導(dǎo)語(yǔ)：百日咳毒素病毒重組研究論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要目的：百日咳毒素既是百日咳桿菌的主要毒性因子，又是重要的保護(hù)性抗原，其S1亞單位具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性和免疫保護(hù)性決定簇。為高效表達(dá)前構(gòu)建的一個(gè)喪失酶活性但仍保持保護(hù)決定簇的S1變異子，開展了本研究。方法：通過添加人流感病毒血凝素基因信號(hào)序列或嵌膜序列的方法，對(duì)天然和變異S1亞單位基因片段作了遺傳學(xué)修飾。然后使用重組桿狀病毒技術(shù)使這些S1亞單位在昆蟲細(xì)胞和昆蟲幼蟲中實(shí)現(xiàn)了高水平表達(dá)。結(jié)果：這些重組S1的表達(dá)水平介于每萬(wàn)個(gè)昆蟲卵細(xì)胞0.18～1.93μg或每只昆蟲幼蟲0.46～4.98mg之間。天然信號(hào)肽和HA信號(hào)肽均可完整表達(dá)，但后者的切割效率(61%～81%)比前者(16%～19%)更高。所有帶信號(hào)肽的S1亞單位均呈異質(zhì)性表達(dá)(雙帶)。結(jié)論：重組S1亞單位的表達(dá)是高效和正確的，表達(dá)的異質(zhì)性是由于信號(hào)肽切割不完全的緣故。

關(guān)鍵詞百日咳毒素S1亞單位重組桿狀病毒表達(dá)

ExpressionofgeneticallyalteredS1subunitsofpertussistoxininrecombinantbaculoviruses

YUKang-Zhen.

HarbinVeterinaryResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150001

BurnetteWN,KaslowHR,MarVLetal.

InternationalLaboratoryofMolecularBiologyforTropicalDiseaseAgents,SchoolofVeterinaryMedicine,UniversityofCalifornia,Davis,CA95616

AbstractObjective:Pertusistoxin(PT)isbothamajorvirulencefactorofbordetellapertussisandanimportantimmunoprotectiveantigenagainstwhoopingcough.TheS1subunitofPTpossessesADP-ribosyltransferaseactivityaswellasepitopesthatinduceprotectiveimmunity.TheaimofthepresentresearchistoproducetheS1mutantabundantlywhichisinlackoftheenzymeactivityconstructedpreviously.Methods:HavemodifiedbothnativeandmutantS1subunit-encodingDNAfragmentsbytheadditionofthenativeS1signalsequenceorthesignalsequenceofhumaninfluenzavirushemagglutinin(HA)gene.ThemodifiedS1subunitswereabundantlyexpressedbyrecombinantautographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirusesininsectcellsandlarva.Results:Theexpressionlevelsrangedfrom0.18～1.93μg/104spodopterafrugiperdaovariancells,or0.46～4.98mg/larvaofspodopteraexigua.ThenativeandHAsignalsequenceswerebothexpressedintact,althoughtheHAsignalwasprocessedmoreefficiently(61%～81%)tnanthenativeone(16%～19%).AllS1withsignalsproducedtwobands.Conclusion:AllrecombinantS1subunitswereproducedcorrectlytohighlevels.TheheterologousexpressionofrS1proteinsistheresultofincompletesignalcleavage.

