此，提高分析的時間和效率是當前研究人員重點解決的問題。

二、化學發(fā)光免疫分析法

化學發(fā)光分析是根據(jù)化學反應產(chǎn)生的輻射光的強度來確定物質(zhì)含量的分析方法?；瘜W發(fā)光免疫分析是將化學發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應相結合，用化學發(fā)光相關的物質(zhì)標記抗體或抗原，與待測的抗原或抗體反應后，經(jīng)過分離游離態(tài)的化學發(fā)光標記物，加入化學發(fā)光系統(tǒng)的其它相關物產(chǎn)生化學發(fā)光，進行抗原或抗體的定量或定性檢測。化學發(fā)光免疫分析中使用最多的4類標記物為魯米諾、異魯米諾及其衍生物，吖啶酯衍生物，過氧化物酶和堿性磷酸酶。

以酶為標記物的化學發(fā)光仍然是化學發(fā)光免疫分析的主流，辣根過氧化物酶(HRP)與堿性磷酸酶(ALP)是兩種常見的標記酶，均有其相應的化學發(fā)光底物，在臨床檢驗中有廣泛應用，開發(fā)催化活性更高、穩(wěn)定性更好、發(fā)光動力學曲線更符合免疫分析的酶和底物是化學發(fā)光免疫分析的研究熱點之一。

三、PEC免疫分析的基本裝置

PEC分析需要在光電檢測系統(tǒng)中實現(xiàn).該系統(tǒng)主要包括激發(fā)光源、吸收池以及三電極體系的電化學裝置.在光激發(fā)條件下,電解質(zhì)溶液中光電活性材料的表面將發(fā)生電荷的分離與躍遷,電極表面發(fā)生一定的氧化還原反應從而在外電路產(chǎn)生電流,這一過程由電化學裝置所記錄并用于特定檢測對象的測定.

PEC免疫分析的基本原理是基于免疫反應前后光電流信號的變化。在一個簡單典型的PEC免疫系統(tǒng)中,免疫探針分子(通常是特異性的抗體或抗原)首先被固定在光電換能器(transducer)表面作為識別元件(recognitionelement),抗原(或抗體)作為待測物與探針分子在電極表面形成免疫復合物,導致光電流信號的增強或降低.本節(jié)將介紹PEC免疫傳感界面的基本構建過程,主要包括光電極的選擇與制備、免疫探針分子的固定等重要步驟。

1、電極材料的選擇與制備

PEC檢測的基本模式?jīng)Q定了其在免疫傳感中必須使用特定的光電活性電極.而免疫探針分子則在這種電極表面固定,隨后的免疫識別反應也在該表面發(fā)生,所以光電活性材料的選擇和制備與免疫傳感的檢測性能密切相關.理想的光電活性電極應該具有較低的電子空穴復合率,以便獲得穩(wěn)定的光電流密度.一般而言,在PEC免疫傳感中,光電活性電極的選擇主要取決于所設計的檢測路徑與傳感過程.常用的電極有整體電極和氧化銦錫(ITO)修飾電極.整體電極如二氧化鈦納米管陣列電極(TiO2NTs),ITO修飾電極則由ITO基底和光電修飾材料兩部分構成.

2、免疫探針分子的固定

電極制備好后,免疫探針分子的固定是傳感器制備中重要的一步,直接決定著傳感器性能的優(yōu)劣.原則上,電化學免疫傳感器中可以使用的固定方法都可以用于PEC傳感.但因后者使用的電極材料有所不同,所以具體采用的固定方法往往和電極材料的種類以及實驗的設計有關.另外,為了保證探針分子的準確定位與吸附以使探針分子在固定后保持較高的活性和穩(wěn)定性并形成具有適宜厚度、密度、多孔性的敏感膜,同時為了避免非特異性吸附和結合的干擾,在固定這一步驟中需對電極的表面化學性質(zhì)進行嚴格控制,因此需要對實驗條件進行多重優(yōu)化以便確定最佳條件.具體來講,考慮到免疫探針生物分子具有不穩(wěn)定性,其固定需要滿足以下兩個條件:

(1)固定過程條件溫和,防止生物分子變性,而且固定在電極表面后也能保持良好的活性;

(2)固定后,敏感層與電極表面接觸緊密,同時具有良好的穩(wěn)定性和耐用性。

四、光電免疫檢測的分類與傳感機理

和其他的免疫分析方法一樣,PEC免疫分析也可以簡單地分為非標記型和標記型兩大類.結合不同的實驗設計,相應的傳感機理也有所區(qū)別.

1、非標記型光電免疫傳感器

非標記型光電免疫傳感器通過直接測定抗原抗體免疫復合物形成時的光電流信號的變化來確定待測物的濃度.在非標記型光電免疫傳感中,由于省去了對待測物的標記過程,且樣品前處理過程簡單,極大地簡化了制備和操作步驟,因此該類型的相關研究工作在免疫傳感器領域一直具有不可取代的優(yōu)勢.但是,由于其檢測原理大多基于免疫復合物形成前后所產(chǎn)生的位阻效應變化,因此檢測信號的變化幅度往往非常有限,在檢測靈敏度方面尚有待提高.目前對非標記型光電免疫傳感器的研究工作主要側重在對新型光電基底的利用和目檢測物的多樣化.Cosnier的非標記型PEC免疫工作中,釕聯(lián)吡啶配合物上被衍生連接了吡咯和生物素,然后利用吡咯的電聚合作用實現(xiàn)了光電物質(zhì)在電極表面的固定.然后通過生物素-親和素的連接作用,將標記有生物素的霍亂毒素固定到光電物質(zhì)表面.當向溶液中加入待測的霍亂毒素抗體(anti-choleratoxinantibody)時,形成的免疫復合物在光電物質(zhì)表面產(chǎn)生更強的位阻效應,阻礙電子受體向電極擴散,從而導致光電流降低.該方法很好地實現(xiàn)了霍亂毒素抗體的免疫測定,檢測限可以達到0.5μg/mL。

2、標記型光電免疫傳感器

非標記型免疫分析法雖然有著很好的簡易性,但是由于其負載量低以及無法實現(xiàn)信號放大,它在檢測靈敏度方面仍然需要改進.在此情況下,標記型免疫傳感分析應運而生.在不同的檢測系統(tǒng)中,可以通過標記引入信號分子或?qū)崿F(xiàn)信號放大.具有催化活性的酶分子因為易于與抗體或抗原結合,且可在短時間內(nèi)將大量底物分子轉化為具有電化學活性的產(chǎn)物,因此常被用做標記物.常用的標記酶有葡萄糖氧化酶(GOx)、辣根過氧化物酶(HRP)與堿性磷酸酶(ALP)。

最近,基于光電化學、酶聯(lián)免疫方法和生物催化沉積的協(xié)同作用,本課題組報道了用HRP標記的放大型PEC免疫分析方法.在CdSQDs修飾的ITO電極表面,通過免疫反應形成夾心結構Ab1-Ag-Ab2-HRP免疫復合物,然后利用BCP反應在電極表面形成不溶物覆蓋層.此外,因為HRP在410nm的實驗條件下有很強的光吸收性質(zhì),所以在該體系中HRP除了引發(fā)BCP反應,還能夠競爭性的吸收入射光,協(xié)同提高了檢測靈敏度.該工作以小鼠IgG為模型分子,實驗結果表明可以實現(xiàn)對待測物的高靈敏檢測.因為很多種酶都可以被引入該系統(tǒng)并且引發(fā)相關BCP反應,所以本工作為發(fā)展高靈敏性的PEC免疫分析方法提供了一種新思路.基于該工作結合納米金標記放大技術,我們進而實現(xiàn)了對前列腺腫瘤標記物(prostate-specificantigen)的高靈敏檢測。

五、發(fā)展與展望

化學發(fā)光免疫分析法具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、設備簡單等優(yōu)點，近年來在環(huán)境、臨床、食品、藥物檢測中得到了廣泛運用。實際檢測常常需要對大量、復雜、低豐度的樣品進行測定，因而化學發(fā)光免疫分析法逐漸向快速、高通量、高靈敏檢測的方向發(fā)展。本文總結了近幾年化學發(fā)光免疫分析法的應用進展，涉及到降低溫育時間，多組分檢測，以及信號放大技術。這些例子都證明了化學發(fā)光免疫分析法具有廣泛的應用前景和可操作性。為了更好地適應臨床、環(huán)境等領域的實際應用，需要大力發(fā)展微型化、集成化和自動化的化學發(fā)光免疫分析儀器。隨著分子生物學及納米與傳感技術的進步，新的化學發(fā)光免疫分析原理與高靈敏的免疫分析方法將得到不斷發(fā)展，開發(fā)催化活性更高、穩(wěn)定性更好、發(fā)光動力學曲線更符合免疫分析的酶和底物并推廣到臨床檢測，發(fā)展新型標記技術用于信號放大，建立化學發(fā)光免疫分析新方法，都將是未來的發(fā)展方向及研究重點。

