導(dǎo)語：如何才能寫好一篇免疫組化染色，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

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【關(guān)鍵詞】Tween-20；免疫組化；非特異性染色

表面活性劑Tween-20為聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯和一部分聚氧乙烯雙去水山梨醇單月桂酸酯的混合物，親水性強(qiáng)，為一種非離子型去污劑，能增加乳劑的穩(wěn)定性。也可作 2006―2012年龍里縣流行性腮腺炎疫情資料分析 神經(jīng)阻滯聯(lián)合甲鈷胺注射液治療帶狀皰疹后神經(jīng)痛效果觀察 保定市2004～2011年急性弛緩性麻痹病例監(jiān)測系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)情況分析 早產(chǎn)兒經(jīng)下肢置入PICC20例的方法探討 129例2型糖尿病患者合并惡性消化道腫瘤臨床分析 絕經(jīng)后婦女取宮內(nèi)節(jié)育器92例臨床分析 高血壓性腦出血156例臨床分析 蒙古族老年人慢性房顫（AF）319例抗凝治療分析 淺談產(chǎn)后出血的原因及防治措施 80例老年口腔修復(fù)臨床分析 不育不孕癥夫婦生殖道分泌物衣原體和支原體檢測結(jié)果分析 頭靜脈修剪高位重建動靜脈內(nèi)瘺11例 老年獲得性肺炎的臨床特點及預(yù)后分析 2012年昆明市五華區(qū)居民死亡原因分析 探討鈔票對健康促進(jìn)的影響 呼吸內(nèi)科感染常見病原菌與相關(guān)因素 南寧市吳圩鎮(zhèn)健康人丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶參考值的制訂 老年惡性骨腫瘤54例誤診原因分析 帶狀皰疹病人的健康教育方式及效果評價 承┮┪锏腦鋈薌痢＞匝櫸⑾置庖咦榛討屑尤肓ween-20的PBS緩沖液沖洗切片，能夠使切片更清潔，非特異性染色減少。本文對分別經(jīng)過PBS-Tween-20緩沖液及PBS緩沖液沖洗的免疫組化切片進(jìn)行對照，并將應(yīng)用體會介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

PBS磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，PH7.2-7.4）、Tween-20、500ml容量瓶、

吸水紙，均購自福建邁新試劑有限公司。

1.2 方法

取500ml已配制好的PBS磷酸鹽緩沖液置容量瓶中，加入250μl Tween-20，充分混勻，待用?，F(xiàn)將經(jīng)抗原修復(fù)后的組織切片分成3組（A、B、C）放入蒸餾水中備用。

A組：常規(guī)PBS磷酸鹽緩沖液沖洗后，專用免疫組化油筆劃圈。

B組：PBS-Tween-20緩沖液沖洗后，專用免疫組化油筆劃圈。

C組：專用免疫組化油筆劃圈后，PBS-Tween-20緩沖液沖洗。

將3組處理過的切片進(jìn)行同樣的免疫組化后續(xù)操作。

2 結(jié)果

A組 在抗體孵育過程中，抗體用量偏多，無需用吸水紙擦拭，同時還有個別組織邊緣干燥，發(fā)生了邊緣效應(yīng)。

B組 在抗體孵育過程中，抗體用量偏少，但每次滴加抗體前均需用吸水紙擦拭，未發(fā)生組織邊緣干燥。

C 組 在抗體孵育過程中，抗體用量偏少，無需用吸水紙擦拭，未發(fā)生組織邊緣干燥。

3 討論

本實驗室免疫組化染色標(biāo)本例數(shù)多，量大，半個工作日出片，由于一抗、二抗的孵育時間以及顯色時間比較固定，這就要求在操作過程中盡量減少操作時間，并且盡可能地降低非特異性染色。A組雖然免疫組化油筆的使用節(jié)省了時間，但只能防止滴加的試劑不向四周流失，如果組織偏大就無法保證一次性將滴加的試劑完全覆蓋整個組織，只有增加抗體用量將組織全部覆蓋，抗體用量偏多，并且可能導(dǎo)致抗體覆蓋不均，增加邊緣效應(yīng)、非特異性染色等。B組PBS-Tween-20緩沖液沖洗后，玻片上含有Tween-20，用吸水紙擦拭后使用免疫組化油筆劃的圈不能與玻片充分結(jié)合，再次沖洗后劃痕被Tween-20溶解，不能保持完整性，需用吸水紙另外擦拭干水分，耽誤時間。相比之下C組劃圈后和玻片充分結(jié)合，再用PBS-Tween-20緩沖液沖洗，劃痕不被溶解，將其傾斜在吸水紙上，劃痕能保持完整性，不用吸水紙另外擦拭，節(jié)省不少時間。

Tween-20為聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸脂和一部分聚氧乙烯雙去水山梨醇單月桂酸脂的混合物。由于其分子中有較多的親水性基團(tuán)（聚氧乙烯基），故親水性強(qiáng)，具有乳化、擴(kuò)散、增溶、穩(wěn)定等性能，是一種常用的非離子性去垢劑和表面活性劑，對人體無害、無刺激性，常用為醫(yī)藥品的乳化劑、擴(kuò)散劑和穩(wěn)定劑。用其多次沖洗能夠均勻覆蓋整張切片，如同在切片上增加了一層液體膜，不會使組織和切片空白區(qū)形成明顯的分界線，在離組織邊緣

該方法在本實驗室已使用1年余，與不加Tween-20的PBS緩沖液做過多次對照實驗，發(fā)現(xiàn)Tween-20對免疫組化染色結(jié)果無影響，可以放心使用。且PBS-Tween-20緩沖液配制方法簡單，2000ml每包的PBS加入1ml的Tween-20，濃度不太高，價格也便宜，同時各種抗體的價格昂貴，這樣節(jié)省了抗體的用量，節(jié)約醫(yī)療成本，值得推廣。

參考文獻(xiàn)：

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關(guān)鍵詞：免疫組織化學(xué)染色；抗體；組織固定；抗原修復(fù)

免疫組織化學(xué)染色方法是目前生命領(lǐng)域研究最常用的實驗方法之一，也是臨床病理診斷從細(xì)胞形態(tài)水平提高到分子水平的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。免疫組織化學(xué)染色方法主要應(yīng)用免疫學(xué)中抗原抗體結(jié)合的實驗原理檢測特定抗原在細(xì)胞或組織中的表達(dá)和分布。影響免疫組織化學(xué)染色的因素有很多，而抗體孵育條件、設(shè)置合理對照、固定液的洗脫、抗原修復(fù)和洗片等可能是做好免疫組織化學(xué)染色的關(guān)鍵注意點。

1基本原理及特點

免疫組織化學(xué)染色方法是根據(jù)免疫學(xué)中抗原抗體特異性結(jié)合，通過熒光或化學(xué)顯色檢測細(xì)胞或組織中抗原的含量和分布。免疫組織化學(xué)染色法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和定位準(zhǔn)確等特點。目前最常用的幾種免疫組織化學(xué)染色方法主要包括免疫熒光法、免疫酶標(biāo)法和免疫膠體金技術(shù)等。免疫熒光法是將熒光素標(biāo)記的二抗和一抗結(jié)合，可在熒光顯微鏡下直接觀察細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗原的表達(dá)和分布。免疫酶標(biāo)法與免疫熒光法不同之處在于二抗的標(biāo)記方式，它用酶標(biāo)二抗代替熒光素標(biāo)記的二抗，然后通過加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，然后通過光鏡或電鏡，觀察細(xì)胞或組織內(nèi)抗原的含量和分布。免疫酶標(biāo)法包括二步法、ABC法、SP三步法等多種方法，由于其組織形態(tài)較為完整，在抗原定位上對免疫熒光法具有更大的優(yōu)勢。

2幾個關(guān)鍵注意點

2.1抗體孵育條件 抗體孵育是免疫組織化學(xué)染色中最關(guān)鍵的步驟，也是最核心的步驟。一個失敗的免疫組化實驗結(jié)果大部分都與抗體孵育條件不佳有關(guān)?？贵w孵育條件包括抗體稀釋濃度、孵育時間和溫度、抗體稀釋液等因素。即便是同一個抗原，在不同組織中表達(dá)豐度也有很大的差異，因此一定要根據(jù)濃度梯度選擇合適的抗體稀釋濃度。一抗孵育溫度包括4℃、室溫和37℃，4℃反應(yīng)較為溫和，效果最好。一般可選擇4℃過夜，然后37℃復(fù)溫30min～1h。二抗孵育條件一般室溫2h。室溫一般定義為25℃，如果在夏天或冬天選擇室溫孵育，需要注意室溫的溫度。可以用添加5%二抗來源血清的PBS稀釋抗體，如果抗原位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，建議用含5%二抗來源血清的TBST稀釋抗體。由于弱堿性條件有利于抗原抗體結(jié)合，因此一定要注意抗體稀釋液的PH值在7.2～7.4之間。此外，為了防止抗原抗體反應(yīng)時液體的蒸發(fā)，可在擦干組織周圍的液體后，使用免疫組化筆在組織周圍畫圈，使抗體不易流失，抗原抗體的反應(yīng)過程中不干片，保證結(jié)合效率。

2.2設(shè)置合理對照 由于免疫組織化學(xué)染色中影響抗原和抗體結(jié)合的因素很多，因此必須設(shè)置對照組才能做出正確的判斷。常用的對照包括：陽性對照、陰性對照和空白對照等。陽性對照是用已證實含用待測抗原的組織進(jìn)行同樣操作，結(jié)果應(yīng)為陽性。通過陽性對照可排除染色步驟以及所用的試劑的問題。用確知不存在待檢抗原的組織切片染色為陰性對照，可排除在染色過程中由于非特異性染色或交叉反應(yīng)等因素造成的"假陽性"結(jié)果?？瞻讓φ帐亲畛Ｓ玫膶φ?，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結(jié)果應(yīng)為陰性，說明染色方法可靠，可排除組織的的非特異性顯色或熒光。

2.3固定液的洗脫 取材新鮮、固定及時，不僅可保存組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整，而且可保留組織細(xì)胞的抗原性。固定液的選擇將直接影響免疫組化標(biāo)記的結(jié)果及病理診斷的準(zhǔn)確性[1]。然而，因固定液滲到組織中，所以必須徹底沖洗，除去固定液，否則會影響下一步的脫水和染色。由于免疫組織化學(xué)染色需要組織保存較高的抗原活性，因此一般選用PBS對固定的組織進(jìn)行浸洗，30min/次，連續(xù)浸洗3次。