KeywordsPertussistoxin(PT)S1subunitRecombinantbaculovirus(rBV)Expression

百日咳是一種嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，有時(shí)伴有神經(jīng)癥狀。其病原菌——百日咳桿菌能產(chǎn)生十多種毒性因子，其中的百日咳毒素(PT)是一種外毒素，由5種不同亞單位組成A-B結(jié)構(gòu)。A結(jié)構(gòu)即S1亞單位，分子量為26kD，具有鳥嘌呤結(jié)合蛋白(G蛋白)特異性核糖轉(zhuǎn)移酶活性，而G蛋白與腺苷酸環(huán)化酶抑制信號(hào)的傳導(dǎo)有關(guān)。由于PT可與多種細(xì)胞結(jié)合，從而抑制G蛋白介導(dǎo)的多種信號(hào)傳遞系統(tǒng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。傳統(tǒng)百日咳疫苗的毒副作用與S1亞單位的酶活性有關(guān)。近年研究均致力于S1亞單位的遺傳學(xué)脫毒。Burnette等應(yīng)用定點(diǎn)突變術(shù)構(gòu)建了一種S1變異子(Arg9→Lys，或R9→K)［1］，其酶活性降至陰性對(duì)照水平，但仍保持其保護(hù)性抗原決定簇，這為安全有效的新型百日咳疫苗的研制打下了基礎(chǔ)。重組桿狀病毒(rBV)載體以其高效、真實(shí)地表達(dá)外源基因的特性而被廣泛應(yīng)用。本研究中，我們對(duì)天然及變異S1亞單位編碼基因進(jìn)行了一系列分子修飾，并用rBV載體系統(tǒng)高水平地表達(dá)了這些重組S1亞單位，為其免疫學(xué)特性評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株、病毒及細(xì)胞系大腸桿菌DH5α株用于質(zhì)粒擴(kuò)增；野生型桿狀病毒Autographacalifornia核多角體病毒株(wtAcNPV)用于同源重組；昆蟲(Spodopterafrugiperda)卵細(xì)胞系Sf9和Sf21用于rBV增殖和蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.2主要試劑工具酶及DNA標(biāo)記試劑盒(BoehringerMannheim)；桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pVL1392和pVL1393(Invitrogen)；PT及S1亞單位(ListBiologicalLaboratory公司)；兔抗PT高免血清的制備見文獻(xiàn)［2］；抗S1亞單位單克隆抗體1B7由Sato博士惠贈(zèng)［3］；堿性磷酸酶標(biāo)記的多克隆羊抗兔或鼠IgG抗體(ZymedLaboratory公司)；蛋白定量試劑盒(Sigma)。

1.3S1亞單位編碼基因的修飾在編碼天然S1亞單位DN段的克隆和定點(diǎn)突變的基礎(chǔ)上［1，2］，使用pUC18及pUC19載體構(gòu)建了遺傳學(xué)修飾的S1DNA克隆(圖1)。流感病毒血凝素(HA)信號(hào)序列(77bp)和嵌膜序列為人工合成［4，5］。應(yīng)用雙脫氧序列分析技術(shù)確證這些S1DN段序列的正確性。

圖1S1亞單位編碼基因的分子修飾

Fig.1ModificationofS1DNAmolecules

1.4桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建上述8種pUC重組質(zhì)粒(pUCS1)分離相應(yīng)的S1DN段，分將其亞克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1392或pVL1393(視克隆方向而定)中。原位雜交和酶切分析篩選和鑒定重組pVL質(zhì)粒(pVLS1)。

1.5DNA轉(zhuǎn)染及rBV純化采用線性AcNPV轉(zhuǎn)染技術(shù)(Invitrogen公司)。3輪蝕斑篩選和純化后將斑點(diǎn)雜交和免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)雙陽(yáng)性的病毒蝕斑克隆在Sf9細(xì)胞中增殖。

1.6原位及斑點(diǎn)雜交采用隨機(jī)引物標(biāo)記技術(shù)將S1/2DN段經(jīng)32P標(biāo)記后用作探針，檢測(cè)重組菌落的rBVs中的S1DNA。菌落的原位雜交按常規(guī)方法進(jìn)行。斑點(diǎn)雜交時(shí)先將rBV感染的細(xì)胞用1mol/LNaOH裂解后加到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行雜交。

1.7SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、免疫印跡(Westernblot)和免疫斑點(diǎn)(Immunoblot)試驗(yàn)