六、結束語

隨著科技水平的發(fā)展和進步，化學光電免疫分析方法也將進一步完善，并發(fā)揮更大作用，推動相關行業(yè)的快速發(fā)展和進步。

參考文獻

[1]彭芳,榮,司士輝,等.光電化學型半導體生物傳感器.化學進展,2008,20:586593

篇2

關鍵詞：甲狀腺疾病;化學發(fā)光免疫技術;應用;效果

甲狀腺疾病為常見臨床疾病，常通過檢測患者甲狀腺球蛋白進行診斷。傳統(tǒng)檢測方法為放射免疫技術、血凝法等，但檢測效果不甚理想?；瘜W發(fā)光免疫技術具有穩(wěn)定性高、靈敏度高和操作方便等優(yōu)點，標本用量較少，且標記物易得[1]?，F(xiàn)搜集2013年7月―2014年7月我院接診的甲狀腺疾病45例、甲狀腺腫瘤45例、甲亢45例患者，對其化學發(fā)光免疫技術的應用效果進行總結性分析，并將分析結果報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 將2013年7月―2014年7月我院接診的甲狀腺疾病45例患者作為甲組，平均年齡是（29.32±10.25）歲，男患者和女患者分別是23例、22例;將甲狀腺腫瘤45例患者作為乙組，平均年齡是（29.39±10.25）歲，男患者和女患者分別是24例、21例;將甲亢45例患者作為丙組，平均年齡是（29.48±10.22）歲，男患者和女患者分別是25例、20例;將同期正常體檢人群45例作為丁組，平均年齡是（30.07±1.12）歲，男性和女性分別是22例、23例。甲組、乙組、丙組和丁組的一般臨床資料相比，無明顯差異，無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.2 方法 在受檢者空腹情況下采3ml血，抗凝劑選擇肝素鈉，通過放射免疫技術對血漿甲狀腺球蛋白進行檢測;后選擇化學發(fā)光免疫全自動分析儀檢測。比較甲組、乙組、丙組和丁組假陰性、假陽性和檢測濃度。對比不同檢測方法的符合率、特異性及靈敏度。

1.3 統(tǒng)計學分析 對本文所得實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行檢驗，所得計量資料采用t檢驗，所得計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 假陰性及假陽性結果 與放射免疫技術相比，四組經(jīng)化學發(fā)光免疫技術檢測假陰性及假陽性率較低，有明顯差異，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。四組檢測結果比較情況見表一。

表一 四組假陰性及假陽性結果對比

2.2 甲狀腺球蛋白檢測濃度 與放射免疫技術相比，經(jīng)化學發(fā)光免疫技術檢測的甲狀腺球蛋白濃度較高，有明顯差異，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。四組不同檢測方法甲狀腺球蛋白濃度比較情況見表二。

表二 四組不同檢測方法甲狀腺球蛋白濃度對比

2.3 符合率、特異性及靈敏度 與放射免疫技術相比，四組化學發(fā)光免疫技術檢測符合率、特異性及靈敏度較高，有明顯差異，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。四組不同檢測方法符合率、特異性及靈敏度比較情況見表三。

表三 四組不同檢測方法符合率、特異性及靈敏度對比

3 討論

放射免疫技術假陰性率及假陽性率較大，試劑有效期較短，且具有一定放射性，限制臨床應用。該技術又分為發(fā)光反應和免疫反應，在抗原或抗體上標記化學發(fā)光劑，將其與待測標本抗體或抗原經(jīng)特異性反應相互結合，產(chǎn)生復合物，通過磁場對結合態(tài)、游離態(tài)進行分離，加入發(fā)光底物或氧化劑，促使物質(zhì)氧化，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體，躍遷至基態(tài)，發(fā)射光子，經(jīng)發(fā)光強度檢測進行定性檢測和定量檢測[2]。該技術主要適用于腫瘤標志物分析、心臟疾病標記物測定、激素分析等。甲狀腺疾病患者的甲狀腺功能主要依靠檢測甲狀腺球蛋白判斷，因此，必須加強對患者甲狀腺球蛋白的定量檢測[3]。在本文研究中，對甲組、乙組、丙組和丁組分別進行放射免疫技術及化學發(fā)光免疫技術檢測，結果顯示，甲組經(jīng)放射免疫假陰性率為8.89%，經(jīng)化學發(fā)光免疫假陰性率為2.22%;乙組分別為11.11%、2.22%;丙組分別為6.67%、0%;丁組假陽性率分別是4.44%、2.22%，表明化學發(fā)光免疫技術可有效檢測甲狀腺疾病，假陰性率及假陽性率較低。甲組、乙組、丙組和丁組經(jīng)不同方法檢測甲狀腺球蛋白，化學發(fā)光免疫技術檢測濃度均高于放射免疫技術，表明化學發(fā)光免疫技術對有效檢測甲狀腺球蛋白具有重要作用。化學發(fā)光免疫技術檢測符合率、特異性及靈敏度均高于放射免疫檢測，表明化學發(fā)光免疫技術具有較高的檢測特異性及靈敏度，符合率較高。

綜上認為，化學發(fā)光免疫技術在臨床上應用價值較大，能為臨床診斷甲狀腺疾病提供有力依據(jù)，應予以推廣。

參考文獻：

[1] 李曉霞.化學發(fā)光免疫分析[J].延安大學學報（醫(yī)學科學版）.2012，16（17）：50-51.

篇3

【關鍵詞】腫瘤生物標志物；化學發(fā)光酶；免疫分析

作者：張艷波，宋秀，作者單位：132001吉林市人民醫(yī)院檢驗科

惡性腫瘤會給人類健康帶來嚴重威脅[1]。在惡性腫瘤篩查、診斷、預后及療效評估中，腫瘤生物標志物檢測發(fā)揮著重要的作用[2]?；瘜W發(fā)光免疫法主要是利用標記于抗體上物質(zhì)發(fā)光檢測的方法，在臨床上有著廣泛的應用[3]。本研究以62例原發(fā)性肝癌患者及62名健康體檢者為研究對象，探討化學發(fā)光免疫法在腫瘤生物標志物檢驗中的應用價值，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

以2013年4月～2015年4月本院收治的62例原發(fā)性肝癌患者為研究組，以同期到本院體檢的62名健康人為對照組。研究組：男32例，女30例；年齡35～70歲，平均年齡（68.2±5.5）歲。對照組：男33例，女29例；年齡35～70歲，平均年齡（68.7±5.2）歲。研究組與對照組一般資料對比，P＞0.05，具有可比性。

1.2方法

晨起抽取3ml空腹靜脈血，置于生化管，做離心處理，確保速率為3000r/min，半徑為15cm，分離出血清。以化學發(fā)光免疫法檢測兩組對象的α-L-巖藻糖苷酶（AFU）、γ-谷胺酰轉肽酶（GGT）、血清膽堿酯酶（CHE）、鐵蛋白（SF）。本研究所用儀器為ROCHEE601電化學發(fā)光免疫分析儀，以及由ROCHE公司生產(chǎn)的試劑盒，嚴格按照產(chǎn)品操作說明進行操作。

1.3陽性判斷標準[4]

AFU：＞40U/L；GGT：＞49U/L；CHE：＞25000U/L；SF：＞16mg/L。

1.4統(tǒng)計學分析

以SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1腫瘤生物標志物檢測結果

研究組AFU、GGT、CHE、SF水平分別為（48.3±17.2）U/L、（254.0±128.3）U/L、（45.3±10.5）×103U/L、（21.4±5.2）mg/L，高于對照組的（17.6±4.7）U/L、（30.5±25.0）U/L、（10.6±5.1）×103U/L、（10.0±3.2）mg/L，結果差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2陽性率檢出情況

研究組AFU、GGT、CHE、SF單個檢出陽性率分別為51.6%（32/62）、82.3%（51/62）、54.8%（34/62）、69.4%（43/62），高于對照組的0%、0%、0%、1.6%（1/62），結果差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

研究組聯(lián)合檢出陽性率為95.2%（59/62），高于對照組的1.6%（1/62）（P＜0.05）。

3討論

化學發(fā)光免疫法有著較高的靈敏度和特異性，且所需設備簡單，適用范圍較廣，在臨床上的應用較為廣泛。有大量臨床研究認為，化學發(fā)光免疫法在腫瘤生物標志物檢測中有著較好的應用效果，有助于惡性腫瘤的早期篩查、診斷、臨床治療評估與預后[5]。

本研究結果顯示，研究組患者AFU水平高于對照組（P＜0.05）。由此可知，一旦機體肝腎等組織存在病變，會提升血清中AFU活性。而且，有研究認為，原發(fā)性肝癌患者在經(jīng)過積極的治療后，血清中AFU水平會降低[6]。研究組SF水平高于對照組（P＜0.05）。這可能是因人體肝臟中存在眾多鐵蛋白，且肝臟是鐵蛋白循環(huán)的主要清除場所，因此，一旦機體出現(xiàn)肝臟病變，會提升鐵蛋白水平。本研究中，研究組GGT水平高于對照組（P＜0.05）。GGT廣泛存在于人體各個組織。有研究認為，GGT在前列腺中的含量最為豐富，能釋放進入血液，所以正常男性體內(nèi)GGT含量高于女性[7]。聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳可將GGT分為13種同工酶，以此作為惡性腫瘤患者輔助診斷指標有著較高敏感性。此外，研究組CHE水平高于對照組（P＜0.05）。CHE通常包括兩類，即真性膽堿酯酶與假性膽堿酯酶。CHE常見于人體肝、胰、子宮及中樞神經(jīng)白質(zhì)等處，為血漿固有酶，能對丁酰膽堿進行水解。然而，血清中CHE主要為假性膽堿酯酶，生成于肝臟，隨后進入血液，能對人體肝實質(zhì)合成蛋白的能力進行反映[8]。

篇4

[關鍵詞] CEA；殘余試劑；再利用；評估

[中圖分類號] R197.39 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）22-49-03

Preliminary evaluation of CEA residual reagent recycling in Abbott ARCHITECT I2000SR

ZHU Bo SHEN Wei HUANG Jiaqin YAN Li PENG Yusheng WANG Peng

Department of Clinical Laboratory， First People's Hospital of Yibin， Yibin 644000， China

[Abstract] Objective To evaluate the performance of recycling about CEA residual reagent in Abbott ARCHITECT I2000SR. Methods Recycle combined residual reagents， to evaluate the detection precision and recovery， and in accordance with the Committee of Clinical Laboratory Standards （NCCLS） EP9-A2 document solutions， comparative tests with the original reagents. Results The residual reagent CEA batch precision is 2.84%-3.69%， inter-day precision is 3.28%-4.86%， the recovery rate is 92.31%-104.53%， are in line with the relevant provisions； the two reagent CEA correlation coefficient r=0.996， the regression equation is Y=1.049X-0.521.The expected bias （Bc） was within allowed bias on the medical decision level （Xc）， so two methods can be accepted. Conclusion About Abbott Architect i2000SR， the performance of CEA residual reagents accords with clinical requirement and can be recycled.