2.4抗原修復(fù)固定和石蠟包埋 可使組織部分抗原決定簇與核酸或其他蛋白發(fā)生交聯(lián)，如果不進(jìn)行抗原修復(fù)可能會得到"假陰性"實驗結(jié)果。常用的修復(fù)方法包括高壓修復(fù)、微波處理法和酶消化法等。通過微波抗原修復(fù)，充分暴露抗原決定簇，有利于抗原抗體結(jié)合，提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般可用微波中火修復(fù)4次，5min/次，抗原修復(fù)液需預(yù)熱至修復(fù)時所需的溫度。在微波修復(fù)過程中，應(yīng)注意抗原修復(fù)液的蒸發(fā)，必須保證組織浸于液面以下，否則易造成假陰性結(jié)果。如果液體蒸發(fā)較多，可在中間及時加入預(yù)熱的抗原修復(fù)液。微波修復(fù)后需自然冷卻至室溫，一般需要30min～1h?？乖迯?fù)液的pH值對染色結(jié)果有很大影響[2，3]。抗原修復(fù)液一般采用酸性的檸檬酸修復(fù)液，酸性pH值的抗原修復(fù)液效果要好于堿性修復(fù)液，并且不易造成脫片。此外，丙酮簡單處理標(biāo)本是一種方法簡單、又能使組織免疫反應(yīng)活性得到明顯加強(qiáng)的方法，有時可替代復(fù)雜的抗原修復(fù)技術(shù)[3]。

2.5洗片 一般來說可用PBST在搖床上浸洗3次，10min/次，具體浸洗時間和次數(shù)可根據(jù)染色背景進(jìn)行調(diào)整。前面已提到，弱堿性條件有利于抗原抗體結(jié)合，因此也要要注意切片漂洗液的pH值應(yīng)在7.2～7.4。對于干片對染色結(jié)果的影響，余光銀等[4]發(fā)現(xiàn)，在沖洗步驟造成的干片，對染色結(jié)果無明顯影響；而滴加抗體和抗原修復(fù)時需防止干片，否則易造成假陰性及背景染色。

影響免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的因素有很多，除了以上幾點需要特別關(guān)注的地方外，還有其他步驟或細(xì)節(jié)都要注意，比如組織低溫固定和脫水、固定液的選擇、石蠟切片的烤片溫度和時間、切片的低溫保存等每個細(xì)節(jié)都會影響免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的好壞。

參考文獻(xiàn)：

[1]周會芹，楊江輝，余琦，等.不同組織固定液對免疫組化結(jié)果的影響[J].診斷病理學(xué)雜志，2009，16（6）：478.

[2] Shi SR， Cote RJ， Taylor CR. Antigen retrieval immunohistochemistry： past， present， and future[J]. J Histochem Cytochem， 1997， 45（3）：327-43.

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概述：當(dāng)前，經(jīng)過權(quán)威資料認(rèn)證的免疫組化實驗方法，已經(jīng)對免疫組化的最基本問題做出了解答，并可以作為免疫組化技術(shù)中一種相對的標(biāo)準(zhǔn)。本文對免疫組化的操作步驟作出了一些具體的描述，提出了一些注意事項，并且對當(dāng)前、今后的免疫組化自動化和標(biāo)準(zhǔn)化作出了評價和展望。

免疫組織化學(xué)在病理診斷中的作用已得到廣泛的認(rèn)同，具有特異性高、敏感性高、程序相對一致等特點，并已成為病理診斷中不可或缺的重要輔助技術(shù)。盡管免疫組化的理論比較簡單，但方法與步驟卻比較繁瑣，在實際應(yīng)用中還存在不少問題，直接或間接地影響了最終的病理診斷。要想達(dá)到可靠的實驗結(jié)果，最重要的是將免疫組化技術(shù)的全部程序形成一種概念上的標(biāo)準(zhǔn)化。本文就免疫組化技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行一些淺顯地探討。

1 標(biāo)本的固定

為了使細(xì)胞和組織保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織自溶和抗原性丟失，固定是關(guān)鍵。標(biāo)本離體后要求在15分鐘內(nèi)用10%中性緩沖甲醛固定，在常溫下時間為8-24小時，避免過度固定，固定時間過長，切片中容易產(chǎn)生甲醛色素顆粒，會影響結(jié)果觀察以及抗原的破壞。固定組織的固定液為標(biāo)本體積的5-10倍，脫鈣液對抗原也有較強(qiáng)的破壞，所以濃度和脫鈣時間不易太長。

2 防脫片的制備

目前通用的是Sigma多聚左旋賴氨酸（Poly-L-ly-sine）或硅化片，具有很理想的防脫片效果。

3 包埋與切片

用過高溫度的石蠟包埋組織會破壞抗原，對于固定不太好的組織影響更大，包埋用的石蠟應(yīng)選用低熔點的石蠟，切片的厚度在3-4微米，以利于觀察，太厚的切片會影響染色結(jié)果和診斷。

4 烤片

切片在50-60℃的恒溫箱里烤片2小時，至少1小時才不至于脫片，烤片時間過短易脫片，時間過長或溫度過高會破壞抗原。

5 脫蠟

免疫組化的脫蠟應(yīng)與常規(guī)HE脫蠟分離，以保證脫蠟徹底，脫蠟不徹底會影響組化染色結(jié)果，切片脫蠟后進(jìn)入梯度乙醇脫水至水化。

6 抗原修復(fù)

6.1 抗原修復(fù)是組化的關(guān)鍵技術(shù)

免疫組化染色中最關(guān)鍵的步驟可以說是抗原修復(fù)了，組化染色結(jié)果的表達(dá)與抗原修復(fù)直接相關(guān)。因組織被甲醛固定后蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，抗原決定簇封閉，只有恢復(fù)抗原的免疫原性才能完成免疫化學(xué)反應(yīng)。抗原修復(fù)方法有多種，主要是酶消化法與加熱修復(fù)兩種方法，現(xiàn)在由于加熱抗原修復(fù)方法的廣泛應(yīng)用，酶消化法在免疫組化中的應(yīng)用已很少。免疫組化的加熱抗原修復(fù)方法包含微波法、水煮法、高壓法，現(xiàn)在比較公認(rèn)的修復(fù)效果是高壓法大于水煮法，水煮法大于微波法。

6.2 抗原修復(fù)液的選擇

抗原修復(fù)液有多種，有檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）、EDTA（PH8.0）、Tris（PH7-8）等，目前檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）可作為首選的常規(guī)使用的抗原修復(fù)液，它適合于大多數(shù)種類抗體，染色背景清晰。一般抗原難以表達(dá)的可以選擇EDTA和Tris緩沖液，這兩種修復(fù)液對一部分抗原修復(fù)效果較強(qiáng)，但染色背景較深。

6.3 抗原修復(fù)實例

在全國，有多家實驗室對ER、PR進(jìn)行了反復(fù)實驗，得出的結(jié)論是強(qiáng)力推薦使用高壓抗原修復(fù)方法。

我們單位在最近的免疫組化測評賽中，對參賽的5個待測抗原進(jìn)行抗原修復(fù)，取得了比較滿意的結(jié)果。根據(jù)我們得出的經(jīng)驗，檢測CD10、CD30這兩項抗原，我們推薦使用高溫水煮修復(fù)，修復(fù)液為tris-EDTA(PH9.0)，檢測ER、PR、CK這三項抗原，推薦使用壓力鍋，修復(fù)液為檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），各單位可根據(jù)實驗室的具體條件和經(jīng)驗選用微波、水煮、高壓修復(fù)以及抗原修復(fù)液。

6.4 高壓抗原修復(fù)方法

組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟至水，浸泡于蒸餾水中待用，取一定量抗原修復(fù)液于壓力鍋中，修復(fù)液必須浸沒整張切片，加熱沸騰，將脫蠟水化后的切片置于耐高溫染色架上，放入已沸騰的修復(fù)液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣（整個時間約需4-5分鐘），開始計時1-2分鐘后，壓力鍋離開熱源，室溫冷卻15分鐘，取下氣閥，打開鍋蓋，切片冷卻至室溫后，蒸餾水洗，PBS洗2min×3次。

7 生物素封閉

一般進(jìn)行抗原修復(fù)處理的切片都需要進(jìn)行內(nèi)源性生物素封閉處理；

7.1 3%H2O2浸泡切片10min

在免疫組化染色中如果采用過氧化物酶檢測系統(tǒng)，必須進(jìn)行封閉處理，這樣可以消除組織中的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞對染色結(jié)果的干擾。雖然3%的H2O2對抗原有輕微的損害，但封閉效果非常顯著。

7.2 血清封閉

一般在加載一抗之前使用封閉血清（室溫15-20分鐘），可以減少非特異性顯色。血清的種屬一般與二抗的種屬相同，一抗中若含正常血清則可以免去此步驟。

實驗中通常用的沖洗緩沖液為PBS和TBS，加入Tween20可以加強(qiáng)沖洗效果，在組化染色中嚴(yán)格的沖洗可防止背景著色。

8 一抗孵育

加載一抗50-100ul，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時，如4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘，PBS洗3次各2分鐘。

9． 加一滴（50ul-100ul）檢測試劑（二抗），室溫或37℃放置30分鐘， PBS洗三次，每次2分鐘。

10. DAB顯色5-10分鐘

11. 蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。

襯染的步驟十分簡單，但襯染的好壞對染色質(zhì)量的影響很大，不易太深或太淺。首選的是Harris蘇木素襯染，它在水中洗滌后可以呈鮮亮的蘭色，與DAB染色對照效果很好，使用簡單方便。

對于即用型抗體，廠商已進(jìn)行多種實驗條件的檢測，可以直接使用，而濃縮性抗體，可按照供應(yīng)廠商提供的稀釋度進(jìn)行預(yù)實驗，一般在廠家提供的滴度前后各加一個滴度做預(yù)實驗，抗體的最佳稀釋度為在無背景染色的情況下獲得最強(qiáng)陽性信號。

通用的檢測系統(tǒng)是生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶為基礎(chǔ)的檢測方法，有SP、LSAB、ABC等方法，都是目前實驗室廣泛采用的檢測方法，其方法簡便易行且試劑穩(wěn)定。SP三步法和Envision二步法高效經(jīng)濟(jì)，為國內(nèi)免疫組化首選的檢測系統(tǒng)。