1.7.1SDS-PAGE感染樣品(Sf21細(xì)胞、昆蟲幼蟲或血淋巴)經(jīng)SDS-PAGE分離，分離膠濃度為12%。以純化的PT作陽(yáng)性對(duì)照，wtAcNPV感染的昆蟲幼蟲或表達(dá)牛水皰性口炎病毒核蛋白(VSV-N)的rBV感染的Sf21細(xì)胞用作陰性對(duì)照［6］。

1.7.2免疫印跡參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。以兔抗PT高免血清、抗S1亞單位的單克隆抗體(1B7)和堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔(或鼠)IgG用于免疫學(xué)檢測(cè)。

1.7.3免疫斑點(diǎn)方法與免疫印跡相似，不同：1.待測(cè)樣品經(jīng)超聲裂解后溶于Tris緩沖鹽溶液(TBS，pH7.4)中，然后直接點(diǎn)到PVDF(polyvinylidenedifluoride)膜上；2.純化的S1亞單位作rS1定量的標(biāo)準(zhǔn)。PVDF膜用輕礦物油透明后進(jìn)行定量掃描分析。

1.8rS1表達(dá)水平的測(cè)定

1.8.1rS1表達(dá)動(dòng)力學(xué)分析用10個(gè)感染量(m.o.i.)的rBV感染Sf21細(xì)胞，在不同時(shí)間收集這些細(xì)胞，進(jìn)行免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)，分析rS1亞單位的表達(dá)動(dòng)力學(xué)，以據(jù)此在最佳時(shí)間收集表達(dá)的S1蛋白。此外，用5×105個(gè)蝕斑形成單位(pfu)的rBV感染昆蟲幼蟲(Spodopteraexigua，體重0.65～0.71g)，感染后第4天收集幼蟲及其血淋巴。

1.8.2rS1表達(dá)量的測(cè)定rBV感染的昆蟲細(xì)胞或昆蟲幼蟲懸液總蛋白用蛋白定量試劑盒(Lowry法)測(cè)定。對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，根據(jù)rS1蛋白在總蛋白中的百分比和總蛋白濃度計(jì)算出每種rS1亞單位的表達(dá)量。除使用該物理定量法外，還同時(shí)應(yīng)用免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(免疫定量法)測(cè)定了每種rS1亞單位的表達(dá)量。

1.9rS1亞單位信號(hào)肽處理的分析將rS1蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用考馬斯亮藍(lán)染色。將rS1條帶逐一切下，加到ABI477氣相微量序列測(cè)定儀中作N端氨基酸序列分析(10個(gè)循環(huán))。同時(shí)，rS1蛋白經(jīng)免疫印跡分析并用輕礦物油對(duì)印跡膜透明處理后，對(duì)特異條帶體積進(jìn)行定量掃描。微量序列分析證實(shí)低分子量條帶缺乏信號(hào)肽以及高分子量條帶含有信號(hào)肽后，信號(hào)肽的切割效率按低分子量條帶體積與兩條帶總體積之比計(jì)算。

2結(jié)果

2.1rBVs的構(gòu)建將修飾后的S1DNA分子從相應(yīng)pUCS1質(zhì)粒中切下并分別亞克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中。然后通過重組pVLS1DNA和wtAcNPVDNA在Sf9細(xì)胞中的同源重組獲得rBV。蝕斑純化后，利用免疫斑點(diǎn)或免疫印跡試驗(yàn)篩選出了可表達(dá)8種不同rS1蛋白的rBV。