[Key words] CEA； Residual reagent； Recycling； Evaluation

癌胚抗原（CEA）最早是在結腸癌患者和內(nèi)胚層（胃腸道）的上皮腫瘤中發(fā)現(xiàn)，是消化道腫瘤血清學篩選指標之一，也是當今體檢篩查的必查項目之一，準確測定患者血清CEA含量非常重要[1-2]。雅培（ABBOTT）公司ARCHITECT I2000SR全自動化學發(fā)光儀可以對血清CEA進行定量檢測，擁有靈敏度高、線性范圍寬、檢測速度快等特點[3]。但該儀器使用原裝進口試劑，固定人份數(shù)、條碼自動記錄、價格不菲。在實際使用中，當儀器提示“0 TEST”后，實際還有約20%的殘余試劑，如若棄掉，勢必是一種資源浪費。本研究對CEA殘余試劑的性能進行評估，以評價其能否進行回收再利用。

1 材料與方法

1.1 標本來源

宜賓市第一人民醫(yī)院檢驗科收集的患者血清，常規(guī)檢測CEA后，分為低、中、高3個濃度的標本，少量分裝，-20℃冷凍保存。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 美國雅培公司Abbot ARCHITECT I2000SR全自動化學發(fā)光分析儀。

1.2.2 原裝試劑 CEA檢測試劑盒及校準液均購自美國雅培公司；質(zhì)控物來自美國伯樂，批號：54541，54542，54543。

1.2.3 殘余試劑 按常規(guī)操作用完的同一批號試劑盒（儀器顯示0 TEST） ，將瓶中剩余量的試劑每3～4瓶合并為1瓶。輕輕充分混勻，將氣泡小心吸出。所有合并殘余試劑保證在有效期內(nèi)使用。

1.3 方法

1.3.1 精密度試驗 批內(nèi)精密度測定 取高、中、低三份不同濃度混合血清，用回收殘余試劑重復測定CEA 20 次；天間精密度測定 取高、中、低值混合血清各分裝20份，置-20℃保存，用回收殘余試劑每天測定1次，共20次。分別計算均值（x）、標準差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

1.3.2 回收試驗 制備混合血清，分別取950μl，四份，第1份加入50μL蒸餾水作為基礎樣品，其余分別加入CEA低、中、高濃度定值質(zhì)控血清50μL，使四份樣品總體積均為1mL。執(zhí)行3次重復檢測，計算每一標本平均值。與基礎樣品測定結果的差值為回收量。

1.3.3 對比試驗 根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）EP9-A2文件，每天收集8份新鮮血清，分別用兩種試劑進行雙份平行測定，按1～8、8～1順序測定，共測5天；以原裝試劑作為比較方法，殘余試劑為實驗方法，對結果進行對比分析和偏倚評估；殘余試劑結果為Y變量，原裝試劑為X變量，根據(jù)給定的醫(yī)學決定水平（Xc）及允許偏倚（T±20%），計算殘余試劑（Y）與原裝試劑（X）之間的系統(tǒng)誤差即預期偏倚（Bc）及其95%可信區(qū)間[4-6]。

1.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003和SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理，P

2 結果

2.1 精密度試驗

CEA批內(nèi)精密度、天間精密度見表1。

表1 CEA殘余試劑精密度試驗結果

均值（x） 標準差（SD） 變異系數(shù)（CV%）

批內(nèi)精密度 低值 3.85 0.14 3.69

中值 45.82 1.64 3.59

高值 273.68 7.77 2.84

天間精密度 低值 2.56 0.12 4.86

中值 25.34 0.83 3.28

高值 81.93 3.55 4.33

2.2 回收試驗

CEA殘余試劑在加入低、中、高濃度定值血清時的回收率。見表2。

2.3 對比實驗及偏倚評估

殘余試劑和原裝試劑檢測CEA結果所作散點圖，見圖1，兩試劑檢測結果呈良好的線性相關，其回歸方程：Y=1.049X-0.521，相關系數(shù)r為0.996， 兩種試劑在給定醫(yī)學決定水平（Xc）上的預期偏倚（Bc）及95%可信區(qū)間見表3。

圖1 殘余試劑和原裝試劑檢測CEA結果

表3 殘余試劑與原裝試劑檢測CEA在給定Xc的預期偏倚

及Bc95%可信區(qū)間

醫(yī)學決定水平（Xc）

（ng/mL） 允許偏倚（Ea）

（ng/mL） 預期偏倚

（Bc） Bc95%可信區(qū)間

低 高

5 1 -0.276 -1.037 0.485

20 4 0.459 -0.191 1.109

100 20 4.379 2.330 6.428

由上表可知：在醫(yī)學決定水平處的允許偏倚均大于Bc 95%可信區(qū)間的上限，偏倚可以接受。

3 討論

雅培ARCHITECT I2000SRSR化學發(fā)光分析儀的分析測定原理是吖叮脂在堿性環(huán)境中發(fā)光，通過測定發(fā)光量來檢測測定物的含量，具有準確、快速、無污染等優(yōu)點，是當今檢驗科在免疫定量檢測這一領域使用最為廣泛的儀器之一。但試劑為原裝試劑，價格昂貴，每瓶提示“0 TEST”時，實際上還有15%～20%的殘余量。如果能很好的再利用殘余試劑，將創(chuàng)造良好的經(jīng)濟效益。

回收再利用方法：最簡單的方法以工程師用戶名登陸，在主屏幕下選擇Reagents，再選擇reagent history，選中將要加入的殘余試劑的相應項目信息，點Delete鍵刪除。把殘余試劑盒重新裝載掃瞄后，儀器記錄又恢復到“100TEST”。另外可以將回收合并試劑直接放在另一臺相同型號儀器上檢測，儀器會默認為是一盒新試劑。但在回收合并過程中也有幾點注意事項：（1）試劑報零后應及時取出，加蓋放2～6℃冰箱，以免液體蒸發(fā)，影響結果；（2）合并試劑時每試劑瓶內(nèi)液體不能多于原裝新試劑的20%，否則將檢測不出結果；（3）合并試劑時，每套試劑的各個試劑瓶之間是一一對應關系，千萬不能放混，否測將報試劑錯誤，掃描不能通過。

CEA是消化道腫瘤實驗室診斷和判斷預后的重要指標，也是當今體檢篩查的必查項目之一，是本實驗室用量最大的檢測試劑之一。CEA殘余試劑和原裝試劑的檢測原理和程序過程完全一致，因此本研究沒有進行全面的系統(tǒng)評價，僅從精密度、回收率和對比試驗三個方面進行評價，對比試驗采用澳大利亞室間質(zhì)評標準（T±20%）作為判斷標準[7]。本研究所有檢測均是在室內(nèi)質(zhì)控在控的前提下來進行的。精密度是反映系統(tǒng)檢測結果的重復性。本研究中批內(nèi)精密度、天間精密度CV均小于5%，滿足臨床精密度要求[8]。回收實驗是反映檢測系統(tǒng)準確性的一種有效方法，因它可檢系統(tǒng)的比例誤差。本文回收率分別為92.31%、104.03%、104.53%，分別表明有7.69%、5.97%和5.47%的比例誤差，都小于允許誤差（T±20%）。以上均表明CEA殘余試劑有

表2 CEA回收試驗結果

原樣品

（μL） 定值血清

（μL） 定值血清濃度

（ng/mL） 蒸餾水

（μL） 加入濃度

（ng/mL） 測定濃度

（ng/mL） 回收濃度

（ng/mL） 回收率

（%）

基礎樣品 950 0 - 50 0 7.53 - -

L 950 50 2.51 0 0.13 7.65 0.12 92.31

M 950 50 24.80 0 1.24 8.82 1.29 104.03

H 950 50 79.60 0 3.98 11.69 4.16 104.53

（下轉第頁）

（上接第頁）

較好的重復性和準確性。方法比較試驗所得的結果是配對資料，可進行配對t檢驗，經(jīng)檢驗t=1.073，P>0.05，也同樣顯示兩試劑結果差異無統(tǒng)計學意義。但t檢驗在臨床對比研究中有時并不能很好地反映兩方法間的相關性和一一對應關系，所以本研究選用的是相關和回歸分析方法，此法在對比研究中應用更為普遍，能夠計算出任意濃度的系統(tǒng)誤差。在回歸方程Y=a+bX中，a表示恒定誤差，b表示比例誤差，還可以根據(jù)回歸方程的a、b值，計算出候選方法預期偏倚，并與不同醫(yī)學決定水平（Xc）的允許偏倚作比較，從而對評價方法的可接受性作出判斷。本研究中，回歸方程Y=1.049X-0.521，斜率顯示出的比例分析誤差是2.70%，截距=0.521ng/mL，表明有0.521ng/mL 的固定誤差。相關系數(shù)r為0.996，大于0.975，表明對比試驗的濃度范圍夠?qū)?，適合采用簡單線性回歸分析，且兩種試劑檢測結果相關性良好[8]。由此計算出各選定醫(yī)學決定水平下的預期偏倚及可信區(qū)間，與允許偏倚比較得出殘余試劑與原裝試劑檢測結果相當，可以接受 。這說明在檢測的過程中，殘余試劑與原裝試劑具有可比性，差異無統(tǒng)計學意義，不需重新校標，可直接用于病人標本的檢測，結果準確可靠。