顯色系統(tǒng)通常采用的是辣根過氧化物酶系統(tǒng)，因此選擇DAB（棕色）和AEC（紅色）酶底物，常規(guī)組化顯色首選的是DAB，它定位清晰，易于保存。

在免疫組化的質(zhì)量控制中，最重要的是設(shè)立陽性和陰性對照，每批實驗中最好有一張陽性對照和陰性對照，這樣才能確保實驗的可靠性，雖然很多醫(yī)院病理科的工作量很大，但是不要怕麻煩，可以每月進(jìn)行一次室間質(zhì)控，以保證免疫組化染色結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

自動染色儀，它是一種各種試劑高度通用的儀器，可使用大多數(shù)免疫組化染色的抗體、檢測系統(tǒng)和其他試劑，是當(dāng)今最流行的開放式的自動染色儀。它利用電腦控制代替技術(shù)人員手工操作，大大地減少了手工操作出現(xiàn)的誤差。自動染色儀能精確泵出每次滴加試劑的量，以及將每一步的染色時間精確到秒，空氣壓縮泵能均勻地吹掉切片上多余的液體，這一切徹底避免了免疫組化染色過程中人工操作的誤差，染色儀將所有的染色步驟存儲在電腦里，這些優(yōu)點保證了染色結(jié)果的一致性，不同單位的實驗室選擇相同的試劑及染色過程就可以達(dá)到相同的染色結(jié)果。

近年來，隨著免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化的逐步實行，免疫組化自動染色儀將逐步進(jìn)入病理科，技術(shù)人員將從煩瑣的人工操作中解脫出來，會極大提高免疫組化的工作效率，同時也將免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化推上了一個新的臺階。

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【關(guān)鍵詞】 抗原修復(fù)液；固定時間；免疫組化

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.089 文章編號：1004-7484（2012）-08-2487-02

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)和相關(guān)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，免疫組織化學(xué)技術(shù)作為一門新興的學(xué)科出現(xiàn)了。它是一門基于免疫和分子生物學(xué)與病理形態(tài)學(xué)等學(xué)科綜合的技術(shù)，主要是通過已知抗體或抗原進(jìn)行對實驗中的組織細(xì)胞中探測的抗原或抗體檢測。典型特征包括操作易于實現(xiàn)，準(zhǔn)確性高和特異性強(qiáng)，并且能夠?qū)⑿螒B(tài)和機(jī)能相互整合。該種技術(shù)已在實際中能夠進(jìn)行病理和鑒別診斷，組織胚胎和神經(jīng)解剖等相關(guān)領(lǐng)域的實驗研究[1]。通常情況下，只有在正確及時的固定離體組織前提下，免疫組化技術(shù)才能得出精確度高的實驗結(jié)果。但是，由于實際操作中存在大量的影響因素造成不能正確及時的固定離體組織，特別是在進(jìn)行尸檢標(biāo)本時，對實驗的要求更高。本文的研究重點就是考察這些組織是否能夠做免疫組化實驗，對于不同抗原修復(fù)液和固定時間對免疫組化結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 采集本院在2008年1月至2009年12月手術(shù)中送檢，并且確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的26例標(biāo)本。在實驗中，每一標(biāo)本中選取4塊腫塊部位，其中的四個時間點分別是：t1，t2，t3和t4。t1，t2，t3和t4分別代表立即固定組，延遲12小時固定組，延遲24小時固定組，延遲48小時固定組。將其中的1塊標(biāo)本馬上置于10%的中爾馬林液中進(jìn)行固定，并將實驗中的其余3塊分別于延遲12、24、48小時后放入10%中爾馬林液進(jìn)行固定。然后對于以上標(biāo)本固定滿24小時后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋相關(guān)操作，再進(jìn)行切片行HE染色驗證腫瘤組織。并且將染色結(jié)果為陰性者立即固定組免疫組化，同時不再做與其相應(yīng)延遲固定組的標(biāo)本標(biāo)記染色。

1.2 試劑與方法 采用的試劑包括：鼠抗人CK7單抗，抗人C-erbB-2，單抗兔抗人ER單抗和鼠及ElivisionTM plus（即用型檢測試劑盒和DAB試劑盒均購于福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。采用兩步法進(jìn)行免疫組化，即分別用檸檬酸高壓熱修復(fù)和胃酶修復(fù)，并且嚴(yán)格按照ElivisionTM plus試劑盒要求的操作步驟進(jìn)行操作。其中，脫水透明，中性樹膠封片，DAB顯色和蘇木素輕度復(fù)染，并且用PBS進(jìn)行替換一抗作為陰性對照。其中，不同抗原修復(fù)液分組：pH為9.0的高溫高壓EDTA緩沖液修復(fù)（A），pH為8.0高溫高壓EDTA緩沖液修復(fù)（B），pH為6.0高溫高壓檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)（C），pH為9.0微波爐EDTA緩沖液修復(fù)（D），pH為8.0微波爐EDTA緩沖液修復(fù)（E），pH為6.0微波爐檸檬酸鹽修復(fù)法（F）。

1.3 結(jié)果判定 進(jìn)行陽性定位在細(xì)胞漿和陽性定位在細(xì)胞核的免疫組化切片，將其中具有特征代表的10個在400倍視野中觀察，對其中的陽性細(xì)胞占整體細(xì)胞的比例進(jìn)行計數(shù)如下：計陽性細(xì)胞數(shù)占整體細(xì)胞比例在25%以下記做（±），占整體細(xì)胞比例在25%-50%記做（+），占整體細(xì)胞比例在50%-75%記為（++），占整體細(xì)胞比例在75%以上記為（+++），并且相應(yīng)的評價分為1，2，3，4分；同樣的，以（±），（+），（++）表示染色強(qiáng)度，并且相應(yīng)的評價分為1，2，3分。最后，將兩種記分乘積作為染色效果指數(shù)。另外，對陽性定位于細(xì)胞膜的免疫組化進(jìn)行切片，其中的染色效果參照文獻(xiàn)[2]標(biāo)準(zhǔn)判定，同樣的以符號±，+，++，+++，++++進(jìn)行評價，并且相應(yīng)的評價分為1，2，3，4，5分，將兩種分?jǐn)?shù)的乘積作為染色效果指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 基于統(tǒng)計軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)字統(tǒng)計處理。在進(jìn)行統(tǒng)計中，進(jìn)行隨機(jī)區(qū)間設(shè)計的秩和檢驗，并將檢驗結(jié)果在P

2 結(jié) 果

2.1 通過在A-F抗原修復(fù)液以及固定時間不同乳癌組織中，CK7的表現(xiàn)結(jié)果如下：在乳癌組織中，CK7的陽性顯示為黃褐色的顆粒，其定位于細(xì)胞漿中，在總共26例標(biāo)本中立即固定組均陽性。并且，在立即固定組、12小時后固定組、24小時后固定組和48小時后固定組間的染色效果指數(shù)差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P

2.2 通過在A-F抗原修復(fù)液以及固定時間不同乳癌組織中，ER的表現(xiàn)結(jié)果如下：在乳癌組織，ER的陽性顯示為黃褐色顆粒，其定位于細(xì)胞核中，在所有的標(biāo)本中有22例立即固定組標(biāo)本呈現(xiàn)出了陽性。在立即固定組、12小時后固定組、24小時后固定組和48小時后固定組間的染色效果指數(shù)之間的差異P

2.3 通過在A-F抗原修復(fù)液以及固定時間不同乳癌組織中，C-erbB-2的表現(xiàn)結(jié)果如下：在乳癌組織，C-erbB-2陽性顯示為黃褐色顆粒，并且陽性定位在細(xì)胞膜中，在所有的標(biāo)本中有18例立即固定組標(biāo)本呈現(xiàn)陽性。在立即固定組、12小時后固定組、24小時后固定組和48小時后固定組間的染色效果指數(shù)之間的差異P

3 討 論

由組織病理學(xué)基本理論可知，無論在組織切片活著進(jìn)行電鏡大體標(biāo)本的保存，應(yīng)該及時適當(dāng)進(jìn)行有效的固定。通過這種操作，才能達(dá)到使組織和細(xì)胞內(nèi)蛋白凝固并能夠在特定位置保留，進(jìn)而可以防止破壞及自溶內(nèi)外源性酶，從而最大程度的對組織和細(xì)胞的固有形態(tài)、結(jié)構(gòu)實施了保護(hù)。當(dāng)出現(xiàn)組織內(nèi)沒未能進(jìn)行有效的固定時，內(nèi)外源性酶將能夠造成組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，甚至使某些特定部位的蛋白向周圍擴(kuò)散并出現(xiàn)降解。在本實驗中，通過采用不同抗原修復(fù)液，并采用在延遲時間不等的固定組織，進(jìn)行特定部位的蛋白免疫組化檢測，在結(jié)果中可以看到特定陽性部位周圍有不同的化程度的陽性背景。并且，在進(jìn)行CK7免疫標(biāo)記時，癌巢周圍陽性背景隨著抗原修復(fù)液A到F，固定時間的增長而逐漸加深；在進(jìn)行ER免疫標(biāo)記過程中，在核陽性減弱的同時出現(xiàn)胞漿的陽性背景；在進(jìn)行C-erbB-2免疫標(biāo)記過程中，胞膜陽性同時胞膜兩側(cè)均出現(xiàn)陽性背景。并且，從統(tǒng)計學(xué)角度，在CK7、ER和C-erbB-2在4組固定時間不等的乳癌組織間的表達(dá)效果具有統(tǒng)計意義。

免疫組織化學(xué)技術(shù)基本原理：基于抗原抗體反應(yīng)或者組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，通過借助顯色劑來標(biāo)記特異性抗體在組織細(xì)胞原位，從而能夠?qū)ο鄳?yīng)抗原進(jìn)行定性、定位和定量診斷。其中，組織固定不理想對于免疫組化染色結(jié)果有非常大的關(guān)系，其固定的結(jié)果程度和抗原保存有直接關(guān)系，因此應(yīng)該進(jìn)行盡快組織固定。在進(jìn)行大標(biāo)本和有包膜的標(biāo)本實驗時，由文獻(xiàn)[3，4]應(yīng)該進(jìn)行切開固定。在其中的組織細(xì)胞不能及時有效固定，就會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白破壞降解，甚至導(dǎo)致免疫組化檢測失敗[5，6]。免疫組化染色中，組織結(jié)構(gòu)的保存和抗原性等的改變程度有多方面的影響因素，主要包括：溫度、抗原、固定液的pH值、固定劑種類、灌注速度和進(jìn)行固定后處理方法等方面。