2.2rS1亞單位的表達(dá)8種不同rBV在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)動(dòng)力學(xué)表明，病毒感染后72h，rS1蛋白的表達(dá)水平最高。由于昆蟲幼蟲多在感染后5～6d死亡，故收獲rS1蛋白的最佳時(shí)間為接毒后第4天。應(yīng)用SDS-PAGE和免疫印跡(圖2、3)以及免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)rS1蛋白在昆蟲細(xì)胞和幼蟲中的表達(dá)情況作了分析，并測(cè)定了每種rS1亞單位的表現(xiàn)分子量(MW)，見表1。結(jié)果表明，缺少信號(hào)肽的rS1呈現(xiàn)單一條帶，其表現(xiàn)MW與理論值一致，而帶信號(hào)肽的rS1亞單位均呈雙帶，并其表現(xiàn)MW與理論MW有細(xì)微差別。帶天然信號(hào)序列的rS1表達(dá)水平最高，帶流感病毒信號(hào)序列的rS1次之，而無(wú)信號(hào)序列或帶流感病毒信號(hào)和嵌膜序列的rS1表達(dá)量最低。免疫定量法與物理定量法測(cè)得的表達(dá)量有明顯差異，這表明天然和重組S1亞單位的免疫反應(yīng)性可能不同。

2.3rS1亞單位信號(hào)序列的處理每種rS1條帶氨基端的微量序列分析表明有4種不同的N-末端存在(表2)，即：天然信號(hào)肽(Met-Arg-Cys-Thr-Arh-Ala-Ile-Arg-Gln-Thr)，天然S1亞單位(Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Arg-Tyr)，變異S1亞單位(Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Lys-Tyr)，流感病毒信號(hào)肽(Met-Lys-Ala-Lys-Leu-Leu-Val-Leu-Leu-Tyr)。這表明細(xì)菌信號(hào)肽和流感病毒信號(hào)肽的處理是正確的，但不完全。在該真核表達(dá)系統(tǒng)中，流感病毒信號(hào)肽較天然細(xì)菌信號(hào)肽的切割更有效。

圖2rS1亞單位在Sf21昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的免疫印跡分析

Fig.2WesternblotanalysisofinsectcellsinfectedwithrBVs

圖3rS1亞單位在昆蟲幼蟲中表達(dá)的免疫印跡分析

Fig.3WesternblotanalysisofinsectinfectedwithrBVs表1rS1亞單位在昆蟲細(xì)胞和幼蟲中的表達(dá)情況

Tab.1ExpressionofrS1subunitsininsectcellsandlarva

rS1subunitPredicted

MW(kD)Apparent

MW(kD)%age1)Expressionlevel1)Expressionlevel2)

Sf21Larvaμg/104Sf21mg/larvang/104Sf21μg/larva

129.72814.70.9748.7

26.025

1-429.728

26.02525.320.81.934.9857.366.9

226.0264.11.90.240.4632.956.9

2-426.0265.94.40.361.1432.1147.6

327.827

26.02515.51.039.1

3-427.827

26.02512.613.10.833.0061.2214.1

3A29.928

28.1263.10.1849.6

3A-429.928

28.1263.01.90.180.4075.3100.1

Note:1)eachsamplewasanalyzedbySDS-PAGEandgel-scanning,thenmeasuredbyLowrymethod;2)eachsamplewasanalyzedbyimmunoblotandtheresultwasreadbyUVmaxkineticmicroplatereader

表2rS1亞單位的信號(hào)肽處理與N-末端序列分析

Tab.2N-terminusofrS1subunitsandsignalprocessing

rS1subunit

N-terminus(band)

%cleavage1)

Sf21Larva

1Nativesignalsequence(upper)

NativeS1subunit(lower)19

1-4Nativesignalsequence(upper)

MutantS1subunit(lower)1716

2NativeS1subunit(single)

2-4MutantS1subunit(single)

3Influenzavirussignalsequence(upper)

NativeS1subunit(lower)63

3-4Influenzavirussignalsequence(upper)

MutantS1subunit(lower)6961

3AInfluenzavirussignalsequence(upper)

NativeS1subunit(lower)65

3A-4Influenzavirussignalsequence(upper)

MutantS1subunit(lower)7381

Note:1)signal-cleavingefficiencywascalculatedbasedonthe3-dimensionvolumeofeachlowerbandandthetotalvolumeofeachrS1subunit(twobands),whichwereobtainedbydensitometerizationoftheWesternblotpatternofeachrS1protein