綜上所述，雅培ARCHITECT I2000SR化學發(fā)光CEA殘余試劑的回收再利用方法簡便，結果的準確性和重復性均滿足臨床要求，與原裝試劑的測定結果具有可比性，可以用于臨床檢測。本研究僅是以CEA為例，后面還將陸續(xù)對雅培ARCHITECT I2000SR化學發(fā)光其它殘余試劑的利用進行評估，以期在保證檢測結果準確的前提下，創(chuàng)造最大的經(jīng)濟效益。

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篇5

關鍵詞：化學發(fā)光免疫分析法 血清C肽 胰島素

Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.01.209

Chemiluminescence immunoassay detection serum C peptide and insulin clinical analysis

Zhang Yangwen

Abstract：Objective：To investigate chemiluminescence immunoassay detection serum C peptide and insulin clinical application value.Methods：December 2010 to December 2012 were our Ⅱ diabetes patients were set to observe group， will be in the same period of our medical without diabetes health is set to 120 cases of control group， the two groups of serum insulin and c-peptide test comparing.Result：Two groups of C-P Insulin and compared with significant difference （P

Keywords：Chemiluminescence immunoassay Serum C peptide Insulin

【中圖分類號】R9 【文獻標識碼】B 【文章編號】1671-8801（2012）01-0231-01

最近幾年，非同位素免疫檢測在世界各國得到了越來越廣泛的應用，化學發(fā)光免疫分析就是其中一種[1]。現(xiàn)對2011年06月至2012年12月我院收治的Ⅱ型糖尿病患者應用化學發(fā)光免疫分析法檢測血清C肽與胰島素取得的良好情況報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料。將2011年06月至2012年12月我院收治的Ⅱ型糖尿病患者120例設為觀察組，男72例，女48例，平均年齡57.9±4.1歲，病程1～4年，患者均無糖尿病并發(fā)癥。將同期在我院體檢的非糖尿病健康者120例設為對照組，男69例，女51例，平均年齡56.1±3.9歲，均無糖尿病家族史。受試者在處于安靜狀態(tài)的條件下，保持平臥位，抽取三到四毫升的靜脈血，標本全部都按照實驗室常規(guī)工作進行對應的分析測定。

1.2 檢測方法?；瘜W發(fā)光技術用到的抗體有兩種，都是常量的?？贵w一位于標記試劑里面，為吖啶酯標記鼠單克隆抗C肽?？贵w二位于固相試劑里面，屬于和順磁顆粒予以共價結合形成的鼠單克隆抗C肽。試劑批號不同，對應的標準曲線也不一樣，用前借助條形碼閱讀器，也可以通過鍵盤輸定標曲線數(shù)值到系統(tǒng)里面，然后通過C-P以及Insulin定標液這兩點定標的方法對標準曲線進行對應的校準[2]。測試樣品的時候，一定要嚴格準確的測量質(zhì)控品。通過西門子ADVIA CentaurXP化學發(fā)光免疫分析儀實施項目檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理。采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。采用X±S表示，采用X2檢驗。差異有顯著性為P

2 結果

兩組的C-P及Insulin相比差異具有顯著性（P

3 討論

準確嚴格的測定胰島素和C肽，可以說對于正確地進行糖尿病的診斷，準確地做出分析治療，以及隨后的相關回訪，意義都是非常的重大的。尤其是C肽，其無論是對于Ⅰ型，還是Ⅱ型的糖尿病來講，都具有很好的診斷指引意義。借助于胰島素對糖尿病進行治療的過程中，一個特殊的問題就是如何更加準確的測定胰島素的存在[3]。之所以這樣說，是因為外周循環(huán)里面存在的抗體以及外源性的胰島素極大的干擾了胰島素的有關測定。不過用胰島素予以具體治療的病患，抗體對于C肽分析則沒有特別明顯的干擾。C肽測定能夠幫助對患者內(nèi)源性胰島素的具體儲備情況做出準確的評估，相比于胰島素而言，這種方法更加的可靠。無論是胰島素，還是C肽分泌出以后回來到靜脈血循環(huán)里面，經(jīng)由肝臟，最終進入到體內(nèi)的系統(tǒng)循環(huán)里面。C肽有三十五分鐘的半衰期，胰島素只有五到十分鐘的半衰期[4]。肝臟對C肽基本上沒有什么攝取能力，故而代謝清除率非常的緩慢，也就是在外周血里面，C肽和胰島素相比，穩(wěn)定性更強，能夠更加精準的對β細胞的具體分泌情況予以反映，對于借助胰島素進行對應治療的病人，這一指標更為有用。

試驗證實，糖尿?、蛐突颊吆徒】到M相比，對應的胰島素以及C肽都明顯的偏低，差異顯著（P

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篇6

呋喃它酮是一種人工合成的硝基呋喃類抗生素，主要用于畜禽和水產(chǎn)動物的各種腸道感染性疾病的治療及促進生長的添加劑，曾經(jīng)在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應用。有關研究證明，呋喃它酮及其代謝物5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ）具有相當大的毒性和副作用，能誘導有機體基因突變及致畸胎，且能誘發(fā)癌癥[1，2]。美國、加拿大、中國和歐盟的很多國家都已規(guī)定動物源性食品中呋喃它酮及其代謝物AMOZ殘留為不得檢出。但是因為其價格低廉、療效好，目前違法使用現(xiàn)象在很多國家仍然存在，故有必要對動物源性食品中呋喃它酮及其代謝物AMOZ加強監(jiān)控[3]。由于呋喃它酮原藥不穩(wěn)定， 進入動物體內(nèi)后會被迅速代謝和分解，對原藥的檢測難度很大，但其代謝物AMOZ可以蛋白結合物的形式長期、穩(wěn)定存在組織內(nèi)，在適當?shù)乃嵝詶l件下，這些結合殘留物可以從蛋白質(zhì)中釋放出來，因此通常將AMOZ作為監(jiān)測呋喃它酮的靶化合物[1，4，5]。

目前，AMOZ 檢測方法主要有色譜法[6～9]、免疫分析法[10] 等。色譜法準確、靈敏，但操作復雜、設備昂貴、檢測速度慢，需要專業(yè)技術人員。而免疫分析法具有簡單、快速、靈敏度較高、特異性強和高通量等優(yōu)點。免疫分析法的關鍵是高親和力和特異性的抗體的制備，其中基因工程重組單鏈抗體是將天然抗體的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL通過一條柔軟的連接肽連接成的單鏈分子，不僅具有高親和力和特異性，而且還可以通過工程菌發(fā)酵快速大量制備，極大地降低了抗體生產(chǎn)成本，縮短了抗體生產(chǎn)周期。化學發(fā)光免疫分析是近十年來發(fā)展起來的一項將高靈敏度的化學發(fā)光與高特異的免疫分析相結合的新興的免疫檢測技術，具有檢測特異性好、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高等優(yōu)點，能顯著提高檢測的靈敏度，并且比常用的其他免疫分析法的靈敏度都高[11～14]。迄今為止，文獻報道的AMOZ免疫分析法都是建立在傳統(tǒng)的多克隆或單克隆抗體基礎上的ELISA法，利用重組單鏈抗體建立的AMOZ化學發(fā)光酶免疫分析方法還未見報道。本研究利用重組抗AMOZ衍生物單鏈抗體，建立了測定蝦肉中AMOZ殘留的間接競爭化學發(fā)光酶免疫分析新方法。本方法簡便、快速、準確、儀器設備簡單，靈敏度高于ELISA法，測定結果和HPLC-MS/MS法測定結果呈現(xiàn)良好的相關性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

篇7

【摘要】

基于苯海拉明對聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)2+3)的電化學發(fā)光的增敏作用和絲素蛋白聯(lián)吡啶釕復合膜修飾玻碳電極穩(wěn)定好的特點，建立了一種以絲素蛋白多孔膜聯(lián)吡啶釕復合物修飾的玻碳電極電化學發(fā)光檢測苯海拉明的新方法。結果表明，該修飾電極具有很好的電化學活性和電化學發(fā)光(ECL)響應。在最佳實驗條件下，苯海拉明濃度在1.0×10－4～1.0×10－7 mol/L范圍內(nèi)與其相對發(fā)光強度呈良好的線性關系(r=0.9989)； 檢出限為2.3×10－7 mol/L（S/N=3）。連續(xù)平行測定3.78×10－5 mol/L苯海拉明5次，發(fā)光強度的RSD為1.76%。 用于實際樣品中苯海拉明的測定，結果滿意。

【關鍵詞】 苯海拉明；電致化學發(fā)光； 聯(lián)吡啶釕；絲素蛋白；化學修飾電極

Abstract Based on the increasing effect of diphenhydramine on Ru(bpy)32+ electrochemiluminescence (ECL) system， an ECL method was developed for the determination of diphenhydramine hydrochloride by silk fibroin (SF)Ru(bpy)2+3 composite film modified glassycarbon electrode. A highlysensitive sensor was prepared based on SFRu(bpy)2+3 composite film modified glasscarbon electrode. Its fabrication procedure， related experiment conditions and electrochemical characterization were studied. Under the optimum experimental condition， the linearity of diphenhydramine concentration to ECL intensity was achieved (r2=0.9989) in the concentration of diphenhydramine hydrochloride of 1.0×10－4－1.0×10－7 mol/L and the detection limit (S/N=3) was 2.3×10－7 mol/L. The RSD for 5 times determination of 3.78×10－5 mol/L diphenhydramine was 1.76%.