在本實驗中，所選用得CK7、ER和C-erbB-2抗體，進(jìn)行了在不同抗原修復(fù)液，在立即固定、延遲12小時固定、延遲24小時固定和延遲48小時固定的4組乳癌組織中，并且最終標(biāo)記了細(xì)胞漿、細(xì)胞核和細(xì)胞膜等部位的相應(yīng)蛋白。通過實驗看出，在抗原修復(fù)液E和F及在延遲48小時中的不到明確的膜陽性。因此，延遲固定對膜蛋白免疫組化效果的影響更明顯。延遲固定大幅弱化了免疫組化效果，其中的原因可能是延遲固定和內(nèi)外源性蛋白酶對部分蛋白的降解，以及部分蛋白向周圍擴(kuò)散造成?？乖迯?fù)液E和F延遲固定太長，不太適宜進(jìn)行檢測，而抗原修復(fù)液A、B、C和D可以進(jìn)行延遲固定組織免疫組化檢測?？梢缘贸?，盡管在實驗中免疫組化效果變差，但是可以分辨出特定部位的陽性結(jié)果。因此，對延遲固定組織只要充分固定和選用抗原修復(fù)液抗原修復(fù)液A、修復(fù)液B、修復(fù)液C和修復(fù)液D可以做免疫組化檢測的，同時應(yīng)注意減少實驗延遲固定時間。

綜上所述，對于那些客觀因素造導(dǎo)致延遲固定標(biāo)本，在其延遲時間未達(dá)到48小時之前，并且沒有進(jìn)行免疫組化輔助診斷，可以選用抗原修復(fù)液A、B、C和D進(jìn)行免疫組化檢測。應(yīng)當(dāng)注意的，判定檢測結(jié)果應(yīng)充分考慮到延遲固定帶來的影響。因此，只要通過有效的措施排除了延遲固定產(chǎn)生的不良影響，免疫組化在一定意義上能夠起到輔助診斷的作用。

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篇5

[關(guān)鍵詞] 纖支鏡毛刷；細(xì)胞塊；常規(guī)HE染色；免疫組化；10%中爾馬林

[中圖分類號] R446.6；R361.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）36-075-03

The application methods and value of fiber lens brush cell block technique

ZHANG Guizhen ZHU Zhenda CHEN Cheng

Department of Pathology， Yuhang District Traditional Chinese Medicine Hospital of Hangzhou City in Zhejiang Province， Hangzhou 311106， China

[Abstract] Objective To study the application methods and value of fiber lens brush cell block technique. Methods For 32 cases of fiber lens brush after conventional smear in the remaining cells again fixed with 10% formaldehyde wax block made from cells （cell block， CB）， the first routine HE staining， again to choose according to the need to enzyme immunohistochemical marking line. Results CB routine HE staining cells clear， histologic structure to a certain extent， was conducive to clear diagnosis； Immunohistochemical positive for accurate positioning， color clear， has good effect for tumor classification. Two dyeing methods were better than regular smear dyeing effect， so the significant difference of statistically was significant （P < 0.01）， and the lung biopsy and postoperative biopsy difference was not significant （P > 0.05）. Conclusion The production method of the fiber lens brush CB fixed with 10% of formaldehyde is simple， economic and The dyeing effect is good， in the diagnosis of pulmonary diseases， especially lung cancer has a high practical value and broad application prospect， the production method is worth promoting.

[Key words] Fiber lens brush； Cell block； Routine HE staining； Immunohistochemical； 10% formaldehyde

纖支鏡毛刷細(xì)胞學(xué)檢查是診斷肺疾病、特別是肺腫瘤的重要手段之一，已被廣泛用于臨床，當(dāng)纖支鏡活檢和經(jīng)皮肺穿刺活檢由于多種因素被迫放棄，此時的纖支鏡毛刷細(xì)胞學(xué)檢查是術(shù)前最佳的病理檢查方法，顯得尤為重要，并對已不適合手術(shù)治療的老弱患者和晚期癌癥患者來說也是較佳的病理檢查方法。筆者對32例纖支鏡毛刷常規(guī)涂片后再將剩余細(xì)胞制成細(xì)胞蠟塊（cell block，CB），先行常規(guī)HE染色鏡下觀察，再根據(jù)需要選擇酶標(biāo)行免疫組化（如CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等），兩者結(jié)合觀察，對肺疾病進(jìn)行病理診斷，特別是對肺腫瘤進(jìn)行組織學(xué)上的分型，效果較好，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

50 mL尖底塑料試管1支，直立平衡離心機(jī)1臺，盛10 mL 10%中爾馬林的小瓶1只，老虎鉗1把，震蕩器1臺。

1.2 方法

1.2.1 毛刷處理 毛刷刷取細(xì)胞后快速涂片2張，95%乙醇迅速固定，常規(guī)HE染色。涂片后馬上用老虎鉗剪斷毛刷放入盛有10 mL的10%中爾馬林的瓶內(nèi)固定。

1.2.2 制片方法 毛刷在10%中爾馬林液固定1 h后用干凈的鑷子取出，用針尖挑（或刮）出刷內(nèi)物，盡量挑干凈，再把毛刷在固定液內(nèi)漂洗，而后把固定液倒入試管內(nèi)。再重新倒入10 mL左右的10%中爾馬林在瓶內(nèi)，在震蕩器上震下刷內(nèi)殘余的細(xì)胞，再把這10 mL的中爾馬林倒入同試管內(nèi)，再加一定的量，使試管內(nèi)的福爾馬林總量達(dá)30～40 mL，離心3000 r/min、15 min，取出放在試管架上固定2～4 h左右，如標(biāo)本上午送來的則當(dāng)天即可與常規(guī)組織同脫水，如下午兩三點后送來則固定過夜。固定好后倒去固定液，此時沉淀物已結(jié)塊，小心取出，放在濾紙上滴入伊紅包好，與常規(guī)組織同時進(jìn)行脫水、包埋予0.4 mm厚連續(xù)切片8張左右，其中1張常規(guī)HE染色鏡下觀察，再根據(jù)需要選擇酶標(biāo)行免疫組化。

1.2.3 染色合格標(biāo)準(zhǔn) 將常規(guī)HE合格標(biāo)準(zhǔn)定為：細(xì)胞清晰，核漿對比分明，組織學(xué)結(jié)構(gòu)可有（或無），有利于明確診斷。將免疫組化合格標(biāo)準(zhǔn)定為：陽性定位準(zhǔn)確，著色清晰，有助于腫瘤的分型。

1.2.4 免疫組化方法 CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、 34βE12、TTF-1等單克隆抗體購于北京中杉公司，實驗流程采用EnVision二步法。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理。用Kolmegorov-Smirnov方法進(jìn)行正態(tài)性檢驗，使用χ2檢驗對正態(tài)分布的構(gòu)成比進(jìn)行比較，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

40例肺纖支鏡毛刷，先直接常規(guī)涂片，再將剩余細(xì)胞用10%中爾馬林固定制成細(xì)胞蠟塊（CB），除8例由于細(xì)胞數(shù)量過少或血過多等原因使CB制作失敗外，成功的32例常規(guī)HE染色效果較好，細(xì)胞較清晰，有一定的組織結(jié)構(gòu)；免疫組化則陽性定位準(zhǔn)確、著色較清晰，與常規(guī)涂片相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）、與肺活檢（或術(shù)后組織切片）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

表1 三種不同方法檢測結(jié)果比較[n（%）]

圖1、2 CB中的片狀異型鱗狀上皮組織，HE，×10與×40

圖3 CB中的正常腺管狀結(jié)構(gòu)，HE，×40

圖4 CB中的支氣管黏膜，×10

圖5 活檢中的支氣管黏膜，×10

圖6 術(shù)后常規(guī)切片對照，HE，×40

圖7 直接常規(guī)涂片對照，HE，×40

圖8 34βE12在CB中的（與圖1同片）陽性表達(dá)，Envision法，×10

圖9 34βE12在直接常規(guī)涂片中的陽性表達(dá)，Envision法，×10

圖10 34βE12在術(shù)后常規(guī)切片中的陽性表達(dá)，Envision法，×10

圖11 CB中的片狀鱗狀上皮（右下）與壞死組織（左上）分界清，×10

圖12 術(shù)后切片中的鱗狀上皮（上）與壞死組織（下）分界清，×10

3 討論

3.1 纖支鏡毛刷細(xì)胞塊的HE染色效果

本方法制作的CB在HE染色上與文獻(xiàn)報道[1]的相似：細(xì)胞境界、核膜、核染質(zhì)、核仁清楚；也有一定的巢狀、片狀、管狀結(jié)構(gòu)組織學(xué)結(jié)構(gòu)和排列方式[2]（圖1、2、3、4），等同活檢（圖5）和術(shù)后切片（圖6）的圖像，兩者染色效果對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。而直接常規(guī)涂片最大的缺陷是細(xì)胞量少，很難看到組織學(xué)結(jié)構(gòu)[3]，我們觀察的病例大多似此，且常伴有細(xì)胞退變（圖7），常與壞死物、血細(xì)胞混合，干擾細(xì)胞的分辨，給診斷帶來一定的困難，兩者染色效果對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。

3.2 纖支鏡毛刷細(xì)胞塊的免疫組化效果

本方法制作的CB在免疫組化上陽性定位準(zhǔn)確，著色清晰，背景也清晰無干擾（圖8），與活檢和術(shù)后切片（圖10）相似，兩者染色效果對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。而常規(guī)涂片免疫組化出現(xiàn)高背景染色，細(xì)胞集群呈三維結(jié)構(gòu)，尤其是膜著色的更難判斷[4]，著色有模糊朦朧（圖9）的感覺，給判斷帶來一定的困難，兩者染色效果對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。