3討論

PT是百日咳疫苗主要保護(hù)性免疫原。傳統(tǒng)百日咳疫苗有較大毒副作用，這可能與PT的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)。曾使用多種化學(xué)試劑對(duì)PT進(jìn)行脫毒，但化學(xué)脫毒法要么不能去除全部酶活性，要么對(duì)分子的修飾作用太大，以致破壞了其免疫原性。Burnette等通過單一氨基酸替換(R9→K)技術(shù)構(gòu)建了一種S1變異子［1］，該變異子的酶活性消失，但仍保持其保護(hù)性決定簇，這為百日咳疫苗的研制開辟了新途徑。鑒于此我們對(duì)天然及變異S1亞單位進(jìn)行了一系列分子修飾，并實(shí)現(xiàn)了這些亞單位在rBV系統(tǒng)中的高水平表達(dá)。所有的rS1蛋白均可被抗PT的抗血清和抗S1亞單位的單克隆抗體識(shí)別。

Matsuura等應(yīng)用rBV載體表達(dá)了一種非成熟的S1亞單位(PTS1，相當(dāng)于本研究中的rS1/1)［8］。在分子量、信號(hào)肽處理等方面，本研究與其相似，但表達(dá)水平是他們的20～130倍。本研究中所有帶信號(hào)肽的rS1/1均為雙帶，表明MW與理論值相比有細(xì)微差別。微量蛋白序列分析證實(shí)2種信號(hào)序列的表達(dá)和切割都是正確的，但均不完全。計(jì)算機(jī)輔助分析(Wisconsin軟件，結(jié)果未示)表明，rS1分子上沒有潛在的糖基化位點(diǎn)。因此，rS1蛋白的異源性表達(dá)是信號(hào)肽不完全切割的結(jié)果，而表明MW偏移并不意味著信號(hào)肽處理不正確或rS1分子的糖基化。除凝膠掃描(即物理定量法)外，我們還使用免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(免疫定量法，表1)和ELISA(結(jié)果未示)對(duì)rS1的表達(dá)量進(jìn)行了分析。后兩種免疫方法測(cè)定結(jié)果很相似，但同凝膠掃描結(jié)果顯著不同。免疫定量法測(cè)得的表達(dá)量明顯低于物理定量法的結(jié)果，且rS1/1和rS1/1-4的相對(duì)含量明顯偏低，而免疫印跡分析(圖2、3)與物理定量法的結(jié)果更相符，因此認(rèn)為rS1亞單位的免疫反應(yīng)性可能受信號(hào)肽和樣品處理方式(變性與否)的影響。成熟S1亞單位的N端(1～17或1～18氨基酸殘基)有一個(gè)顯性決定簇［1］，rS1/1和rS1/1-4上攜帶的天然信號(hào)序列(34個(gè)殘基)可能遮蓋此位點(diǎn)。在免疫斑點(diǎn)和ELISA試驗(yàn)中，樣品未經(jīng)變性處理，因此rS1蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)仍然存在。在免疫印跡分析中，樣品經(jīng)變性處理，故這種遮蓋效應(yīng)連同高級(jí)結(jié)構(gòu)將不復(fù)存在。rS1亞單位的生物學(xué)特性及免疫學(xué)特性將通過進(jìn)一步的研究進(jìn)行評(píng)價(jià)。

百日咳毒素S1亞單位的分子修飾及在重組桿狀病毒中的表達(dá)本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金資助(No.39580022)

作者單位：于康震(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱150001)

BurnetteWNKaslowHRMarVLAhmadSYilmaTD(美國(guó)加利福尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，Davis,CA95616)

BurnetteWNMarVL美國(guó)Amgen公司,ThousandOaks,CA91320

KaslowHR美國(guó)南加利福尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院,LosAngeles,CA90033

作者簡(jiǎn)介：于康震，男，37歲，研究員，博士生導(dǎo)師；

YilmaTD,男，53歲，教授，博士生導(dǎo)師

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