Keywords Diphenhydramine; Electrochemiluminescence; Tris(2，2′bipyridine)ruthenium; Silk fibroin; Modified electrode

1 引 言

鹽酸苯海拉明(Diphenhydramine hydmchloride，DPH)化學名為N，N二甲基2(二苯基甲氧基)乙胺鹽酸鹽，又名苯那君，是一種氨基醚類衍生物，為常用的抗組胺藥物。具有抗過敏、止癢、消炎、消腫、鎮(zhèn)靜及鎮(zhèn)吐等作用，臨床主要用于蕁麻疹、枯草熱、過敏性鼻炎和皮膚瘙癢等皮膚黏膜變態(tài)性疾病。目前，對DPH的測定方法主要有原子吸收法[1]、疏水作用電動色譜法[2]、分光光度法[3]、離子選擇電極法[4]、流動注射分光光度法[5]﹑氣相色譜法[6，7]及電化學法[4]等，分別用于片劑[1，3，4，7]、藥膏[2]、膠囊[5]和糖漿[5，7]中DPH的測定。雖然這些方法均可直接或間接測定1×10－5～1×10－3 g/L的DPH，但仍不能完全滿足臨床痕量分析的要求。而且這些方法多存在操作繁瑣或設備昂貴、費時等缺點。中國藥典2005版采用容量法測定苯海拉明[8]，此方法操作繁瑣，終點不易觀察，且僅適用于常量分析。因此，開發(fā)簡便靈敏測定DPH的方法具有重要意義。

絲素蛋白(Silk fibroin，SF)是從蠶絲中提取的一種優(yōu)良的天然高分子材料， SF具有無毒性、無刺激性、無過敏性和良好的生物相容性[9，10]，再生SF已被用于傷口保護、細胞培養(yǎng)、生化酶固定、隱形眼鏡鏡片和藥物釋放器等方面[11]。用溶解絲素制備的絲素膜在現(xiàn)代科學領域中具有廣泛的應用，如人工皮膚材料、藥物控制釋放載體、固定酶載體、生物傳感器等[12～14]。實驗證實，SF可以對多種細胞表現(xiàn)較好的粘附和增殖，具有良好的細胞相容性，并可以通過共混、接枝、交聯(lián)等方式提高或改變SF的理化性能[15，16] 。

聯(lián)吡啶釕是目前應用范圍最廣和研究最活躍的電化學發(fā)光體系［17，18］。本實驗是以SF作為模板，利用SF與Ru(bpy)2+3相互作用，反應形成新的物質(zhì)或相互吸附得到的混合物膜，從而制備了新型傳感器，實現(xiàn)了Ru(bpy)2+3的固定。實驗結果表明，此修飾電極對聯(lián)吡啶釕具有很好的電化學和電化學發(fā)光特性。

目前，關于用電化學發(fā)光測定DPH的報道較少。以SF固定聯(lián)吡啶釕構建電化學發(fā)光傳感器尚未見報道。本研究用SF膜固定聯(lián)吡啶釕修飾玻碳電極，建立了測定DPH的電化學發(fā)光新方法， 實現(xiàn)聯(lián)吡啶釕的循環(huán)使用，并成功地應用于藥片中DPH含量的測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

MPIE型電致化學發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁電子科技有限公司)；DL60D型超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；微量移液器（德國Eppendorf公司）。三電極系統(tǒng): SF膜修飾玻碳電極為工作電極，Pt絲為對電極，Ag/AgCl為參比電極（飽和KCl溶液）。

0.1 mmol/L苯海拉明標準儲備液(用時現(xiàn)配)：準確稱取0.0029 g 苯海拉明，用水溶解后，轉移至100 mL棕色容量瓶中，用水定容，超聲脫氣后冷藏于冰箱中備用。1.0 mmol/L聯(lián)吡啶釕(Aldrich公司)儲備液：準確稱取六水合三（2.2聯(lián)吡啶）氯化釕0.0374 g， 用水溶解后，轉移至50 mL棕色容量瓶中，用水定容，用超聲波除氣后放入冰箱中（4 ℃）冷藏； 家蠶廢絲（汰頭， 柳州市匯利豐繭絲有限責任公司）； 0.1 mol/L PBS緩沖液（pH 7.5）。實驗用水均為二次石英亞沸水。

2.2 電化學發(fā)光傳感器的制備

2.2.1玻碳電極的預處理

將玻碳電極分別用金相砂紙打磨， A12O3粉拋光至鏡面，用大量水沖洗后，依次用無水乙醇、丙酮、水超聲波清洗，將其置于0.10 mol/L PBS（pH 7.5）中CV掃描，得到穩(wěn)定的CV曲線為止，室溫晾干待用。

2.2.2 再生絲素液的配制

將廢蠶絲先用40 ℃溫水浸泡30 min，再浸漬于煮沸的0.5% Na2CO3中脫膠[12]1.5 h， 蠶絲與NaCO3溶液比為1∶30（w／V)， 然后取出洗凈、干燥，并用苦味酸胭脂紅指示劑檢驗脫膠是否完全。用40% CaCl2溶液煮沸攪拌直至溶解，溶液為黃棕色。將溶解的絲素置于截留范圍8000～14000 Da的34 mm透析袋中，分別以自來水、蒸餾水流動透析2 d，直至透析液電導率＜1×10－5 Ω－1， 可認為絲素液中的小分子已處理掉，即得再生絲素液。

2.2.3 SFRu(bpy)2+3膜修飾玻碳電極的制備

取上述再生絲素液80 μL，與100 μL 0.1 mmol/L聯(lián)吡啶釕混合反應，即可得到SFRu(bpy)2+3復合物溶液。然后將6μL SFRu(bpy)2+3復合物溶液均勻涂在處理好的玻碳電極表面，在室溫下自然干燥24 h后，放入0.10 mol/L PBS（pH 7.5）中CV掃描。電極再用水沖洗3次，用氮氣吹干后，于室溫下干燥保存。

2.3 實驗方法

實驗在MPIE型電致化學發(fā)光工作站上進行。采用三電極系統(tǒng)。將0.2 mL 0.1 mol/L PBS緩沖液溶液（支持電解質(zhì)）加入電解池，采用CV（0.2～1.3 V）掃描，然后記錄發(fā)光信號，作為空白。在上述溶液中加入一定濃度的DPH溶液0.12 mL， 采用相同的方法測定發(fā)光信號值，得相對化學發(fā)光強度（扣除空白信號）。繪制相對峰高強度與DPH濃度的校準曲線，同時對樣品進行分析測定。

發(fā)光強度時間曲線由MPIE型電致化學發(fā)光工作站給出。電化學發(fā)光（ECL）檢測池的結構如圖1所示。位于檢測池下方的光電倍增管用于收集待測樣品的ECL強度，光電倍增管負高壓為800 V。溶液測定前用超聲波除氣5 min。 實驗在室溫下進行，所有電位值均相對于參比電極Ag/AgCl。

3 結果與討論

3.1 SF Ru(bpy)2+3修飾玻碳電極中聯(lián)吡啶釕電化學行為研究

考察了SFRu(bpy)2+3/GC/CME的電化學行為。實驗發(fā)現(xiàn)，固定于SF膜中的聯(lián)吡啶釕分子仍具有良好的電活性。圖2a為CME在0.1 mol/L PBS中的CV圖，圖2b為該電極在0.1 mmol/L DPH0.1 mol/L PBS中的CV圖。由圖2可見，固定于SF膜中的聯(lián)吡啶釕分子仍具有良好的電活性，具有明顯的氧化峰和還原峰。

3.2 鹽酸苯海拉明在SF Ru(bpy)2+3修飾玻碳電極上的電化學發(fā)光行為研究

DPH在SFRu(bpy)2+3/GC/CME中聯(lián)吡啶釕電化學發(fā)光行為如圖3所示。曲線a為該修飾電極在0.1 mol/L PBS中的電化學發(fā)光圖；曲線b為該修飾電極在0.1 mmol/L DPH0.1 mol/L PBS中的電化學發(fā)光圖。從圖3b觀察到發(fā)光信號明顯增強，從1.0 V開始出現(xiàn)發(fā)光信號，到1.12 V達到最大值，這與圖2a中固定的聯(lián)吡啶釕在1.12 V氧化峰電流達到最大值相符，也說明SFRu(bpy)2+3/GC/CME對DPH具有很好的ECL響應。

3.3 SF修飾量的選擇

SF在玻碳電極表面的修飾量對聯(lián)吡啶釕氧化峰電流和ECL強度都會產(chǎn)生影響。實驗考察了修飾量（V）在2～8 μL之間對ECL行為的影響。隨著覆蓋量增加，聯(lián)吡啶釕ECL強度增加。當修飾量為6 μL時， ECL強度達到最大值；繼續(xù)增加修飾量，聯(lián)吡啶釕氧化峰電流和ECL強度反而稍微降低（圖4）。因為隨著修飾量的增多，膜厚度也不斷增大，電子在膜中阻力變大。本實驗中SF修飾量選擇6 μL。