3.3 纖支鏡毛刷細(xì)胞塊的制作體會

纖支鏡毛刷常規(guī)涂片后再把毛刷內(nèi)殘留的物質(zhì)挑（或刮）出再離心制成細(xì)胞塊，優(yōu)良的纖支鏡毛刷技術(shù)和小心、耐心挑（或刮）出刷內(nèi)殘留物使有足夠量的腫瘤細(xì)胞是成功制成CB的主要環(huán)節(jié)。毛刷內(nèi)物固定1 h左右后有一定硬度，易于挑（或刮）出，刷內(nèi)物直接挑（或刮）出，對成小片狀、小粒狀刷下組織的破壞較小，很好地保存了原有的組織學(xué)結(jié)構(gòu)（圖4），再利用離心機(jī)的離心力把漂下、震下的分散細(xì)胞經(jīng)過高度濃縮壓緊，也一定程度地顯示了組織學(xué)模式，并能顯示涂片中不能顯示的特征性組織結(jié)構(gòu)，如鱗癌的角化珠、狀結(jié)構(gòu)、腫瘤的組織間質(zhì)等[5]，又如我們觀察到的片狀上皮成分與壞死組織分界清（圖11）及較完整的黏膜結(jié)構(gòu)（圖4）的圖像，與活檢（圖5）和術(shù)后切片（圖6、圖12）極其相似，且又不浪費(fèi)所刷取的任何材料。而直接常規(guī)涂片最大的缺陷是材料浪費(fèi)，細(xì)胞量少，又很難看到組織學(xué)結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)雖有較先進(jìn)的液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)，但經(jīng)過振蕩，標(biāo)本中組織學(xué)結(jié)構(gòu)大部分被離散，涂片中也很難看到組織學(xué)結(jié)構(gòu)，又經(jīng)過膜式過濾后，細(xì)胞量也相應(yīng)減少，對刷取的材料仍有浪費(fèi)。

我們不用95%乙醇固定，用10%中爾馬林固定，是因為高濃度的乙醇可使組織細(xì)胞收縮和變脆，難以切片外，還可溶解紅細(xì)胞中的血紅蛋白[6]，在免疫組化染色時會干擾背景加重背景著色。有文獻(xiàn)報道脫落細(xì)胞有完整的細(xì)胞膜，雖經(jīng)乙醇固定，其包膜上的類脂質(zhì)不能充分溶解，影響試劑的滲透造成真正的陽性細(xì)胞著色不良，影響結(jié)果判斷[7，8]。10%中爾馬林對組織滲透作用強(qiáng)，固定均勻、穩(wěn)定，使組織具有一定的彈性，不僅易于切片外，還能很好地保存組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、保存大部分組織細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)如糖類、無機(jī)鹽、色素、蛋白抗原等，使抗原定位更加清晰，尤其是對細(xì)胞核的抗原固定最佳[9]，利于進(jìn)行免疫組化染色和分子生物學(xué)檢驗。我們制作和觀察的病例大多有類似的結(jié)果，免疫組化效果較佳（圖10）。但福爾馬林滲透速度較乙醇慢，所以固定時間較長，一般要2～4 h[10]，如果急需加快，也可采用付海洋等[9]介紹的方法：在前固定的基礎(chǔ)上再利用超聲波進(jìn)行后固定，加速福爾馬林對細(xì)胞的滲透和固定。另有文獻(xiàn)報道常規(guī)涂片免疫組化細(xì)胞成分復(fù)雜，除有較強(qiáng)的非特異性背景著色外，三維細(xì)胞團(tuán)免疫試劑容易進(jìn)入產(chǎn)生假陽性[11]；CB免疫組化染色則背景干凈，幾乎沒有假陽性[12]。

3.4 纖支鏡毛刷細(xì)胞塊的應(yīng)用前景

細(xì)胞塊作為細(xì)胞學(xué)診斷中重要的輔助手段最初應(yīng)用于胸腹水、心包積液等液體標(biāo)本，在國外該技術(shù)已經(jīng)成為脫落細(xì)胞學(xué)的常規(guī)操作技術(shù)，并已應(yīng)用很久，目前國外普遍采用自動化制作細(xì)胞蠟塊，但該方法設(shè)備成本較高且技術(shù)較為復(fù)雜[13]。傳統(tǒng)的細(xì)胞塊制作方法有瓊脂或生物膠水包埋法、固定沉降法、血漿凝血酶凝集法、雞蛋清凝集法和醫(yī)用脫脂棉吸附法，不僅操作復(fù)雜，且通透性較差，影響脫水、透明和浸蠟，造成制片困難和染色效果差[14，15]。我們制作的方法較為簡便，只需1臺離心機(jī)用10%中爾馬林固定，2～3 d即可完成常規(guī)HE染色和免疫組化染色，并因未用任何媒介物，干擾圖像較少，染色效果較佳，更易于鏡下觀察。CB還有優(yōu)點是可以連續(xù)切片，用于多種酶標(biāo)檢測，如CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等診斷肺腫瘤的酶標(biāo)均可用上，以滿足診斷需要。并可長期保存，其成本對實驗而言也是最經(jīng)濟(jì)的。已有文獻(xiàn)報道CB用于原位雜交檢測定位準(zhǔn)[16]，因條件限制，我們尚未開展，但是我們以后努力的方向。所以用10%中爾馬林固定的纖支鏡毛刷CB方法簡便、經(jīng)濟(jì)、效果好，在診斷肺疾病、特別是肺腫瘤中有廣闊的應(yīng)用前景，值得推廣。

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篇6

【關(guān)鍵詞】 妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥 腫瘤壞死因子-α 免疫組織化學(xué)

Abstract: Objective To study the significance of TNF-α expression in the placenta in patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy （ICP）. Methods The expression of TNF-α in placenta was investigated in 37 patients with ICP and 33 normal pregnant women by immunohistochemical method. Results The level of TNF-α expressed in ICP patients was higher than that in normal pregnant women （P

Key words: intrahepatic cholestasis of pregnancy； tumor necrosis factor-alpha; immunohistochemistry

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy， ICP） 是好發(fā)于妊娠中、晚期的妊娠并發(fā)癥，表現(xiàn)為孕婦肝內(nèi)膽汁淤積、血膽汁酸增高、皮膚瘙癢和（或）黃疸， 在分娩后迅速消失，通常被認(rèn)為是產(chǎn)科高危因素。細(xì)胞因子在ICP的研究中越來越受到人們的重視。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF） 系統(tǒng)，特別是TNF-α是近年來被認(rèn)識的一種重要的細(xì)胞因子，參與多種生理與免疫過程。為進(jìn)一步了解TNF-α在ICP中的作用，本實驗采用免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色技術(shù)進(jìn)行了胎盤組織中TNF-α表達(dá)的研究， 現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料和方法

1.1 病例及分組 ICP組共37例，納入標(biāo)準(zhǔn)參照參考文獻(xiàn)［1］:①妊娠中、晚期出現(xiàn)局部或全身皮膚瘙癢，排除皮膚病;②血清甘膽酸水平升高，轉(zhuǎn)氨酶輕、中度升高;③妊娠是引起皮膚疾病及生化異常的惟一原因;④排除乙肝、丙肝等造成的轉(zhuǎn)氨酶升高;⑤癥狀、體征及生化異常在產(chǎn)后迅速消失或恢復(fù)正常。對照組為33例正常孕婦。2組孕婦均在我院就診，其年齡、分娩孕周無顯著性差異，排除了感染、血液病、腫瘤及肝腎疾病等。

1.2 方法

1.2.1 胎盤標(biāo)本的采集 胎盤娩出后立即在直視下剪取胎盤中央母體面、血管少的一小塊組織（約30 mm×30 mm），生理鹽水沖洗干凈后，切成約15 mm×15 mm 組織塊，常規(guī)固定。

1.2.2 制片 將固定的標(biāo)本石蠟包埋，制成5 μm厚的切片，TNF-α免疫組化試劑盒由上海天呈生物技術(shù)有限公司提供，嚴(yán)格按說明書操作進(jìn)行免疫組化染色。TNF-α在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，染色后呈現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.2.3 TNF-α的陽性判斷及分級標(biāo)準(zhǔn) 陰性對照用PBS代替一抗進(jìn)行對照。TNF-α表達(dá)陰性和陽性根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占面積，即兩者積分之和來判斷。染色強(qiáng)度分為:不染色= 0，輕度染色=1，中度染色=2，強(qiáng)染色=3。染色面積分為:無細(xì)胞染色=0，50%細(xì)胞染色=3。若積分之和=0，則表達(dá)為（-）；積分之和=1、2 則為（+）；積分之和=3、4，則為（++）；積分之和=5、6，則為（+++）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗，臨床資料進(jìn)行配對t檢驗，TNF-α免疫組化數(shù)據(jù)進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗，P

2 結(jié) 果

正常妊娠組及ICP組胎盤組織TNF-α的免疫組化檢測結(jié)果見表1和圖1、2。表1 2組胎盤組織TNF-α的免疫組化檢測結(jié)果

3 討 論

ICP是妊娠期特有并發(fā)癥， 因其可導(dǎo)致早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)窘迫增加圍生兒死亡率，而備受關(guān)注［2］。ICP的發(fā)生、發(fā)展及臨床過程較為復(fù)雜，至今其母嬰死亡率仍較高。國外許多學(xué)者從不同方面對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討，目前仍無明確的結(jié)果［3］。妊娠時胎盤作為內(nèi)分泌器官產(chǎn)生大量重要的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子進(jìn)入母體及胎兒血液循環(huán)，對代謝、免疫、血管等系統(tǒng)發(fā)揮多種作用。在整個妊娠期，這些細(xì)胞因子進(jìn)行著復(fù)雜的平衡調(diào)節(jié)，維持了正常妊娠的過程。近年來研究表明，細(xì)胞因子作為參與免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)，在ICP的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的作用［4-5］。TNF-α主要是由單核-巨噬細(xì)胞分泌，其他類型的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等在一定條件下也具有產(chǎn)生和釋放TNF-α的能力，其主要通過受體發(fā)揮作用，參與多種生理與免疫過程。妊娠期TNF-α主要由胎盤和脂肪組織合成和分泌［6］。

本實驗結(jié)果提示，TNF-α在ICP胎盤中的表達(dá)較正常胎盤組織明顯增強(qiáng)，TNF-α在ICP胎盤中表達(dá)上調(diào)。是何種原因?qū)е耇NF-α在ICP胎盤中表達(dá)升高尚不清楚。推測，TNF-α可能引起胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加，使螺旋動脈受損，導(dǎo)致胎盤缺血缺氧，進(jìn)而引起胎盤代謝障礙；ICP患者胎盤合成和分泌TNF-α功能失調(diào)， 可能是ICP的發(fā)病原因之一。