3.4 緩沖溶液及pH值對發(fā)光行為的影響

介質(zhì)是影響電化學發(fā)光重要因素。本實驗考察了硼酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、碳酸鹽緩沖液對SF膜修飾玻碳電極電化學發(fā)光信號強度和電化學發(fā)光信號穩(wěn)定性的影響。結果表明，以PBS為介質(zhì)時，DPH增敏的聯(lián)吡啶釕電化學發(fā)光信號與其空白電化學發(fā)光信號的信噪比最大，且重現(xiàn)性較好，其最佳濃度為0.1 mol/L?？疾炝藀H 6.0～9.0的PBS（圖5），在pH=6.0時，發(fā)光強度較弱；隨著pH值增大，發(fā)光強度逐漸增大，當pH=7.50時達到最大值。由于DPH帶有胺基，其氨原子上有一對孤電子，易與質(zhì)子結合，因此在酸性溶液中會與H+反應形成正離子。pH值繼續(xù)變大， 發(fā)光強度有所降低，可能是由于溶液中過多的OH－參與在電極上的競爭反應造成高價態(tài)聯(lián)吡啶釕的減少。實驗中選擇PBS緩沖液（pH=7.5）。

3.5 方法的評價

在選定的最佳條件下，通過電致化學發(fā)光工作站記錄不同濃度DPH標準溶液在SF Ru(bpy)2+3/GC/CME上的發(fā)光強度響應曲線，DPH濃度在1.0×10－4～1.0×10－7mol/L與其相對峰高呈線性關系，其線性回歸方程為I(counts )=5×107C+1003(r=0.9989)。方法的檢出限為2.3×10－7 mol/L（S/N=3）。

在含有3.78×10－5 mol/L DPH溶液中，考察了常見的藥物賦形劑、無機離子以及有機化合物對方法的影響（＜±5%）。結果表明：1000倍的Na+， K+， NH＋4， Ca2+， Mg2+， NO－3， CO2－3； 300倍的淀粉均不產(chǎn)生干擾； 5倍的半胱氨酸和尿酸產(chǎn)生干擾。

固定有聯(lián)吡啶釕的SF復合物膜修飾的玻碳電極有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。使用前放置在PBS緩沖液中進行活化，對3.78×10－5mol/L DPH連續(xù)平行測定10次，發(fā)光強度的RSD為1.76 %，說明該傳感器有很好的重現(xiàn)性。將修飾電極放置20 d后，在同樣的條件下對同樣濃度的DPH 連續(xù)測定10次，發(fā)光強度如圖6所示，說明該傳感器具有很好的穩(wěn)定性。實驗觀察到修飾電極放置一段時間后對同樣濃度DPH響應強度并沒有降低，說明SF作為修飾材料固定聯(lián)吡啶釕中的發(fā)光試劑流失現(xiàn)象不嚴重。

3.6 樣品分析

取10片DPH緩釋片研磨粉碎混勻，后稱取相當于1片DPH含量的樣品量，加水溶解后過濾，濾液定容至100 mL后收藏于棕色容量瓶中，稀釋后以確定的最佳實驗條件進行測定，結果如表1。

在一系列樣品中加入標準液進行回收率實驗， 測得回收率見表1。結果表明： 回收率為92.7%～101.2%，可見本方法可以用于DPH含量測定。表1 樣品測定及回收率實驗（略）

參考文獻

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篇8

關鍵詞 鍍鉑； 鉛筆芯； 熱電極； 核黃素； 電致化學發(fā)光

1 引 言

黃素是7,8二甲基異咯嗪的衍生物，根據(jù)異咯嗪環(huán)上N（10）位置所連基團的不同，主要分為核黃素（RF）、黃素腺嘌呤單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）[1]。作為動植物中廣泛存在的黃素蛋白的輔基，RF參與了食物的吸收利用以及身體內(nèi)能量的轉化過程。如果人體缺乏RF，細胞生長將會明顯受損，而且會出現(xiàn)一些眼部及皮膚方面的疾病。RF廣泛存在于生物、藥物及食物中[2]，因而對它的檢測具有重要意義。傳統(tǒng)的檢測方法有熒光法[3]、毛細管電泳或高效液相色譜熒光檢測法[4,5]、電化學方法[6]、化學發(fā)光法[7,8]等。電致化學發(fā)光法（ECL）結合了電化學和化學發(fā)光的特點，具有選擇性好、快速靈敏、儀器簡單便宜等優(yōu)點［9］。利用ECL法測定RF的文獻已有報道[10～12]。

熱電極技術只對電極加熱，因此具有能產(chǎn)生熱對流而增強傳質(zhì)，促進電極反應等特點，已成功應用于電分析領域。Sun等詳細研究了鉛筆芯熱電極（HPGE）的電極直徑與升溫性能的關系[13]，并在該電極上利用吸附溶出法測定了RF[14]。Lin等將熱電極技術引入到ECL分析系統(tǒng)，通過研究電極表面溫度對Ru（bpy）32＋[15]、光澤精[16]和魯米諾[17] ECL行為的影響，發(fā)現(xiàn)升高電極表面溫度能加快物質(zhì)的擴散速度、降低電極表面的污染、提高發(fā)光信號的重現(xiàn)性。

鉛筆芯熱電極（HPGE）具有升溫性能良好、電勢窗口寬和易于進行表面修飾等特點，但是由于電極結構的多孔性，表面吸附性較強。Pt絲熱電極表面不易吸附，但是電極制作技術要求較高，而且價格相對昂貴。本研究結合了HPGE和Pt熱電極的優(yōu)點，制備了鍍鉑鉛筆芯熱電極（Pt/HPGE），在此電極上研究了溫度對Ru（bpy）32＋C2O42－ ECL體系的影響。利用核黃素對Ru（bpy）32＋C2O42－ ECL體系的猝滅作用，實現(xiàn)了對RF的靈敏檢測， 并成功應用于實際維生素片中RF的定量檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

超微弱化學發(fā)光檢測儀 （中科院生物物理研究所）；CHI 440電化學工作站（上海辰華儀器公司）。Ru（bpy）3Cl2•6H2O （St. Louis, MO, USA），以水配成4×10－3 mol/L溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆?；核黃素（AR，國藥集團化學試劑有限公司），以0.10 mol/L醋酸溶液配成2.657×10－4 mol/L儲備液，4 ℃避光保存?zhèn)溆?，使用時用0.1 mol/L KCl稀釋至所需濃度。其它試劑均為國產(chǎn)分析純，未做進一步純化。實驗用水均為Millipore MiliQ系統(tǒng)凈化超純水（18.2 MΩ•cm， Millipore, Bedford, MA, USA）。

鉛筆芯（Φ 0.38 mm, Hi Polymer 300 EB, Japan）分別用不同粗細的金相砂紙打磨至Φ 100

SymbolmA@ m。設計制作好一定規(guī)格的PCB板，將打磨好的鉛筆芯用銀導電膠固定到PCB板上（電極長度為單邊5 mm），烘干后封膠，并于70 ℃下烘烤至密封膠完全固化，得鉛筆芯熱電極（HPGE）。鍍鉑液的組成為3.0 mmol/L H2PtCl6•6H2O和0.5 mol/L H2SO4。實驗前, 溶液通氮除氧15 min。采用循環(huán)伏安法，掃描電位0～－0.3 V（vs. SCE），掃速為100 mV/s, 掃描50圈，即得鍍鉑鉛筆芯熱電極（Pt/HPGE）。

2.2 實驗方法

采用三電極系統(tǒng)，鉑片電極（99.9%，Goodfellow, UK）為對電極, 飽和甘汞電極（上海辰華儀器公司）為參比電極。工作電極在PBS（pH 7.4）中0～0.8 V循環(huán)掃描10圈更新。將發(fā)光池清洗干凈，移取10 mL PBS（pH 7.4）緩沖液于發(fā)光池中，分別加入1 mL 1.0 mol/L KCl，100

SymbolmA@ L 4.0 mmol/L Ru（bpy）32＋及100

SymbolmA@ L 0.1 mmol/L C2O42－。工作電極和對電極固定好后置于溶液中，工作電極正對著光電倍增管PMT （高壓設為 －750 kV。對電極施加0.4～1.4 V 的電位掃描，同時記錄發(fā)光信號。以一定電位下發(fā)光峰的峰值為ECL 強度，并以加入核黃素前后的發(fā)光信號差（ΔI＝I0－ Is）對核黃素定量分析。

樣品預處理：取10片維生素片（VB2）研細，稱取適量粉末，用水溶解后超聲20 min, 以3000 r/min離心20 min, 取上層清液過濾，以水稀釋至RF濃度約為0.2 mmol/L, 于4 ℃冰箱保存。檢測時，以PBS稀釋至所需濃度。

分 析 化 學第39卷

第12期吳愛紅等： 核黃素在鍍鉑鉛筆芯熱電極上的電致化學發(fā)光檢測

3 結果與討論

3.1 Pt/HPGE的表征

將HPGE和Pt/HPGE分別置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在室溫下考察其循環(huán)伏安行為（圖1A）。HPGE在H2SO4溶液中基本上沒有電化學響應，而在Pt/HPGE上則明顯觀察到Pt的特征峰，即活性物質(zhì)氧和氫的吸附和脫附峰，說明該電極具有與純Pt電極類似的電化學性質(zhì)，即Pt已經(jīng)成功地修飾到電極表面。用SEM表征鍍鉑前后電極的表面形貌（圖1B），在鉛筆芯電極表面均勻地鍍上了一層Pt粒子，其粒徑約為150～200 nm。Pt鍍層的存在，極大增加了電極的有效面積。[TS（][HT5”SS]圖1 A. HPGE和Pt/HPGE在0.1 mol/L H2SO4中的CV圖; B. 電極升溫曲線; C. 電極表面SEM表征圖

Fig．1 A. CVs of heated pencil graphite electrode （HPGE） and Pt/HPGE in 0.1 mol/L H2SO4; B. Relationship between temperature rise and heating current; C. SEM images[HT][TS）]

采用文獻[13]報道的電勢測溫法可得到電極表面溫度差（ΔT）與加熱電流平方（I2）的關系。如圖1C，在相同的加熱電流下, Pt/HPGE表面能夠上升的溫度明顯比HPGE高。這可能是由于金屬鉑比碳基底具有更好的導電性引起的。

3.5 電極的重現(xiàn)性

采用平行制備的5根電極測定Ru（bpy）32＋C2O42－的響應情況，相對標準偏差為6.0%。對于同一根電極，由于RF在電極表面會有一定程度的吸附，因此需對工作電極進行更新處理。如前所述，電極可以通過在PBS溶液（pH 7.4）中循環(huán)掃描而得到更新。分別在常溫18 ℃及加熱電極到38 ℃時，對1.33×10－8 mol/L RF進行多次平行測定，每次重新測定前均用上述方法更新電極，ΔIECL相對標準偏差（RSD，n＝9）分別為5.4%和5.1%，表明電極具有良好的重現(xiàn)性。

3.6 干擾研究

研究了某些無機離子及生物活性物質(zhì)對核黃素ECL檢測的干擾情況。當RF濃度固定為1.0

SymbolmA@ mol/L時，100倍的Ca2＋, Mg2＋, Fe2＋, Zn2＋, Cu2＋, SO42－和NO3－，50倍的抗壞血酸、煙酰胺、環(huán)糊精、淀粉、檸檬酸根、乳糖、葡萄糖和蔗糖對其測定都無明顯干擾（相對誤差

3.7 維生素片中核黃素含量的測定

當電極表面溫度升高到58 ℃時，采用標準加入法對實際樣品進行定量測定和回收率實驗，（表1）。實驗測得RF的回收率在97.0%～106.0% 之間，實際樣品中RF測得量平均為標示含量的102.8%，說明本方法可用于實際藥物中RF的分析檢測。

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Determination of Riboflavin by Electrochemiluminescence at

Platinum Coated Heated Pencil Graphite Electrode

WU AiHong, SUN JianJun*, WU ShaoHua

（Key Laboratory of Analysis and Detection Technology for Food Safety, Ministry of Education,

College of Chemistry and Chemical Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350002）

Abstract A platinum coated heated pencil graphite electrode （Pt/HPGE） was fabricated and its properties were characterized by cyclic voltammetry （CV） and scanning electron microscopy （SEM）, etc. It was demonstrated that Pt/HPGE had unique properties such as cheapness, easy preparation, good reproducibility and sensitive temperature response. The Pt/HPGE was employed to detect riboflavin （RF） sensitively based on the quenching effect of RF on Ru（bpy）32＋/C2O42－ electrochemiluminescence （ECL） system. The limit of detection was 1.9×10－10 mol/L （S/N＝3） at an electrode temperature of 58 ℃, which clearly lower than that at room temperature. The method was applied to the determination of RF in vitamin pills with an average recovery of 102.8%.

篇9

甲鈷胺(mecobalamin)是一種周圍神經(jīng)障礙治療藥物,是維生素B12的甲基衍生物,臨床主要用于治療糖尿病神經(jīng)障礙及多發(fā)性神經(jīng)炎等周圍神經(jīng)疾病,也用于治療因缺乏維生素B12引起的巨紅細胞性貧血。與其他維生素B12相比,甲鈷胺對神經(jīng)組織具有更好的傳遞性,在體內(nèi)通過甲基轉換反應可促進神經(jīng)細胞內(nèi)的核酸-蛋白質(zhì)-脂質(zhì)代謝以及神經(jīng)髓鞘的合成,修復被損害的神經(jīng)組織,改善代謝障礙。此外甲鈷胺還可以抑制神經(jīng)組織傳導的異常興奮,促進正紅血母細胞的成熟與分裂,促進血紅素的合成, 改善貧血者的血象[1-3]。甲鈷胺制劑的主藥含量為每片500μg,給藥后體內(nèi)血藥濃度極低( ng·L-1級),很難用一般的方法進行檢測。本試驗建立了甲鈷胺血藥濃度的化學發(fā)光微粒子免疫測定方法(chemiluminescentmicrop- article immunoassay,CMIA),并對甲鈷胺膠囊的生物等效性進行研究。目前國內(nèi)外尚未見有關于該方法測定甲鈷胺人體內(nèi)血藥濃度的報道。

1　材料與方法

1·1　儀器 ARCHITECTTMi2000SR(ABBOTT LABORATO- RIES,USA);YKH-Ⅱ型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠); KQ-50型超聲清洗儀(上海超聲波儀器廠);TGL-16C型高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1·2　藥品和試劑甲鈷胺標準對照品(北京市福瑞康正醫(yī)藥技術研究所,純度99·2%,批號: 030611); B12試劑盒(批號: 11001M300);B12Controls(批號: 10845M100);B12 MasterCalibrators(批號: 04444M100);預激發(fā)液(批號: 05454M100);激發(fā)液(批號: 06725M100);清洗液(08317M102),美國雅培制藥有限公司生產(chǎn)。試驗制劑:國產(chǎn)甲鈷胺膠囊(500μg,福建華海藥業(yè)有限公司,批號: 030301;參比制劑:彌可保[500 μg,衛(wèi)材(蘇州)制藥有限公司,批號: 020173]。

1·3　受試者選擇本試驗經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準,試驗方案經(jīng)北京大學第三醫(yī)院倫理委員會批準。20名健康成年男性志愿者經(jīng)全面體格檢查,心電圖、血壓、血尿常規(guī)及肝腎功能等各項指標均正常;受試者年齡(22·7±1·4)歲,身高(1·72±0·06)m,體重 (63·6±5·9)kg。受試者均無吸煙、飲酒史,受試前兩周內(nèi)未服用過任何藥物,各受試者均自愿參加試驗并于試驗前由本人簽署知情同意書。

1·4　給藥方法與樣本采集本試驗采用2制劑、2周期的隨機交叉給藥方案。入選受試者于每周期試驗前1 d晚入住Ⅰ期病房,禁食過夜后于次日清晨,以200 mL溫水送服單劑量1 500μg的甲鈷胺試驗或參比制劑。分別于服藥前及服藥后0·5, 1, 1·5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 48及72 h各采取前臂靜脈血4 mL,靜置2 h后 4 000 r·min-1離心10 min,分離血清置-40℃冰箱保存待測。在整個試驗過程中樣品注意避光,以避免藥物降解。試驗期間受試者進統(tǒng)一飲食。給藥后2 h進早餐、給藥后4 h進午餐、給藥后10 h進晚餐,給藥后 2 h后可自由飲水。受試者在試驗期間禁煙、酒;禁服含咖啡因、可可堿、茶堿的飲品;禁食含B12的動物性食品,如肉、蛋、牛奶;禁止劇烈運動。

1·5　甲鈷胺血藥濃度測定方法的建立

1·5·1　血清樣品的處理　定量移取血清樣品 300μL至反應杯,加入包被內(nèi)源性因子的磁性微粒子進行結合;用清洗液清洗后,加入吖啶共軛物、預激發(fā)液和激發(fā)液進行免疫反應;將反應液用ARCHI- TECTTMi2000SR進行測定。

1·5·2　甲鈷胺標準曲線的制備　吸取0, 100, 250, 500,1 000, 2 000 ng·L-16個質(zhì)量濃度的標準液置樣品杯中,按血清樣品處理程序操作,于ARCHI- TECTTMi 2000SR分析儀中測定。ARCHITECTTMi 2000SR采用4-參數(shù)對數(shù)轉換法(4PLC)及線性轉換 (LT)技術建立標準曲線,標準曲線經(jīng)B12Controls和 MasterCalibrators校準,通過程序處理判斷標準曲線是否合格,若合格則存儲該標準曲線,并以此對未知樣品進行測定。

1·5·3　方法精密度和準確度　分別配制低、中、高 (200, 400, 800 ng·L-1)3種質(zhì)量濃度的血清質(zhì)控樣品,按標準曲線方法分別于日內(nèi)和日間處理測定, 并計算日內(nèi)和日間相對標準偏差,評價方法精密度。 同法配制低、中、高3種質(zhì)量濃度的血清樣品,按標準曲線方法分別處理測定,計算其回收率,評價方法準確度。

1·5·4　樣品穩(wěn)定性試驗　取口服甲鈷胺制劑后采集的受試者血清樣品于室溫避光放置,按標準曲線方法分別于0, 2, 6, 9 h測定,考察樣品的穩(wěn)定性。 1·5·5　方法質(zhì)量控制　在每批血清樣品測定時建立新的標準曲線,并于每日測定樣品時平行測定低、中、高(200, 400, 800 ng·L-1)3種質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品,質(zhì)控樣品數(shù)大于被測定樣品總數(shù)的5%。