【參考文獻(xiàn)】

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篇7

【關(guān)鍵詞】抗原修復(fù)；免疫組化

【中圖分類號】R392 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2012）12-0294-01

在病理診斷和科研中，免疫組織化學(xué)越來越為人們認(rèn)識和接受，應(yīng)用也越來越廣泛。它能提供抗原特異性表達(dá)和準(zhǔn)確定位，有助于一些疑難病理診斷問題的解決。但目前所進(jìn)行的常規(guī)石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使抗原性物質(zhì)或由于形成醛、羧甲鍵等原因而被封閉了部分抗原決定簇，或由于蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽，從而影響免疫組織化學(xué)結(jié)果，為解決這些問題需要做抗原修復(fù)[1]。目前，基層醫(yī)院病理科常用的抗原修復(fù)方法有兩種：高壓鍋修復(fù)和微波爐修復(fù)。我們選擇了15種常用抗體用高壓鍋、微波爐兩種修復(fù)方法進(jìn)行免疫組化試驗，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1儀器設(shè)備

OLYMPUS CX―41顯微鏡、市售家用微波爐、高壓鍋、電磁爐。

1.2 試劑：15種抗體、即用型二步法（非生物素）檢測試劑盒、DAB顯色劑、PBS磷酸鹽緩沖液（0.01M PH7.2―7.4）、檸檬酸鹽緩沖液（0.01M PH6.0）均購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 組織材料：病理組織來自我院病理科，經(jīng)10%中爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚約4μm 。

1.4 高壓鍋法：15張切片脫蠟、水洗后置于0.01mmol檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，加熱至噴汽，開始計時，2.5分鐘后，離開熱源，自然冷卻。PBS沖洗2次，每次約3分鐘。后按試劑盒操作步驟進(jìn)行。

1.5 微波爐法：15張切片脫蠟、水洗后置于盛有0.01mmol檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的耐熱容器中加熱至沸騰（98 -100℃），持續(xù)10分鐘。自然冷卻， PBS沖洗2次，每次約3分鐘。后按試劑盒操作步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果

光鏡下，細(xì)胞質(zhì)（細(xì)胞核）內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，陽性細(xì)胞數(shù)占1%-10%為（+），11%-50%為（ ++），51% -80%為（ +++） [2]。從表中可以看出：15種抗體中，有10種抗體顯色結(jié)果相同，2種微波修復(fù)比高壓修復(fù)染色效果提高了一個（+），3種高壓修復(fù)比微波修復(fù)染色效果提高了一個（+）。

3 討論

用微波進(jìn)行抗原修復(fù)，時間短時染色較淺，時間長時背景深[2]。因此，抗原修復(fù)時間的掌握很重要。在本次試驗中，部分膜、漿標(biāo)記的抗原，微波修復(fù)要比高壓修復(fù)顯色效果滿意；高壓處理檢測細(xì)胞核抗原，較為滿意?？傊?，在日常工作中，利用本科的儀器設(shè)備和技術(shù)條件，選擇合適的抗原修復(fù)技術(shù)能夠改善免疫組化染色結(jié)果，我們要根據(jù)抗原的不同表達(dá)部位，選擇合適的抗原修復(fù)方法，提高免疫組化染色的效果，使反應(yīng)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

參考文獻(xiàn)：

篇8

【摘要】

目的 探討支配女性尿道括約肌神經(jīng)纖維的定位、定量及定性。方法 12例21周至40周的女性胎兒尿道，分別進(jìn)行石蠟包埋、膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(choline acetylcatransferase， CHAT)及神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y， NPY)免疫組化染色，并對其結(jié)果進(jìn)行半定量和定量分析。結(jié)果 從尿道內(nèi)口至外口，神經(jīng)肽Y陽性區(qū)域顯色范圍逐漸變小、強(qiáng)度減弱，膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶陽性區(qū)域主要位于尿道中三分之一，統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。結(jié)論 尿道括約肌的膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶及神經(jīng)肽Y免疫組化染色對理解參與控尿的尿道括約肌神經(jīng)支配提供了很有價值的幫助。

【關(guān)鍵詞】 控尿　神經(jīng)支配　尿道括約肌　免疫組織化學(xué)

Innervation of the female human fetus urethral sphincter by immunohistochemical studies

ABSTRACT: Objective To explore the location， quantity and nature of nerve fibers innervating the urethral sphincter. Methods Urethra of 12 female human fetuses between 21 and 40 weeks of gestation were treated by paraffin embedded with choline acetylcatransferase (CHAT) and neuropeptide Y(NPY) immunohistochemical staining. The staining results were analyzed quantitatively and semiquantitatively. Results From the urethra internal orifice to external orifice， the positive region of NPY became smaller and the density thinner; the positive region of CHAT was mainly located in the middle part of arethra， and there was statistically significant difference between them. Conclusion The immunohistochemical staining of choline acetylcatransferase and neuropeptide Y in the anatomical structures of the urethral sphincter provides a better understanding of the origin and nature of the innervation participating in urinary continence.

KEY WORDS: urinary continence; innervation; urethral sphincter; immunohistochemitry

女性尿道括約肌的內(nèi)在機(jī)制是由平滑肌和橫紋肌成分組成，它們各自接受相互獨(dú)立的神經(jīng)支配，這些機(jī)制目前尚不十分清楚[1]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為女性尿道括約肌是由來自神經(jīng)(軀體神經(jīng))和盆叢(自主神經(jīng))的神經(jīng)纖維共同支配[2]，但有關(guān)女性尿道括約肌及其支配神經(jīng)精確的定位、定量及定性方面的研究在國內(nèi)外報道較少。本實驗采用免疫組織化學(xué)染色及顯微圖像分析技術(shù)，對國人正常女性胎兒尿道的膽堿能及腎上腺素能神經(jīng)進(jìn)行定位、定量研究，從而探討它們在控尿方面的作用。

1 資料與方法

1.1 資料 選取12個正常女性胎兒，21-40周胎齡。測其冠臀長度為165-340mm，胎兒死亡1h內(nèi)完整取下尿道，尿道長度為9-15mm，另取成人新鮮大腦皮質(zhì)及腎上腺髓質(zhì)標(biāo)本做陽性對照，以上標(biāo)本均經(jīng)40g/L多聚甲醛固定后石蠟包埋。

我們應(yīng)用12個21-40周胎齡的女性胎兒尿道，是因為胎兒在妊娠15周時橫紋肌和平滑肌之間已顯示出明顯的區(qū)別[3]，這個階段的胎兒能夠在肉眼下解剖，括約肌的基本類型已經(jīng)建立[4]。

1.2 試劑和儀器 NPY多克隆抗體購自武漢博士德生物制藥有限公司，CHAT多克隆抗體及ABC檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Biogenex i6000全自動免疫組化染色系統(tǒng)由廣州新捷儀器有限公司生產(chǎn)，Quantimet970型顯微圖像分析儀產(chǎn)自英國劍橋儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 制作切片 將石蠟包埋的女性尿道標(biāo)本從內(nèi)口至外口做連續(xù)切片，片厚4μm，根據(jù)尿道長度平均分成8個截面，加之內(nèi)、外口，每個截面各取2張切片，分別做CHAT和NPY染色。

1.3.2 免疫組化染色 常規(guī)ABC法。切片脫蠟至80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，甲醇H2O2溶液中震蕩10min，置于枸櫞酸鹽緩沖液中，微波爐加熱12min，溫度在96℃左右，取出后自然冷卻(抗原修復(fù))。一抗分別為多克隆抗CHAT抗體及多克隆抗NPY抗體，濕盒內(nèi)孵育60min，二抗37℃ 30min，三抗37℃ 50min，DAB液顯色約8min。以成人大腦皮質(zhì)作CHAT的陽性對照，成人腎上腺髓質(zhì)作NPY的陽性對照，以TBS緩沖液代替一抗作陰性對照。一抗稀釋度為1∶200。

1.4 觀察指標(biāo) 采用半定量的方法根據(jù)免疫組化反應(yīng)呈色深淺及反應(yīng)顆粒多少，將酶活性反應(yīng)強(qiáng)度分為：(-)陰性，(+)陽性，()中等陽性，()強(qiáng)陽性，四個級度，將其用數(shù)字化表示分別為0-3，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

切片中CHAT及NPY陽性區(qū)域顯色為棕黃色至棕褐色，經(jīng)顯微攝像掃描后，將圖像輸入計算機(jī)，采用顯微圖像分析技術(shù)對計算機(jī)圖像進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)用±s表示，統(tǒng)計分析采用SPSS11.5軟件包，兩樣本均數(shù)差別應(yīng)用t檢驗，P

2 結(jié)果

觀察21-40周女性胎兒尿道的組成，可見胎兒尿道已具有三層基本結(jié)構(gòu)，發(fā)育良好：內(nèi)層為充滿皺折的黏膜，中間為黏膜下血管組織，外層為纖維肌肉鞘，由平滑肌和橫紋肌彈性組織組成。

2.1 腎上腺素能神經(jīng)的分布 NPY免疫組化染色分析提示，交感神經(jīng)介質(zhì)NPY免疫組化陽性纖維呈棕黃色，多位于血管壁中層平滑肌細(xì)胞間和神經(jīng)束中，在部分細(xì)小動脈壁可觀察到較粗大的陽性纖維。從尿道內(nèi)口至外口，NPY染色陽性區(qū)域(尿道平滑肌)逐漸變小，顏色變淺，至外口處幾乎完全消失(圖1)。將NPY免疫組化反應(yīng)強(qiáng)度“0-3”數(shù)字化后結(jié)果可見：近1/3與遠(yuǎn)1/3，中1/3與遠(yuǎn)1/3之間差異均有顯著性(P0.05，表1)。

圖1 12例女性胎兒尿道免疫組化染色分析(半定量)（略）

2.2 膽堿能神經(jīng)的分布 從CHAT免疫組化反應(yīng)染色分析可見女性胎兒尿道的中間1/3染色最強(qiáng)，近端1/3次之，遠(yuǎn)端1/3最弱。將CHAT免疫組化反應(yīng)強(qiáng)度“0-3”數(shù)字化后結(jié)果可見：遠(yuǎn)、中、近端三者差異均具有顯著性(P

表1 女性尿道NPY與CHAT免疫組化分析結(jié)果（略）

注：近1/3是指圖1中從內(nèi)口至2；中1/3是圖1中從3至5；遠(yuǎn)1/3是圖1中從6至8. 與遠(yuǎn)1/3比較*P

3 討論

關(guān)于此項研究內(nèi)容，國外的研究結(jié)果并不完全相符，甚至結(jié)論互相矛盾。女性尿道的復(fù)雜結(jié)構(gòu)組成了混合的神經(jīng)支配：自主神經(jīng)支配平滑肌，軀體神經(jīng)支配橫紋肌，自主神經(jīng)和感覺神經(jīng)支配黏膜和黏膜下組織。平滑肌和橫紋肌的連接也非常緊密，使得識別支配每種肌肉結(jié)構(gòu)的神經(jīng)纖維變得非常困難[5]。

女性尿道的尿道內(nèi)括約肌主要由交感、副交感神經(jīng)支配，尿道外括約肌主要由軀體神經(jīng)支配，其中交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)節(jié)前纖維為腎上腺素能神經(jīng)，副交感神經(jīng)節(jié)后纖維和軀體神經(jīng)為膽堿能神經(jīng)，其神經(jīng)纖維末稍釋放乙酰膽堿，作用于尿道外括約肌的N型膽堿能受體，引起該肌收縮，阻止尿液排出。

乙酰膽堿作為神經(jīng)遞質(zhì)，作用于靶受體發(fā)揮作用。膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶，是乙酰膽堿的合成酶，分布在膽堿能神經(jīng)元和纖維內(nèi)；腎上腺素能神經(jīng)釋放單胺類遞質(zhì)，故可以用顯示單胺類遞質(zhì)的方法來研究腎上腺素能神經(jīng)纖維的分布，神經(jīng)肽Y(NPY)是腎上腺素能神經(jīng)的標(biāo)志性神經(jīng)肽。應(yīng)用免疫組化染色來研究兩種神經(jīng)遞質(zhì)含量的多少，可說明神經(jīng)的興奮性高低，能充分反映神經(jīng)的功能， 是了解膽堿能、腎上腺素能神經(jīng)及其所支配器官的重要方法。

本實驗研究對尿道肌肉組織進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析顯示，在女性胎兒尿道的膀胱頸及近端三分之一，橫紋肌纖維相對較少，這與Borirakchanyavat等[6]的觀點相矛盾，他們發(fā)現(xiàn)胎兒的橫紋肌纖維出現(xiàn)在尿道的近端及中間三分之一處，認(rèn)為胎兒尿道的橫紋括約肌向近端延伸，這些纖維在后側(cè)表面是不完整的。

Stolzenburg等[7]認(rèn)為女性膀胱逼尿肌止于尿道內(nèi)口，與尿道無任何延續(xù)，尿道平滑肌的內(nèi)縱肌在近端三分之一開始變薄，遠(yuǎn)端三分之二逐漸消失，外縱肌多數(shù)在尿道內(nèi)口處消失，中間環(huán)形肌則在近端三分之一形成強(qiáng)大的環(huán)形平滑肌括約肌。本實驗經(jīng)過平滑肌標(biāo)志性抗體(NPY)免疫組織化學(xué)染色證實，該括約肌向遠(yuǎn)端尿道逐漸減少，開始減少處恰好為橫紋括約肌可檢測的部位。在中間三分之一尿道平滑肌和橫紋括約肌環(huán)繞整個尿道，平滑肌在尿道遠(yuǎn)端三分之一處消失。橫紋括約肌開始于尿道近端三分之一的遠(yuǎn)端，位于平滑肌的外側(cè)，向遠(yuǎn)端逐漸增厚。

本實驗研究還從CHAT及 NPY免疫組化染色分析中發(fā)現(xiàn)女性胎兒尿道的中間1/3染色最強(qiáng)，在女性胎兒尿道的平滑肌與橫紋括約肌之間并沒有明顯的界限，在尿道中三分之一處可清楚地看到平滑肌和橫紋肌纖維互相交錯分布，逐漸過渡，形成所謂的尿道括約肌復(fù)合體，是女性重要的控尿機(jī)制。Stein等[8]通過尿動力學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，女性患者全膀胱切除術(shù)后施行原位尿流改道，其控尿功能完全依靠橫紋括約肌，雖然尿道長度縮短了1.3cm，最大尿道壓下降12cm H2O，卻仍能有效地控制排尿。

Rother等[9]認(rèn)為女性尿道的平滑肌具有括約肌作用，主要在持續(xù)控尿過程中發(fā)揮作用，能夠控制尿道的關(guān)閉。橫紋括約肌可以隨意中斷排尿、對抗壓力性尿失禁，橫紋括約肌在中間三分之一處最厚并且環(huán)繞尿道，并可見到平滑肌纖維與橫紋肌纖維交錯移行。

本實驗應(yīng)用免疫組化方法研究了12例21-40周胎齡的正常女性胎兒尿道，結(jié)果表明膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶及神經(jīng)肽Y陽性區(qū)域主要位于尿道中三分之一，是膽堿能及腎上腺素能神經(jīng)遞質(zhì)集中的部位，在女性尿道的控尿功能中發(fā)揮著極其重要的作用。這些知識有助于提高膀胱切除手術(shù)后保留尿道的控尿功能質(zhì)量，也有助于理解控尿機(jī)制、對女性尿失禁進(jìn)行更有效的管理。

【參考文獻(xiàn)】

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篇9

【關(guān)鍵詞】 乳腺腫瘤;外科學(xué)；放射性核素成像；前哨淋巴結(jié);活組織檢查

1 對象和方法

1.1 對象 200005/200705我院完成乳腺癌前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node，SLN)活檢150例（均為女性），年齡29～71（平均47）歲. 其中T1期：58例，T2期：92例；絕經(jīng)前：90例，絕經(jīng)后：60例；腫物位于內(nèi)上象限28例，內(nèi)下象限6例，外上象限104例，外下象限12例；病理檢查證實：浸潤性導(dǎo)管癌134例，導(dǎo)管內(nèi)癌14例，髓樣癌2例.

1.2 方法 術(shù)前2～4 h于腫瘤周圍表面皮膚上均勻地選取4點，每點皮內(nèi)注射99m锝標(biāo)記的右旋糖酐（北京森科公司產(chǎn)品）0.25 mCi／0.25 mL，利用γ探測儀（美國泰科公司產(chǎn)品）測量注射點以外胸壁的放射性作為放射背景，而后進(jìn)行乳腺癌改良根治術(shù)或保留乳房手術(shù)，當(dāng)腋窩解剖到第一水平時，再用γ探測儀尋找放射性背景計數(shù)10倍以上的SLN，將SLN切除并單獨(dú)送檢. 對常規(guī)病理檢查SLN(-)的59例， 在SLN原蠟塊平面基礎(chǔ)上于100 μm，200 μm和300 μm三個層面上各切2張切片，分別行HE染色和免疫組化染色，所用抗體為角蛋白mAb AE1／3（美國Zymed公司產(chǎn)品）.

2 結(jié)果

150例患者中成功進(jìn)行SLN活檢144例，每例檢出SLN 1～4個不等，平均2.3個，成功率為96.0％，靈敏度為93.4％，假陰性率為6.6％，準(zhǔn)確性為97.2％，陽性結(jié)果預(yù)測值為100.0％，陰性結(jié)果預(yù)測值為95.4％，尤登指數(shù)(正確指數(shù))為0.934. 59例SLN(-)患者的切片同時在三個層面上行免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)了14例微小轉(zhuǎn)移；在兩個層面上發(fā)現(xiàn)11例微小轉(zhuǎn)移；在一個層面上發(fā)現(xiàn)7例微小轉(zhuǎn)移（圖1），而與免疫組化染色對應(yīng)的HE染色切片上均未發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移.

3 討論

SLN活檢是一項預(yù)測腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新技術(shù)，嚴(yán)格掌握適應(yīng)癥是活檢成功率的先決條件. 有文獻(xiàn)報道SLN活檢主要適用于T1-2N0M0患者［1］. 本組病例均為T1-2N0M0，這是本組成功率較高的基礎(chǔ). 其次，為了能夠準(zhǔn)確找到SLN，應(yīng)嚴(yán)格掌握注射同位素示蹤劑與手術(shù)的間隔時間，這與示蹤劑顆粒大小和同位素的半衰期有關(guān). 文獻(xiàn)報道間隔時間為2～4 h［2］. 本研究使用的示蹤劑是99m锝標(biāo)記的右旋糖酐，半衰期為6 h左右，于手術(shù)前2 h注射則更加清晰（一般在注射后半小時左右SLN即可初步顯示）. 本組中有2例患者由于間隔時間達(dá)5 h左右，因同位素衰變，探測SLN未獲成功.

圖1 乳腺癌前哨淋巴結(jié)免疫組化染色（AE1/3） ×400（略）

示蹤劑的注射部位主要有腫瘤周圍表面的皮內(nèi)和皮下、腫瘤周圍、腫瘤內(nèi)、乳暈下等［1，3］，由于皮膚的淺表淋巴網(wǎng)密度較大，因此選擇皮內(nèi)或皮下注射似乎更容易發(fā)現(xiàn)SLN［4-5］. 從本組病例看，在研究初期我們比較了皮內(nèi)、皮下和腫瘤內(nèi)注射的效果，發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)注射時，示蹤劑進(jìn)入淋巴流很快，SLN較易發(fā)現(xiàn)，而在皮下和腫瘤內(nèi)注射時，情況不夠理想. 因此我們認(rèn)為皮內(nèi)注射優(yōu)于皮下和腫瘤內(nèi)注射，在后續(xù)的研究中一直采用皮內(nèi)注射法.

要實現(xiàn)SLN預(yù)測腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的最終目標(biāo)，還要對SLN進(jìn)行詳細(xì)的病理學(xué)檢查以發(fā)現(xiàn)更小的轉(zhuǎn)移灶，避免漏診. Fortunato等［6］報道對于確診SLN(+)的病例，其中一半是通過連續(xù)切片和免疫組化方法發(fā)現(xiàn)的. 本研究也證實通過免疫組化染色可以提高轉(zhuǎn)移灶的檢出率，我們應(yīng)用免疫組化染色發(fā)現(xiàn)59例SLN(-)患者中的14例存在微小轉(zhuǎn)移，這些微小轉(zhuǎn)移在HE染色切片中未被發(fā)現(xiàn).