1·6　數(shù)據(jù)處理將受試者口服單劑量1 500μg的甲鈷胺試驗或參比制劑后的血藥濃度列表,計算血清中甲鈷胺濃度增加值(ρ),并繪制平均血藥濃度(ρ)-時間曲線。計算每1個受試者的有關藥動學參數(shù),并求出參數(shù)的平均值及標準差。相對生物利用度F 用各受試者的AUC0-t和AUC0-∞分別計算,并求其平均值和標準差。F0-t= [(AUC0-t)T/ (AUC0-t)R]×100%;F0-∞= [(AUC0-∞)T/ (AUC0-∞)R]×100%。用3P97軟件對受試者血清中甲鈷胺濃度增加值(ρ)-時間數(shù)據(jù)進行處理, 分析甲鈷胺在人體內(nèi)的藥物動力學特征。將AUC和ρmax數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉換,然后進行方差分析及雙單側t檢驗處理,tmax用非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計分析,對甲鈷胺試驗制劑與參比制劑的生物等效性進行評價。

2　結　果

2·1　甲鈷胺血藥濃度測定標準曲線甲鈷胺血藥濃度測定后經(jīng)B12Controls和Master Calibrators校準合格,符合測定要求,ARCHITECTTM i2000SR將試驗制備的標準曲線自動存儲,結果見表 1。本試驗建立的標準曲線線性范圍為100~2 000 ng·L-1。

2·2　方法精密度和準確度甲鈷胺血藥濃度測定方法的精密度和準確度結果見表2。結果表明,本試驗建立的甲鈷胺血藥濃度化學發(fā)光微粒子免疫測定方法準確、可靠。

2·3　穩(wěn)定性試驗及質(zhì)量控制甲鈷胺血清樣品室溫避光放置時,在9h內(nèi)測定結果的RSD為7·16%,結果表明,血清樣品在本試驗測定過程中穩(wěn)定。本試驗在測定過程中,于每日平行測定低、中、高濃度的質(zhì)控樣品,質(zhì)控樣品的測得值均在其真實值的±20%范圍內(nèi)。

2·4　血藥濃度-時間曲線將測得的給藥后血清中甲鈷胺濃度減去給藥前血清本底中的B12濃度,即得口服甲鈷胺制劑后的血藥濃度(ρ)。經(jīng)研究,口服單劑量1 500μg的甲鈷胺試驗或參比制劑后平均血清藥物濃度(ρ)-時間曲線見圖1。

2·5　藥動學隔室模型的擬合本試驗采用簡均數(shù)據(jù)法(na ve average data, NAD)將給藥后每個時間點的各個個體的血藥濃度數(shù)據(jù)進行平均作為主數(shù)據(jù),然后用3P97軟件進行隔室模型擬合,根據(jù)AIC值、r2和擬合優(yōu)度等擬合結果進行判斷。結果表明,甲鈷胺口服給藥后其血藥濃度- 時間數(shù)據(jù)符合權重因子為1/ρ2的口服二室模型。

2·6　有關藥動學參數(shù)根據(jù)血清中增加的甲鈷胺的血藥濃度(ρ)-時間曲線末端直線部分的試驗點,以ln(ρ)對t進行回歸,求得消除速率常數(shù)ke;ρmax、ρmax、tmax為試驗的實測值;用梯形面積法計算樣品的AUC0–t, AUC0–∞,AUC0–∞=AUC0–t+ρt/ke,有關的藥動學參數(shù)見表3。

2·7　生物等效性評價單劑量口服試驗和參比甲鈷胺制劑后的 AUC0-t、AUC0–∞和ρmax經(jīng)對數(shù)轉換后進行方差分析,結果表明本試驗中處方間和周期間均無顯著性差異,個體間有顯著性差異;再采用雙單側t檢驗法對試驗制劑與參比制劑的生物等效性進行評價,結果見表4。采用SPSS軟件對口服甲鈷胺試驗和參比制劑后的tmax進行Mann-Whitney秩和檢驗, 結果表明,兩種制劑的tmax沒有顯著性差異。由統(tǒng)計分析結果可知,試驗和參比甲鈷胺制劑生物等效。

篇10

關鍵詞 ：DNA生物傳感器；切刻內(nèi)切酶；量子點；電致化學發(fā)光；信號放大

1 引 言

近年來，隨著生命科學的不斷發(fā)展，低濃度特定DNA序列的超靈敏檢測在臨床診斷、基因突變檢測等生物學研究中顯示出越來越重要的作用和意義[1～4]。與熒光法[5]、石英晶體微天平法[6]、比色法[7]等眾多的DNA檢測方法相比，電化學發(fā)光法因其方法簡單、響應速度快、靈敏度高和選擇性好而得到了廣泛應用[8～10]。

目標放大和信號放大是提高DNA檢測靈敏度的兩種常用方法。傳統(tǒng)的目標放大方法如聚合酶鏈式反應（PCR）[11]、依賴核酸序列的擴增技術（NASBA）[12]等因高的放大效率、靈敏的檢測效果而被廣泛應用[13]。然而這些方法一般都需要特殊的設備或昂貴的檢測儀器，存在耗時、易污染、成本高、操作不便等缺點[14]。相比之下，通過目標物提高檢測靈敏度的信號放大技術，快速、簡便，已成為超靈敏檢測DNA的研究熱點之一[15～18]。切刻內(nèi)切酶信號放大是近年來逐漸采用的低濃度核酸的檢測方法[19]。探針DNA與目標DNA結合成雙鏈時，形成切刻內(nèi)切酶的識別位點，內(nèi)切酶對探針DNA進行剪切，使得目標DNA被釋放出來，并進行循環(huán)利用，實現(xiàn)檢測信號的放大[20～24]。

電化學發(fā)光法不僅具有化學發(fā)光分析的靈敏度高、線性范圍寬和儀器簡單等優(yōu)點，而且電化學分析控制性強，選擇性好[25]。量子點作為一種新興的納米材料，因其獨特的光學性質(zhì)，如高穩(wěn)定性、不易分解、熒光壽命長等[26]，已被作為生物傳感器的標記物和信號探針[27]。近年來，利用量子點高效及穩(wěn)定的電化學發(fā)光性能研制的電化學發(fā)光生物傳感器備受關注[28～31]。然而，將量子點優(yōu)異的電化學發(fā)光性能與切刻內(nèi)切酶的特異性相結合，進行目標物測定的研究至今未見報道。

本研究基于切刻內(nèi)切酶的信號放大和量子點高效的電化學發(fā)光性能，建立了超靈敏檢測DNA的方法。通過自組裝方式將捕獲DNA（cDNA）固定在電極表面，靶DAN分子（tDNA）與其特異性雜交形成雙鏈，利用切刻內(nèi)切酶對形成的雙鏈中的cDNA進行識別和切割，釋放出tDNA序列，參與下一輪的雜交和酶切。本傳感器制作簡單，靈敏度高，選擇性好，具有良好的應用前景。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

MPIE 型電致化學發(fā)光分析系統(tǒng)（西安瑞邁分析儀器有限公司），采用三電極系統(tǒng)：工作電極為金電極（直徑2 mm），參比電極為Ag/AgCl（飽和KCl）電極，對電極為鉑絲電極。PGSTAT128N Autolab 電化學工作站（瑞士萬通有限公司）；UV2400PC紫外可見分光光度計（日本島津公司）；F7000 熒光儀（日本日立公司）。

氯化鎘（CdCl2?2.5H2O）、碲粉（Te）、硼氫化鈉（NaBH4）、巰基乙酸（TGA）、巰基乙醇（MCH）、N羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1乙基33二甲基氨丙基碳化二亞胺（EDC）購于上海Aladdin公司；切刻內(nèi)切酶Nt.BstNBI（New England Biolabs有限公司）；其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。DNA序列均購自于上海生工生物工程技術服務有限公司，使用時用TE緩沖液（10 mmol/L TrisHCl， 1 mmol/L EDTA， 100 mmol/L NaCl， pH 8.0）進行配制和稀釋，堿基序列如表1所示。

2.2 水溶性量子點的制備

CdTe水溶性量子點合成方式參考文獻[32]的方法并稍做改進。將250 mL 0.0025 mol/L CdCl2溶液倒入三口燒瓶中，磁力攪拌，通氮氣除氧15 min，接著加入100 μL TGA，并用NaOH調(diào)節(jié)至pH≈10，繼續(xù)通氮氣10 min，封口。

量取3 mL二次蒸餾水倒入另一個50 mL 三口燒瓶中，同樣通氮氣除氧。稱取0.36 g NaBH4和0.144 g Te粉加入水中，在65℃水浴和磁力攪拌下反應，直到黑色Te粉完全消失，得到紫色透明的NaHTe溶液。將得到的溶液倒入上述含有CdCl2溶液的三口燒瓶中，95℃水浴中攪拌回流2 h，得顏色透明的CdTe水溶性量子點。

2.3 電化學發(fā)光DNA生物傳感器的制備

將金電極用0.05 μm Al2O3拋光至鏡面，分別置于50% （V/V） HNO3、無水乙醇、水中超聲清洗后，浸入含有1 μmol/L cDNA溶液中過夜，cDNA通過SAu鍵自組裝在電極表面。將修飾電極浸入到巰基乙醇溶液中，避光孵育1 h，封閉其非特異性結合位點，分別用0.1 mol/L PBS緩沖液和0.5 mol/L NaCl溶液清洗，制得電化學發(fā)光DNA生物傳感器。

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