綜上所述，我們的研究證實了SLN的確可以準(zhǔn)確反映腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀況，為了成功進(jìn)行SLN活檢，需要嚴(yán)格掌握適應(yīng)癥、注射時間、劑量以及部位等，并對SLN進(jìn)行詳細(xì)的病理學(xué)檢查，才可使SLN活檢的成功率和假陰性率達(dá)到較為理想的水平.

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篇10

Application of ex vivo sentinel lymph node biopsy in the staging of colorectal cancer

【Abstract】 AIM: To explore whether ex vivo sentinel lymph node (SLN) biopsy can be easily applied in improving the accuracy of pathologic staging for colorectal cancer （CRC）. METHODS: The specimens from 26 patients (14 males， 12 females) with CRC were freshly (within 5 min) delivered to pathological examination and underwent ex vivo SLN biopsy. SLNs were identified as the 1st to 4th blue stained nodes after ex vivo submucosal peritumoral injection of 10 g/L isosulfan blue (IB) dye. The SLNs were sectioned and examined histologically by HE staining. Additional immunohistochemical staining for cytokeratins was performed when bluestained lymph nodes were negative by HE staining. RESULTS: Of the 26 specimens， SLNs were identified by ex vivo SLN biopsy in 23 (88.5%). In the 11 cases where the SLNs were negative in HE staining for micrometastases and in immunohistochemical staining for cytokeratins， all other nonSLNs in the specimens were also negative (0% false negative rate). The SLN was positive for micrometastases by HE staining in only 8 (30.7%) cases; the other 4 (15.3%) cases with negative nodes by HE staining were demonstrated positive for micrometastases through immunohistochemical staining for cytokeratins. CONCLUSION: Ex vivo SLN biopsy mapping is a feasible technique for the staging of CRC， especially in combination with immunohistochemical staining for cytokeratins， which offers reference for the assisted chemotherapy of CRC patients.

【Keywords】 colorectal neoplasms; in vivo; lymph node; micrometastases; immunohistochemistry

【摘要】 目的：探討體外法結(jié)直腸癌前哨淋巴結(jié)(SLN)定位活檢的可行性及其對腫瘤分期的影響. 方法：結(jié)直腸癌患者26 (男14，女12)例，年齡37～83歲，應(yīng)用10 g/L異硫藍(lán)(IB)染料于腫瘤離體5 min內(nèi)用體外定位的方法對其SLN進(jìn)行定位，藍(lán)染的第1~4個淋巴結(jié)為SLN. 常規(guī)HE染色藍(lán)染的SLN行組織病理學(xué)檢查;對常規(guī)檢查為陰性的SLN進(jìn)行抗細(xì)胞角蛋白免疫組織化學(xué)染色，檢測陽性染色的淋巴結(jié). 結(jié)果：體外SLN定位法共檢測出SLN者23例(88.5%， 23/26); 其中11例患者SLN微轉(zhuǎn)移灶常規(guī)HE染色及抗細(xì)胞角蛋白免疫組織化學(xué)染色檢測均為陰性，其根治性切除的標(biāo)本中非SLN的區(qū)域淋巴結(jié)亦均為陰性(假陰性率為0)；常規(guī)HE染色在8例患者SLN中檢測出微轉(zhuǎn)移灶(30.7%)，另4例患者為HE染色陰性而抗細(xì)胞角蛋白免疫組化染色證實存在微轉(zhuǎn)移灶(15.3%). 結(jié)論：體外結(jié)直腸癌SLN定位活檢術(shù)準(zhǔn)確性高，同時聯(lián)合應(yīng)用抗細(xì)胞角蛋白免疫組化染色可以提高腫瘤分期，為應(yīng)用輔助化療改善患者預(yù)后提供依據(jù).

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌；體外研究；淋巴結(jié)；免疫組化

0　引言

結(jié)直腸癌(colorectal cancer， CRC)隱匿性微轉(zhuǎn)移灶(micrometastasis， MM)的漏診而未行化療是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的因素［1-5］. 前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node， SLN)定位活檢技術(shù)可明顯提高淋巴結(jié)檢出數(shù)量［6-8］及MM的診斷率［4-8］. 我們探討體外SLN定位活檢技術(shù)的可行性及其臨床意義，特別是對于腫瘤分期的影響，為輔助化療，改善患者預(yù)后提供理論依據(jù).

1　對象和方法

1.1對象

200406/200603，經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科確診的CRC，有手術(shù)根治可能且無手術(shù)禁忌證患者26（男14，女12）例，年齡37～83平均（60. 2，中位60）歲. 其中結(jié)腸癌17例，直腸癌9例. 所有患者術(shù)前皆經(jīng)內(nèi)鏡檢查活檢確診.

1.2方法

所有患者行標(biāo)準(zhǔn)的根治術(shù)，聯(lián)合區(qū)域淋巴結(jié)清掃術(shù)，標(biāo)本移出5 min內(nèi)，沿腸管長軸于對系膜緣切開，于腫瘤周圍分4點黏膜下或漿膜下注射10 g/L異硫藍(lán)染料共2 mL，輕柔按摩注射點約2～5 min，以促進(jìn)淋巴回流［7-9］. 追蹤辨認(rèn)藍(lán)染的第1~4個淋巴結(jié)為SLN （圖1），標(biāo)本用100 g/L甲醛固定. 首先常規(guī)HE染色檢查上述甲醛固定的各淋巴結(jié)及SLN，確定SLN與區(qū)域淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況. 對常規(guī)病理學(xué)檢查為陰性的SLN進(jìn)行免疫組化法染色：鏈霉親和素生物素免疫過氧化物酶方法（SP法）. MM按國際抗癌聯(lián)盟的推薦定義為單個轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)φ≤2 mm.

2　結(jié)果

在26例患者中，右半結(jié)腸癌9 例，左半結(jié)腸癌7例，橫結(jié)腸癌1例，直腸癌9例. 17例結(jié)腸癌中，均成功定位活檢到SLN，成功率100%; 9例直腸癌中， 6例獲得成功，成功率66.7%; 3例不成功者為低位直腸癌，行腹會陰聯(lián)合切除術(shù). 根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC） TNM進(jìn)行分期. 0期2例，I期6例，II期8例，III期8例，IV期2例. 體外SLN定位法共成功檢測出SLN者23例（88.5%，23/26); 其中11例SLN常規(guī)HE染色及抗細(xì)胞角蛋白免疫組化染色檢測均陰性患者，其根治性切除的標(biāo)本中非SLN的區(qū)域淋巴結(jié)亦均為陰性 (0%假陰性率)；常規(guī)HE染色在8例患者SLN中檢測出微轉(zhuǎn)移灶(30.7%)，另4例患者為HE染色陰性而抗細(xì)胞角蛋白免疫組化染色證實存在微轉(zhuǎn)移灶(15.3%，圖2).

3　討論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是CRC最重要的獨(dú)立預(yù)后因素，與分期密切相關(guān). 為準(zhǔn)確分期，常規(guī)檢查標(biāo)本內(nèi)所有的淋巴結(jié)是不切實際的. SLN示蹤技術(shù)則有望通過病理學(xué)家集中對有限的幾枚(1~4)淋巴結(jié)進(jìn)行詳細(xì)檢查、分析，準(zhǔn)確評估區(qū)域SLN狀態(tài)而明確分期. 大約有30%經(jīng)常規(guī)病理學(xué)診斷為I，II期的CRC患者最后可能出現(xiàn)全身性轉(zhuǎn)移. 這些患者的淋巴結(jié)內(nèi)存在微轉(zhuǎn)移，常規(guī)病理學(xué)檢查由于未能檢查這一淋巴結(jié)或是切片數(shù)量不夠等原因而未能發(fā)現(xiàn)［2-6］. 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者其SLN 的檢出陽性率為83%［3］，根據(jù)SLN對區(qū)域淋巴結(jié)狀況預(yù)測的敏感性為88%～100%［3-7］， 因此，對SLN進(jìn)行定位檢測可以更準(zhǔn)確地反映區(qū)域淋巴結(jié)狀況，從而使CRC的術(shù)后病理分期更準(zhǔn)確，有利于評估預(yù)后，制訂合理的治療方案，提高治愈率.

既往關(guān)于CRC患者SLN的檢測，大多數(shù)學(xué)者多采用手術(shù)中異硫藍(lán)于腫瘤周圍漿膜下注射，曾被認(rèn)為是CRC的金標(biāo)準(zhǔn)［10］. 但新近的研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)中檢測SLN的方法可能延長手術(shù)時間，增加轉(zhuǎn)移幾率，有些患者會對染料出現(xiàn)過敏反應(yīng)等一系列副作用［11］. 因此該方法客觀有效及安全性也被提出了質(zhì)疑. 為了克服手術(shù)中檢測SLN的弊端，Wood等［4］提出了體外法SLN定位活檢. 術(shù)后30 min內(nèi)或5～10 min內(nèi)，切開腸管于腫瘤周圍分4點黏膜下注射異硫藍(lán)共2 mL或腫瘤周圍漿膜下注射1～2 mL，輕柔按摩注射點約2～5 min，以促進(jìn)淋巴流動［7-9］. Smith等［9］認(rèn)為體外法假陰性較高，與區(qū)域淋巴結(jié)的一致性較低，我們的研究結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌中，SLN定位活檢成功率和預(yù)測區(qū)域轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性很高，敏感性100%，假陰性率為0; 而直腸癌中，成功率和準(zhǔn)確性則較低，假陰性率高達(dá)33.3%. 提示，SLN定位活檢在直腸癌中并未顯示出很好的應(yīng)用價值; 這表明SLN定位活檢在直腸癌中存在一定的困難和復(fù)雜性. Saha等［2］報道失敗的1例也是直腸癌. 這可能與直腸癌的特殊解剖部位和較為復(fù)雜的淋巴引流有關(guān). 體外SLN定位活檢技術(shù)臨床意義主要體現(xiàn)在，發(fā)現(xiàn)那些隱蔽的MM，改善分期. 體外法可在不增加手術(shù)時間、不增加轉(zhuǎn)移風(fēng)險、無副作用的前提下提高病理檢出率.

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